一種黃顙魚精子超低溫冷凍保存方法
【技術領域】
[0001]本發明屬海洋生物技術領域，具體地說是一種黃顙魚精子超低溫冷凍保存方法。
【背景技術】
[0002]黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco (Richardson)]又名黃嘎，黃姑子，黃臘丁等，是我國重要的小型底層經濟魚類。在我國各大水系均有分布，特別是在長江中下游的湖泊廣為分布。黃顙魚肉質細嫩，味道鮮美，營養豐富，無肌間刺，可食部分大，不易死亡，可活鮮上市，已越來越受到廣大消費者的喜愛和歡迎。為滿足人民對優質魚類的需求，黃顙魚雄魚生長速度明顯快于雌魚，因此生產中廣大養殖戶更喜歡養殖全雄苗種。近年來，由于黃顙全雄魚養殖規模的不斷擴大，企業往往通過雌核發育和激素誘等技術獲得超雄魚，作為種源，從而培育全雄苗種。因此如果通過超低溫冷冷凍保存技術獎超雄魚的精液進行保存，對于優化全雄苗種生產技術工藝，節約資源，提高苗種成活率具有重要意義。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于提供一種黃顙魚精子超低溫冷凍保存方法。
[0004]為實現上述目的，本發明采用技術方案為:
[0005]—種黃顙魚精子超低溫冷凍保存方法，取發育成熟黃顙雄魚的精巢，反復清洗研磨，用稀釋液稀釋過濾，收集精液；精液再與抗凍液混合，梯度降溫、冷凍，投入液氮中進行長期保存；
[0006]其中，稀釋液的配置:90ml蒸饋水中加入NaCl 3.5g，定容至100ml ；
[0007]12%甲醇抗凍液配置:取70ml稀釋液，加入12ml甲醇，加入3.5g葡萄糖，然后定容至100ml。
[0008]所述液氮長期保存的精液，將存有精液的麥管直接放入35_37°C水浴中解凍5_7s，然后置于室溫條件下完全融化，自來水激活，獲得高質量的精子。
[0009]選取性腺發育成熟的黃顙魚雄魚，取兩側性腺置于培養皿中，將性腺周圍的血管摘除，并用蒸餾水沖洗至無血污，冰浴條件下研磨精巢5-10min，研磨過程中加入同等體積稀釋液。
[0010]將研磨后的精巢組織液，通過400目的篩絹過濾，去掉組織殘渣，收集濾液，檢測精子活力，活力高于85%，用于后續實驗。
[0011 ] 將收集到的精液加入至其5-10倍體積的抗凍液，置于0-4 V冰箱中，孵育10-15min ;將孵育后的精液，分裝至0.5ml麥管中，然后以_8 — -10 °C /min的降溫速率至-80°C直接投入到液氮(-196Γ )，分裝保存。
[0012]上述，將分裝保存于液氮中的黃顙魚凍精進行解凍，具體方法為:將存有精液的麥管直接放入35-37°C水浴中解凍5-7s，然后置于室溫(18-20°C )條件下完全融化，淡水激活。
[0013]本發明具有如下優點:
[0014]本發明所述黃顙魚精子在體內呈樹枝狀，無法通過擠壓腹部的方法采集到精液，因此該發明采用解剖取性腺，然后將性腺置于研缽種研缽，使精子釋放到稀釋液中，然后收集精液進彳丁保存，具體:
[0015]1.本發明冷凍保存過程中采用高濃度的甲醇作抗凍劑，保持較好滲透性的同時又降低了毒性；
[0016]2.本發明抗凍液中加入了葡萄糖3.5g/L作為細胞外部保護劑，對精子的質膜起到很好的保護作用；
[0017]3.本發明冷凍保存過程中采用0.5ml麥管，由于黃顙魚對低溫比較敏感，較小體積的麥管可減少保存容積對凍精質量的影響；
[0018]4.同時精子與抗凍液的比例為1:10，對于精液量較小的黃顙魚，小量的分裝更有利于精液的高效利用，生產上具有重要應用價值。
[0019]5.本發明冷凍保存過程分段降溫時，采用以_8 —-10°C/min速度降溫，適宜的速度是精子可以充分脫水同時又可使冷凍精子安全度過“危險溫度區”，然后投入液氮，整個保存過程不超過15min ;冷凍保存降溫程序精密，重復性穩定性好，凍精解凍后復蘇率高，激活后運動率高于80%，與鮮精活力狀態差異不顯著；
[0020]6.本發明冷凍精子從液氮中取出后，采用35-37°C解凍，可使精子快速度過重結晶區，同時又避免了局部溫度過高導致的損傷。
【具體實施方式】
[0021]本發明將發育成熟黃顙雄魚，解剖取性腺，剔除精巢上的血管網，蒸餾水沖洗、研磨、過濾，收集獲得黃顙精液，然后與抗凍液混合，通過程序降溫法，冷凍，投入液氮中進行長期保存，待用時通過水浴解凍、復蘇，獲得高質量的精子。本發明的黃顙精子超低溫冷凍、保存、解凍方法對于黃顙人工授精、全雄苗種培育以及種質保資源存等方面有著重要意義。
[0022]實施例1
[0023]1)2015年4月份于武漢運回青島黃顙雄性親魚40尾，在實驗室進行暫養，選取性腺發育成熟的黃顙魚雄魚4尾，解剖，用鑷子摘取兩側性腺置于培養皿中，將性腺周圍的血管摘除，并用蒸餾水沖洗至無血污。冰浴條件下研磨精巢5min，研磨過程中加4ml稀釋液；
[0024]2)磨后的精巢組織液，通過400目的篩絹過濾，并用稀釋液沖洗3遍，收集濾液，檢測精子活力，活力高于85% ；
[0025]3)將收集到的(8ml)精液加入40ml的抗凍液(用稀釋液配置的12%的甲醇)，置于0-4°C冰箱中，孵育lOmin ；
[0026]4)將孵育后的精液，分裝至0.5ml麥管中，共計24管，置于程序降溫儀，然后以-8 — -10°C /min降溫至-80°C直接投入到液氮(_196°C )，分裝保存。
[0027]5) 1周后將分裝保存于液氮中的黃顙魚凍精進行解凍，具體方法為:將存有精液的麥管直接放入35°C水浴中解凍7s，然后置于室溫(18-20°C)條件下完全融化，淡水激活，相對復活率高于80%。
[0028]其中，稀釋液的配置:90ml蒸饋水中加入NaCl 3.5g，定容至100ml ；
[0029]12%甲醇抗凍液配置:取70ml稀釋液，加入12ml甲醇，加入3.5g葡萄糖，然后定容至100ml。
[0030]實施例2
[0031]1)2015年5月選取性腺發育成熟的黃顙魚雄魚6尾，解剖，用鑷子摘取兩側性腺置于培養皿中，將性腺周圍的血管摘除，并用蒸餾水沖洗至無血污。冰浴條件下研磨精巢lOmin，研磨過程中加入5ml稀釋液；
[0032]2)的精巢組織液，通過400目的篩絹過濾，并用稀釋液沖洗3遍，收集濾液，檢測精子活力，活力高于85% ；
[0033]3)集到的精液加入50ml的抗凍液，置于0_4°C冰箱中，孵育lOmin ;
[0034]4)育后的精液，分裝至0.5ml麥管中，共計30管，置于程序降溫儀，然后以-8 — -10°C /min降溫至-80°C直接投入到液氮(_196°C )，分裝保存。
[0035]5)后將分裝保存于液氮中的黃顙魚凍精進行解凍，具體方法為:將存有精液的麥管直接放入35°C水浴中解凍7s，然后置于室溫(18-20°C)條件下完全融化，淡水激活，相對復活率高于80%。
【主權項】
1.一種黃顙魚精子超低溫溫冷凍保存方法，其特征在于:取發育成熟黃顙雄魚的精巢，反復清洗研磨，用稀釋液稀釋過濾，收集精液；精液再與抗凍液混合，梯度降溫、冷凍，投入液氮中進行長期保存； 其中，稀釋液的配置:90ml蒸饋水中加入NaCl 3.5g，定容至100ml ； 12%甲醇抗凍液配置:取70ml稀釋液，加入12ml甲醇，加入3.5g葡萄糖，然后定容至100ml。2.按權利要求1所述的黃顙魚精子超低溫溫冷凍保存方法，其特征在于:所述液氮長期保存的精液，將存有精液的麥管直接放入35-37°C水浴中解凍5-7s，然后置于室溫條件下完全融化，自來水激活，獲得高質量的精子。3.按權利要求1所述的黃顙魚精子超低溫溫冷凍保存方法，其特征在于:選取性腺發育成熟的黃顙魚雄魚，取兩側性腺將性腺周圍的血管摘除，并用蒸餾水沖洗至無血污，冰浴條件下研磨精巢5-10min，研磨過程中加入同等體積稀釋液。4.按權利要求1所述的黃顙魚精子超低溫溫冷凍保存方法，其特征在于:將研磨后的精巢組織液，通過400目的篩絹過濾，去掉組織殘渣，收集濾液，檢測精子活力，活力高于85%，用于后續實驗。5.按權利要求1所述的黃顙魚精子超低溫溫冷凍保存方法，其特征在于:將收集到的精液加入至其5-10倍體積的抗凍液，置于0-4°C冰箱中，孵育10-15min ;將孵育后的精液，分裝至0.5ml麥管中，然后以-8 — -10°C /min的降溫速率至_80°C直接投入到液氮(_196°C )，分裝保存。
【專利摘要】本發明屬海洋生物技術領域，具體地說是一種黃顙魚精子超低溫冷凍保存方法。取發育成熟黃顙雄魚的精巢，反復清洗研磨，用稀釋液稀釋過濾，收集精液；精液再與抗凍液混合，梯度降溫、冷凍，投入液氮中進行長期保存；其中，稀釋液的配置：90ml蒸餾水中加入NaCl？3.5g，定容至100ml；12％甲醇抗凍液配置：取70ml稀釋液，加入12ml甲醇，加入3.5g葡萄糖，然后定容至100ml。本發明的黃顙精子超低溫冷凍、保存、解凍方法對于黃顙人工授精、全雄苗種培育以及種質保資源存等方面有著重要意義。
【IPC分類】A01N1/02
【公開號】CN105360109
【申請號】CN201510869462
【發明人】劉清華, 徐世宏, 李軍, 王學穎
【申請人】中國科學院海洋研究所
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月2日