一種達氏鱘精子冷凍保存液及制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種達氏鱘精子冷凍保存液及制備方法和應用，本發明的達氏鱘精子冷凍保存液包括蔗糖，海藻糖，三羥基氨基甲烷，氯化鉀，還原型谷胱甘肽，甲醇。本發明所述的達氏鱘精子冷凍保存液，成分簡單，冷凍保存成本低。其中，還原型谷胱甘肽的加入，起到了很好的抗氧化作用，對精子質膜起到很好的保護作用，同時還降低了DNA分子損傷。海藻糖的加入，則具有防止蛋白質變性，有效保護精子的作用。利用本發明的精子冷凍保存液，解凍后精子活力高于70%，受精率達45%。
【專利說明】一種達氏鱘精子冷凍保存液及制備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于低溫冷凍生物學領域，具體涉及一種達氏鱘精液冷凍保存液，還涉及 一種達氏鱘精液冷凍保存液的制備方法，還涉及一種達氏鱘精液冷凍保存液的應用，該精 液冷凍保存液適合于達氏鱘。

【背景技術】
[0002] 魚類精液超低溫冷凍保存技術在魚類遺傳育種研究、魚類養殖及種質資源保護等 方面具有重要的應用價值。魚類精液超低溫冷凍保存技術的研究是從上世紀50年代開始 的，國內外學者在淡水和海水經濟魚類以及瀕危魚類的精液冷凍保存技術方面做了大量的 工作。鱘魚類精液冷凍保存技術的研究起步較晚，最初主要是俄羅斯鱘精液冷凍保存。隨 后，匙吻鱘、西伯利亞鱘、閃光鱘等其它鱘魚的精液超低溫保存技術也得到了廣泛的研究。 達氏鱘為我國國家一級保護動物，被世界自然保護聯盟（IUCN)列為極危物種，瀕危野生動 植物國際貿易公約（CITES)附錄II保護動物。通過精液冷凍保存技術，將其現有種群的精 液，長期、有效地保存起來，即建立達氏鱘冷凍精子庫，以后用解凍精子與卵子進行人工授 精，就可以將達氏鱘的基因資源完全保存下來，為該物種種質資源保護開辟了一條新的途 徑。
[0003] 保存精子的方法很多，主要有低溫、常溫和冷凍三種。低溫和常溫用于短期保存精 液，而冷凍或超低溫冷凍則可以長期保存精液。目前，國內外廣泛采用冷凍技術保存精液， 常用的抗凍劑有干冰（液態二氧化碳，沸點一 79°c )和液氮（沸點一 196°C )等，用液氮保 存精液，精子的代謝停滯，精子處于假死狀態，但其結構卻能保持完整。因此，如何使精子不 受影響地以完整結構達到超低溫狀態，就成為精液超低溫保存技術的一項關鍵問題。
[0004] 冷凍保存液的配制是魚類精液冷凍保存中的關鍵一環。冷凍保存液是由一定組成 成分和配比濃度的稀釋液以及一定濃度的抗凍劑組成的，冷凍保存液的適合與否直接影響 保存的效果。魚的種類不同，精子的生理特性也有差異，因而對稀釋液和抗凍劑的組成成份 和濃度具有不同的要求。魚類精液冷凍保存稀釋液成份很多，主要有鹽類（如NaHC0 3、NaCl、 KC1、KHC03、檸檬酸鈉等）、糖類（如葡萄糖、果糖、蔗糖等）、脂類（主要是磷脂）和蛋白質 (如卵黃、牛奶、小牛血清等）、以及其他添加劑（如甘氨酸、抗生素）等。對于鱘魚的精子 來說，稀釋液的滲透壓要等于或高于精子的滲透壓，這樣精子被稀釋后不會被激活。稀釋液 的滲透壓等同于各組成成分離子濃度之和。這里我們還要注意K離子對鱘魚精子的抑制作 用，無論稀釋液的滲透壓有多低，只要K離子的濃度高于2mM，精子的運動會被完全抑制，所 以K離子在鱘魚精子稀釋液中濃度不可太高，否則會造成不可逆抑制。而糖類等大分子類 溶質除了起到調節滲透壓的作用外，還具有提供精子能量的作用。脂類和蛋白質以及其他 添加劑主要對精子某個部位或某個方面起到保護的作用。常用的抗凍劑有甘油、二甲亞砜、 乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甲醇等。這類抗凍劑多屬低分子中性物質，在溶液中易結合水分 子，發生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化了水的結晶過程，達到保護精子的目的。
[0005] -般情況下，精子經冷凍保存后其活力和受精能力均會顯著下降，其中部分原因 取決于膜結構的完整性遭到破壞。大量研究證明精子在冷凍保存過程中會產生氧的自由基 或者改變抗氧化酶的活性，從而引起膜脂的過氧化反應、導致膜脂結構和精子滲透壓的改 變，或直接攻擊精子DNA堿基等，最終導致精子生存能力的降低。
[0006] 因此，在冷凍保存液的配制過程中，針對某物種的精液，我們不僅要考慮離子及其 濃度、糖類組成及濃度以及緩沖液的pH值等，還要思考能否通過添加劑來改善冷凍保存的 條件，如抗氧化劑等，從而提1?冷凍保存的效果。本發明旨在達氏鮮精子冷凍保存研究尚存 空白的情況下，發明一種達氏鱘精子冷凍保存液能夠有效的長期保存達氏鱘的精子，并可 極大的保護精子免受冰晶及氧化等損傷。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供了一種達氏鱘精子冷凍保存液，該保存液由蔗糖，海藻糖， 三羥甲基氨基甲烷，氯化鉀，還原型谷胱甘肽及甲醇按照一定配比混合而成，在達氏鱘精子 超低溫冷凍保存過程中，可極大的保護精子免受冰晶及氧化等損傷。
[0008] 本發明的另一個目的在于提供了一種達氏鱘精子冷凍保存液的制備方法，方法簡 單，易行，適于大規模生產，該方法適合配制各種體積的稀釋液，可確保所配制稀釋液中個 組分濃度的準確性。
[0009] 本發明的最后一個目的在于提供了一種達氏鱘精子冷凍保存液在達氏鱘精子冷 凍保存中的應用，該應用包括利用本發明的達氏鱘精子冷凍保存液進行達氏鱘的精子冷凍 保存，還包括利用本發明的配方制備達氏鱘精子冷凍保存液。
[0010] 為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：
[0011] 一種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含：
[0012] 庶糖 30-90mmol 海藻糖 15-45mm〇[ 二羥鴨氣卿烷 2040圓01 Si 化鉀 0.5-2mmol
[0013] 還原型騰"Hltfc 3.2-9.8 mmol if If： 0.08-0.2L
[0014] 其余為去離子水
[0015] 加入甲醇之前的溶液滲透壓為69. 2-188. 8m0sM，冷凍保存液的pH為7. 4-8. 6。
[0016] 一種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含：
[0017] 蘼糖 40-S0mmol 海藻糖 2CMI0mmol 三醫黨mmwm 22.5-37,5mmol M化卿 0J5-i.5mmol a原 fmitii·歌 5-8mmoI Ψ靜 0.085-0.15L
[0018] 其余為去離子水
[0019] 加入甲醇之前的溶液滲透壓為89-168. 5m0sM，冷凍保存液的pH為7. 6-8. 4。
[0020] -種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含：
[0021] 蔗糖 50-70mmoi Wii糖 2S-35mmof 五?￥基氧基￥垸 25-35rnmol 氣化鉀 0.8-1.3 mmol 還原壞谷 ttlitt 5S-?5mmol f If 0,09-0.131
[0022] 其余為去離子水
[0023] 加入甲醇之前的溶液滲透壓為107. 1-150. ImOsM，冷凍保存液的pH為7. 8-8. 2。
[0024] -種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含：
[0025] ft!;H 55-65mmoi 賴_ 27.5^32.5mmoi 二羥丨1-?-堪 ?-堪 <tf 烷 2S-35mmol 氣化鉀 0.9-1.Irnmoi 還hTK 6-7mmoI 甲 If 0.095-0.11L
[0026] 其余為去離子水
[0027] 加入甲醇之前的溶液滲透壓為117. 8-139. 2m0sM，冷凍保存液的pH為7. 9-8. 1。
[0028] -種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液（最佳配比）中包含：
[0029] 蔗糠 60mmo! 海藻糖 30mmol -；Κ>ιΙ!%Μ%Ψ? 30mmol 籯化娜 Immoi 還原m聽甘肽 6B4mmol _ O.IL
[0030] 其余為去離子水
[0031] 加入甲醇之前的溶液滲透壓為128. 4m0sM，冷凍保存液的pH為8. 0。
[0032] -種達氏鱘精子冷凍保存液的制備方法，其步驟如下：
[0033] 1)根據總精液量計算需要冷凍保存液的總體積。
[0034] 2)根據冷凍保存液的總體積和各組分的配方濃度以及各組分貯備液的濃度，計算 各組分貯備液的量取體積，計算公式為：各組分量取體積=各組分的配方濃度X冷凍保存 液總體積+各組分貯備液的濃度，用微量取樣器從各組分貯備液中量取相應的體積并混 勻，最后加蒸餾水至冷凍保存液的終體積。
[0035] 3)從上述溶液中量取出冷凍保存液總體積X甲醇濃度的體積溶液，再加入等量 的甲醇混勻配制成最終的精子冷凍保存液。配制好的冷凍保存液應立刻用于精子的超低溫 冷凍保存。
[0036] -種達氏鱘精子冷凍保存液在達氏鱘精子冷凍保存中的應用，其應用過程如下：
[0037] 1)、精液采集與檢測
[0038] 待達氏鱘繁殖季節，對雄性親魚進行B超檢查性腺發育狀況，對達到性成熟的親 魚進行人工催產，采集精液時，用干毛巾擦凈親魚生殖孔周圍，擠壓腹部，收集無糞便和雜 物的干凈精液于塑料袋中，充氧后密封并于4°C存放。利用顯微鏡檢測精子活力，成活率在 90%以上的精液用于冷凍保存。
[0039] 2)、精液的稀釋、分裝和冷凍
[0040] 取l〇〇ml精液，加入100ml新鮮配制的冷凍保存液，稀釋比為1:1。精液與冷凍液 混勻后，立刻分裝至2ml冷凍管中。同時程序降溫儀開啟，預冷至0°C。
[0041] 程序降溫：從 0°C 開始，3°C /min 降至 _5°C，5°C /min 降至-15°C ;10°C /min 降 至-25°C ;20°C /min降至-80°C，在_80°C平衡5min后，直接將冷凍管從程序降溫儀中取出， 立即放入液氮（_196°C )中保存。
[0042] 3)、解凍和精子活力檢測
[0043] 將裝有精子的冷凍管從液氮中取出，立即浸入40°C水浴中，一邊搖動一邊解凍，至 完全融化為止。
[0044] 在載波片上滴加30 μ 1蒸餾水，然后用針尖蘸取少許精液，迅速涂在蒸餾水中，并 利用顯微鏡觀察精子激活后的運動狀況，精子活力達70%以上，運動時間持續3-4min。
[0045] 4)、解凍后精子用于授精
[0046] 將采集的成熟卵置于潔凈、干燥的容器中，再將解凍后的精液加入卵中（精子與 卵子的比值約為3 X 105)，用手輕輕攪動，使精卵充分混勻，然后加水，激活精子使其與卵子 受精，輕輕攪拌后，倒掉上方的污水，將卵移入孵化器中孵化。
[0047] 與現有技術相比，本發明具有以下優點：
[0048] 1、實現了達氏鱘精子冷凍保存和應用，該方法可以應用于人工繁殖中解決精液量 不足的問題，又可以實現達氏鱘種質資源永久保存的目的。
[0049] 2、精子冷凍保存液成分簡單，冷凍保存成本低。
[0050] 3、冷凍保存液中加入了還原型谷胱甘肽，起到了很好的抗氧化作用，對精子質膜 起到很好的保護作用，同時還降低了 DNA分子損傷。
[0051] 4、冷凍保存液中海藻糖的加入，具有防止蛋白質變性，有效保護精子的作用。
[0052] 5、解凍后精子活力高于70% (新鮮采集精子活力高于90%)，受精率達45% (新 鮮采集精子受精率為60-70% )。

【具體實施方式】
[0053] 本發明實施例中的技術方案，如未特別說明，均為常規技術，所用試劑如未特別說 明，均購自生化商店。
[0054] 實施例 1-9 :
[0055] 蔗糖、海藻糖、三羥甲基氨基甲烷、氯化鉀、還原型谷胱甘肽、無水乙醇、以及去離 子水。以上試劑原料均購置于Sigma公司。
[0056] 儲存液的配制：
[0057] 1) 1M濃度的蔗糖貯備液：蔗糖分子量342,配制體積100ml的溶液需要蔗糖的重量 為34. 2g，將稱取的蔗糖放入燒杯中，先加入60ml的蒸餾水，用玻璃棒攪拌使其充分溶解， 再將溶液定容至l〇〇ml。
[0058] 2) 1M濃度的海藻糖貯備液：海藻糖分子量342,配制體積10ml的溶液需要海藻糖 的重量為3. 42g，將稱取的海藻糖放入10ml的離心管中，先加入6ml的蒸餾水，旋緊離心管 的蓋子，上下搖動離心管使海藻糖充分的溶解，再將溶液定容至l〇ml。
[0059] 3)0. 1M濃度的三羥甲基氨基甲烷貯備液：三羥甲基氨基甲烷分子量121，配制體 積l〇〇ml的溶液需要三羥甲基氨基甲烷的重量為1. 21g，將稱取的三羥甲基氨基甲烷放入 燒杯中，先加入80ml的蒸餾水，用玻璃棒攪拌使其充分溶解，再用鹽酸溶液調節pH，范圍為 7. 4-8. 6,最后將溶液定容至100ml。
[0060] 4) 0. 1M濃度的氯化鉀貯備液：氯化鉀分子量74. 55,配制體積50ml的溶液需要氯 化鉀的重量為0. 373g，將稱取的氯化鉀放入50ml的離心管中，先加入40ml的蒸餾水，旋緊 離心管的蓋子，上下搖動離心管使氯化鉀充分的溶解，再將溶液定容至50ml。
[0061] 5)0.32M濃度還原型谷胱甘肽貯備液：還原型谷胱甘肽分子量307.32,配制體 積lml的溶液需要還原型谷胱甘肽的重量為0. lg，將稱取的還原型谷胱甘肽放入lml的離 心管中，先加入〇. 5ml的蒸餾水，蓋緊離心管，上下搖動離心管使還原型谷胱甘肽充分的溶 解，再將溶液定容至lml。
[0062] 上述貯備液均須配制新鮮的溶液，可暫時放置4°C冰箱保存。
[0063] 一種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含：
[0064]

【權利要求】
1. 一種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含： 鹿糖 30_90mmol 海藻糖 15_45mmol 三輕甲基氨基甲燒 20-40mmol 氯化鉀 0. 5_2mmol 還原型谷胱甘肽 3. 2-9. 8mmol 甲醇 0. 08-0. 2L 其余為去離子水 加入甲醇之前的溶液滲透壓為69. 2-188. 8mOsM，冷凍保存液的pH為7. 4-8. 6。
2. -種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含： 鹿糖 40_80mmol 海藻糖 20_40mmol 三羥甲基氨基甲烷 22. 5-37. 5mmol 氯化鉀 0· 75-1. 5mmol 還原型谷胱甘肽 5-8mmol 甲醇 0· 085-0. 15L 其余為去離子水 加入甲醇之前的溶液滲透壓為89-168. 5mOsM，冷凍保存液的pH為7. 6-8. 4。
3. -種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含： 鹿糖 50_70mmol 海藻糖 25_35mmol 三輕甲基氨基甲燒 25-35mmol 氯化鉀 0. 8-1. 3mmol 還原型谷胱甘肽 5. 5-7. 5mmol 甲醇 0· 09-0. 13L 其余為去離子水 加入甲醇之前的溶液滲透壓為107. 1-150. ImOsM，冷凍保存液的pH為7. 8-8. 2。
4. 一種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含： 鹿糖 55-65mmol 海藻糖 27. 5-32. 5_〇1 三輕甲基氨基甲燒 25-35mmol 氯化鉀 0. 9-1. lmmol 還原型谷胱甘肽 6_7mmol 甲醇 0· 095-0. 11L 其余為去離子水 加入甲醇之前的溶液滲透壓為117. 8-139. 2m0sM，冷凍保存液的pH為7. 9-8. 1。
5. -種達氏鱘精子冷凍保存液，每升冷凍保存液中包含： 鹿糖 60mmol 海藻糖 30mmol 三輕甲基氨基甲燒 30mmol 氯化鉀 lmmol 還原型谷胱甘肽 6. 4mmol 甲醇 0. 1L 其余為去離子水 加入甲醇之前的溶液滲透壓為128. 4m0sM，冷凍保存液的pH為8. 0。
6. 權利要求1所述的一種達氏鱘精子冷凍保存液的制備方法，其步驟如下： 1) 根據總精液量計算需要冷凍保存液的總體積； 2) 根據冷凍保存液的總體積和各組分的配方濃度以及各組分貯備液的濃度，計算各組 分貯備液的量取體積，計算公式為：各組分量取體積=各組分的配方濃度X冷凍保存液總 體積+各組分貯備液的濃度，用微量取樣器從各組分貯備液中量取相應的體積并混勻，最 后加蒸餾水至冷凍保存液的終體積； 3) 從上述溶液中量取出冷凍保存液總體積X甲醇濃度的體積溶液，再加入等量的甲 醇混勻配制成最終的精子冷凍保存液。
7. 權利要求1所述的一種達氏鱘精子冷凍保存液在達氏鱘精子冷凍保存中的應用。
8. 根據權利要求7所述的應用，其應用過程具體如下： 1) 、精液米集與檢測 待達氏鱘繁殖季節，對雄性親魚進行B超檢查性腺發育狀況，對達到性成熟的親魚進 行人工催產，采集精液時，用干毛巾擦凈親魚生殖孔周圍，擠壓腹部，收集無糞便和雜物的 干凈精液于塑料袋中，充氧后密封并于4°C存放； 利用顯微鏡檢測精子活力，成活率在90%以上的精液用于冷凍保存； 2) 、精液的稀釋、分裝和冷凍 取100ml精液，加入100ml新鮮配制的冷凍保存液，稀釋比為1:1 ;精液與冷凍液混勻 后，立刻分裝至2ml冷凍管中； 同時程序降溫儀開啟，預冷至〇°C ; 程序降溫：從 〇°C開始，3°C /min 降至 _5°C，5°C /min 降至-15°C;10°C /min 降至-25°C; 20°C/min降至-80°C，在_80°C平衡5min后，直接將冷凍管從程序降溫儀中取出，立即放入 液氣中保存； 3) 、解凍和精子活力檢測 將裝有精子的冷凍管從液氮中取出，立即浸入40°C水浴中，一邊搖動一邊解凍，至完全 融化為止； 在載波片上滴加3〇μ1蒸餾水，然后用針尖蘸取少許精液，迅速涂在蒸餾水中，并利用 顯微鏡觀察精子激活后的運動狀況，精子活力達70%以上，運動時間持續3-4min ; 4) 、解凍后精子用于授精 將采集的成熟卵置于潔凈、干燥的容器中，再將解凍后的精液加入卵中，精子與卵子的 比值約為3X 105,用手輕輕攪動，使精卵充分混勻，然后加水，激活精子使其與卵子受精，輕 輕攪拌后，倒掉上方的污水，將卵移入孵化器中孵化。
【文檔編號】A01N1/02GK104054697SQ201410318701
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月7日 優先權日:2014年7月7日
【發明者】厲萍, 危起偉, 席萌丹, 柳凌, 郭威, 喬新美 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所