專利名稱：公牛分離精子的冷凍保存方法
技術領域：
本發明屬生物工程技術領域，特別涉及低溫生物學的方法。
背景技術：
哺乳動物個體的性別在精子和卵子結合受精時由不同的染色體重新分配和組合所決定。性別的遺傳基礎是依賴于精子細胞的表型，若攜帶X染色體的精子與卵子結合，受精卵的染色體組合為XX，后代則發育為雌性；若攜帶Y染色體的精子與卵子結合，受精卵的染色體組合為XY，后代則發育為雄性。用分離的X或Y精子給母畜人工授精或與卵母細胞體外受精，在受精之前便可預知后代的的性別，從而達到性別控制的目的。以奶牛為例，奶牛農場主希望從其優質高產的核心群中繁殖出更多的小母牛，以增加或更新其奶牛群，通過用X精子授精就可以達到這一目的。同樣，肉用牛農場主則希望通過用Y精子授精繁殖出更多的小公牛，因為牛的生長速度和肉的品質與性別有關，公牛生長速度比母牛快，而且閹公牛肉的價格較高。在品種繁育方面，如果通過性別控制產下后代的準確率在90％以上，繁育畜群數量和性狀改良的速度將比無性別控制的大大提高，從而可以節省大量的時間、精力和費用。
目前，流式細胞儀法分離公牛精子的關鍵技術已經解決，并且已經通過人工授精和體外受精等技術產下了預知性別的動物后代。然而，這項成果要想得到大范圍的產業化推廣，所分離的精子必須能夠長期保存和長途運輸，在任何偏遠的牛場或牧區都可以方便應用，精子的低溫冷凍保存技術就是輔助推廣分離精子的關鍵。本發明的目的是通過冷凍保存分離精子，實現在-196℃的液氮中長期保存或遠距離運輸，使得分離精子能廣泛應用于當中。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種適用于公牛分離X和Y精子的冷凍保存方法，保證經過性別分離的精子活力能夠滿足人工授精和體外受精的同時，實現分離精子在-196℃的液氮中長期保存或遠距離運輸，并適用于商業化生產和推廣。
本發明以如下技術方案解決上述技術問題a)收集精子按照目前已經成熟的流式細胞儀分離精子技術對采集的精子進行染色分離，接收分離精子的試管預先加入1～5ml的A液，接收分離精子后成為含有X或Y精子的溶液，其最終含有2％～6％的卵黃。
為使分離下來的精子保持活力，A液中含有2.0～3.0％的TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、1.0～2.0％的單水檸檬酸、0.8～1.2％果糖和15.0～25.0％的卵黃。
b)低溫平衡將步驟a)最終得到的分離精液移到5℃平衡，平衡時間2～6小時；c)離心濃縮離心機預冷到5℃，將步驟b)中平衡后的分離精液在3000～5000轉/分鐘(288～800g)速度下離心20分鐘；離心結束后，棄去上清，留下100～200微升精子沉淀；將同一頭公牛4小時內分離得到各個批次的精子沉淀匯合；d)甘油平衡預先5℃恒溫B液，按照體積11與步驟c)得到的精液沉淀混合，搖勻并平衡10～15分鐘。
為使冷凍解凍后的分離精子保持活力，B液中含有3.0～3.5％的TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、1.0～2.0％的單水檸檬酸、1.2～1.4％果糖、15.0～25.0％的卵黃和10.0～14.0％甘油。
e)細管分裝在0.25ml的細管上標記好公牛號、日期、精子類型(X或Y)，移入5℃恒溫預冷；將步驟d)得到的精液分裝到0.25ml細管中并封口；f)程序降溫準備好程序冷凍儀，注入液氮并將起始溫度設定在5℃，移入步驟e)所獲的精液細管。開啟程序降溫冷凍，以6℃/分鐘的速度降溫到-10℃，恒溫停留2分鐘，然后再以6℃/分鐘的速度降溫，達到-80℃終止時，將細管投入液氮長期保存。
本發明特點本發明的主要特點在于(1)本發明方法采用TRIS作為緩沖溶液體系，主要包括A液和B液兩部分，二者相輔相成，特別添加了有利于保持分離精子活力的成分，專門適用于分離公牛精子的冷凍保存。
(2)以往通過常規的方法冷凍新鮮采集精液時，均是用含有卵黃的稀釋液先將精液進行稀釋，而后再進行冷凍；在本發明中，用流式細胞儀分離X或Y精子時，精子受到高度稀釋，因而必須先離心濃縮精液，然后再加入含甘油的B液繼續冷凍。
具體實施例方式
實施例一冷凍荷斯坦公牛的分離精子a)收集精子按常規流式細胞儀法分離荷斯坦公牛精子，接收分離精子的試管預先加入2ml的含20％卵黃的A液，接受分離精子后總體積為10ml，最終含有4.0％的卵黃；A液的配方為
加去離子水至100ml。
b)低溫平衡將步驟a)得到的溶液移到5℃平衡，平衡時間4小時；c)離心濃縮平衡結束后，步驟b)得到的溶液在5℃、3000轉/分鐘速度下離心20分鐘；離心結束后棄去上清，留下100～200微升的沉淀，混勻；d)甘油平衡5℃恒溫的B液按照體積1∶1與步驟c)得到的精子沉淀混合，平衡15分鐘；B液的配方
加去離子水至100ml。
e).細管分裝在0.25ml的細管上標記好公牛號、日期、精子類型(X或Y)，移入5℃恒溫；將步驟d)得到的精液分裝到0.25ml細管中并封口；f)程序降溫用程序冷凍儀將步驟e)所獲的細管精液降溫，達到-80℃終止時，將細管投入液氮長期保存。
本實施例中，對來自廣西大學牧場的荷斯坦公牛J03001、PT01003在連續的兩個月中分別進行了11次分離冷凍實驗，解凍后具有直線運動的精子活率分別為0.41±0.026和0.39±0.019。
實施例二冷凍水牛的分離精子a)收集精子按常規流式細胞儀法分離水牛精子，接收分離精子的試管預先加入1.0ml的含22％卵黃的A液，接受分離精子后總體積為10ml，最終含有2.2％的卵黃；A液的配方為
加去離子水至100ml。
b)低溫平衡將步驟a)得到的溶液移到5℃平衡，平衡時間4小時；c)離心濃縮平衡結束后，步驟b)得到的溶液在5℃、3000轉/分鐘速度下離心20分鐘；離心結束后棄去上清，留下100～200微升的沉淀，混勻；d)甘油平衡5℃恒溫的B液按照體積1∶1與步驟c)得到的精子沉淀混合，平衡15分鐘；B液的配方
加去離子水至100ml。
e)細管分裝在0.25ml的細管上標記好公牛號、日期、精子類型(X或Y)，移入5℃恒溫；將步驟d)得到的精液分裝到0.25ml細管中并封口；f)程序降溫用程序冷凍儀將步驟e)所獲的細管精液降溫，達到-80℃終止時，將細管投入液氮長期保存。
本實施例中，對來自廣西畜禽品種改良站的摩拉水牛ML811和尼里水牛NL440的精液在連續的兩個月中分別進行了7次和9次分離冷凍實驗，解凍后具有直線運動的精子活率分別為0.35±0.035和0.36±0.022。
權利要求
1.一種適用于公牛分離X和Y精子的冷凍保存方法，保證經過冷凍保存的分離精子活力能夠滿足人工授精和體外受精的同時，實現分離精子在-196℃的液氮中長期保存或遠距離運輸，并適用于商業化生產和推廣，其特征是a)精子收集按照目前已經成熟的流式細胞儀分離X和Y精子技術對采集的精子進行染色分離，接收分離精子的試管預先加入1～5ml的A液，接收分離精子后成為含有X或Y精子的溶液，其最終含有2％～6％的卵黃。b)低溫平衡將步驟a)最終得到的分離精液移到5℃平衡，平衡時間2～6小時；c)離心濃縮步驟b)中平衡后的分離精液在5℃、3000～5000轉/分鐘(288～800g)速度下離心20分鐘；離心結束后，棄去上清，留下100～200微升精子沉淀；將同一頭公牛4小時內分離得到各個批次的精子沉淀匯合；d)甘油平衡預先5℃恒溫B液，按照體積1∶1與步驟c)得到的精液沉淀混合，搖勻并平衡10～15分鐘。e)細管分裝在0.25ml的細管上標記好公牛號、日期、精子類型(X或Y)，移入5℃恒溫預冷；將步驟d)得到的精液分裝到0.25ml細管中并封口；f)程序降溫準備好程序冷凍儀，注入液氮并將起始溫度設定在5℃，移入步驟e)所獲的精液細管。開啟程序降溫冷凍，以6℃/分鐘的速度降溫到-10℃，恒溫停留2分鐘，然后再以6℃/分鐘的速度降溫，達到-80℃終止時，將細管投入液氮長期保存。
2.如權利要求1所述的公牛分離精子的冷凍保存方法，其特征是冷凍溶液系統包括A液和B液兩部分組成。
3.如權利要求1所述的公牛分離精子的冷凍保存方法，其特征是接收分離精子的試管或者離心管預先裝有1～5ml的A液；
4.如權利要求1或2所述的公牛分離精子的冷凍保存方法，其特征是A液中含有TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、單水檸檬酸、果糖和卵黃。
5.如權利要求1或4所述的公牛分離精子的冷凍保存方法，其特征是A液中TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、單水檸檬酸、果糖和卵黃的含量分別為2.0～3.0％、1.0～2.0％、0.8～1.2％和15.0～25.0％。
6.如權利要求1所述的公牛分離精子的冷凍保存方法，其特征是分離精液在5℃、3000～5000轉/分鐘(288～800g)速度下離心濃縮20分鐘，離心結束后棄去上清，留下100～200微升精子沉淀；
7.如權利要求1或2所述的公牛分離精子的冷凍保存方法，其特征是B液中含有TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、單水檸檬酸、果糖、卵黃和甘油；
8.如權利要求1或7所述的公牛分離精子的冷凍保存方法，其特征是B液中的TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、單水檸檬酸、果糖、卵黃和甘油的含量分別為3.0～3.5％、1.0～2.0％、1.2～1.4％、15.0～25.0％和10.0～14.0％。
全文摘要
本發明屬生物工程技術領域，提供了一種適用于公牛分離X和Y精子的冷凍保存方法。發明采用TRIS作為緩沖溶液體系，主要包括A液和B液兩部分，特別例添加了有利于保持分離精子活力的成分，專門適用于分離公牛精子的冷凍保存。通過對分離精子接收、離心濃縮、平衡以及程序降溫冷凍等一系過程，在保證分離精子活力能夠滿足人工授精和體外受精的同時，實現分離精子在－196℃的液氮中長期保存或遠距離運輸，并適用于商業化生產和推廣。
文檔編號F25D3/10GK1732983SQ200510097788
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月29日 優先權日2005年8月29日
發明者盧克煥, 陸陽清, 張明, 胡傳活 申請人:廣西大學