精子冷凍保護劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及輔助生殖技術精子冷凍保存領域，特別是涉及一種精子冷凍保護劑及 其制備方法。
【背景技術】
[0002] 人類精子的冷凍保存對于人類生殖健康有著重要的作用，而在冷凍過程中添加的 冷凍保護劑為影響冷凍保存效果的關鍵因素之一。
[0003] 目前各精子庫和生殖中心所采用的精子冷凍保護劑多采用卵黃、甘油、蔗糖配方， 由于必須添加卵黃，導致冷凍保護劑的成分相當復雜，存在動物源性致病菌感染的風險。
【發明內容】
[0004] 基于此，有必要針對上述問題，提供一種精子冷凍保護劑及其制備方法，本發明精 子冷凍保護劑不含卵黃，不存在動物源性致病菌感染的風險。
[0005] 為實現上述技術目的，具體技術方案如下：
[0006] 一種精子冷凍保護劑，每125mL所述精子冷凍保護劑含有下列成分：
[0007] 鹿糖16±0· lg，碳酸氫鈉0· 5±0.05g，甘油36±0.5mL，人血白蛋白25±0· 2mL，五 蒸水余量。
[0008] 在其中一些實施例中，每125mL所述精子冷凍保護劑含有下列成分：
[0009] 蔗糖16g，碳酸氫鈉0.5g，甘油36mL，人血白蛋白25mL，五蒸水余量。
[0010] 在其中一些實施例中，所述人血白蛋白為20g/100mL人血白蛋白。
[0011] 本發明還提供一種上述精子冷凍保護劑的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)按照上述成分配比稱取所述蔗糖、碳酸氫鈉、甘油、人血白蛋白以及五蒸水備 用；
[0013] (2)依次放入所述五蒸水、蔗糖、甘油、碳酸氫鈉，攪拌均勻；
[0014] (3)過濾，在濾過液中加入所述人血白蛋白，攪拌；
[0015] (4)分裝，冷凍保存。
[0016] 在其中一些實施例中，所述人血白蛋白為20g/100mL人血白蛋白。
[0017] 在其中一些實施例中，所述步驟(2)中的攪拌時間為14~16分鐘。
[0018] 在其中一些實施例中，所述步驟(3)中的攪拌時間為14~16分鐘。
[0019] 在其中一些實施例中，所述步驟(4)中的冷凍保存溫度為-74~_76°C。
[0020] 在其中一些實施例中，所述過濾為用孔徑為0.45um的濾芯過濾。
[0021] 本發明相較現有技術的優點以及有益效果為：
[0022] 本發明所采用的新型的精子冷凍保護劑配方，不含卵黃，僅包含蔗糖、碳酸氫鈉、 甘油、20% (g/mL)人血白蛋白等幾種常用的且化學成分明確的試劑，不存在動物源性致病 菌感染的風險，而且所得到的冷凍效果與現有配方相仿，精子冷凍復蘇率平均值在75%~ 80% 〇
[0023] 本發明制備方法簡單，整個制備過程可在1小時內完成，簡單高效。
【具體實施方式】
[0024] 實施例中所用原料均為市售常規原料。
[0025] 以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0026]本發明實施例中所用的20% (g/mL)人血白蛋白購自瑞士杰特貝林生物制品有限 公司。
[0027] 實施例1
[0028] -種精子冷凍保護劑，其配方成分及含量如下：
[0029] 鹿糖16g，碳酸氫鈉0.5g，甘油36mL，20% (g/mL)人血白蛋白25mL，五蒸水60mL。
[0030]上述精子冷凍保護劑的制備方法包括以下步驟：
[0031 ] 1、電子天平稱取鹿糖16g，碳酸氫鈉0.5g;
[0032] 2、量筒量取甘油36mL，20 % (g/mL)人血白蛋白25mL，及60mL五蒸水(按常規方法自 制，將水反復蒸餾五次所得)備用；
[0033] 3、先將60mL五蒸水加入250mL燒杯中，然后放入攪拌磁珠；
[0034] 4、將燒杯放置于磁力攪拌器上，先將轉速調至最低，打開電源，再將轉速調至適當 速度，以保持較大轉速而燒杯中液體不飛濺出來；
[0035] 5、依次加入蔗糖，甘油及碳酸氫鈉，共攪拌15分鐘使之充分溶解；
[0036] 6、用孔徑為0.45um的濾芯過濾，在濾過液中加入人血白蛋白，再次攪拌15分鐘；
[0037] 7、在無菌的環境下分裝成25mL裝小瓶，保存于_75°C備用。
[0038] 以下通過實驗來檢測實施例的精子冷凍效果 [0039]檢測方法:冷凍實驗
[0040] 1、選用市面上常用的含卵黃的精子冷凍保護劑(稱為對比例1)和按本配方實施例 1所配制的精子冷凍保護劑各10mL;
[0041 ] 2、選取精子密度為40-80 X 106個/mL，活率為30-60 %，體積為2-5mL的精液標本共 25份，并登記其常規參數；
[0042] 3、按照精子冷凍保護劑:精液=1:3 (體積比）的比例將精子冷凍保護劑與精液混 合，即每管lmL的混合液體中，包含0.25mL的精子冷凍保護劑和0.75mL的精液，每份標本均 各做兩管不同精子冷凍保護劑的冷凍實驗;充分混合均勻后，按程序冷凍儀預設的程序進 行冷凍；
[0043] 4、將混合液體降溫至_196°C并達到穩定之后，從液氮中取出冷凍精液，在水浴搖 床中解凍(37°C);
[0044] 5、解凍后，再次利用相差顯微鏡，對精子密度、活率等常規參數進行檢驗并登記為 凍后；
[0045] 6、凍后活率+凍前活率X 100% =冷凍復蘇率。
[0046]檢測所用儀器 [0047]
[0048] 具體實驗數據請見下表：
[0049]
[0050]
[0051 ] 數據檢測方法:兩組冷凍復蘇率采用SPSS17.0進行配對T檢驗，p = 0.12，p>0.05， 兩者無統計學差異。
[0052] 由上表可知，本發明所采用的新型的精子冷凍保護劑配方，不含卵黃，僅包含蔗 糖、碳酸氫鈉、甘油、20% (g/mL)人血白蛋白等幾種常用的且化學成分明確的試劑，不存在 動物源性致病菌感染的風險，而且所得到的冷凍效果與現有配方相仿，精子冷凍復蘇率平 均值在75 %~80 %。
[0053] 以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實 施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存 在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
[0054] 以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護 范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種精子冷凍保護劑，其特征在于，每125mL所述精子冷凍保護劑含有下列成分： 鹿糖16±0. lg，碳酸氫鈉0.5±0.05g，甘油36±0.5mL，人血白蛋白25±0.2mL，五蒸水 余量。2. 根據權利要求1所述的精子冷凍保護劑，其特征在于，每125mL所述精子冷凍保護劑 含有下列成分： 鹿糖16g，碳酸氫鈉0.5g，甘油36mL，人血白蛋白25mL，五蒸水余量。3. 根據權利要求1或2所述的精子冷凍保護劑，其特征在于，所述人血白蛋白為20g/ lOOmL人血白蛋白。4. 一種權利要求1~3任一項所述的精子冷凍保護劑的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 按照權利要求1或2的成分配比稱取所述蔗糖、碳酸氫鈉、甘油、人血白蛋白以及五 蒸水備用； (2) 依次放入所述五蒸水、蔗糖、甘油、碳酸氫鈉，攪拌均勻； (3) 過濾，在濾過液中加入所述人血白蛋白，攪拌； (4) 分裝，冷凍保存。5. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述人血白蛋白為20g/100mL人血白 蛋白。6. 根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的攪拌時間為14~ 16分鐘。7. 根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的攪拌時間為14~ 16分鐘。8. 根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中的冷凍保存溫度 為-74 ~-76°C〇9. 根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述過濾為用孔徑為0.45um的濾 芯過濾。
【專利摘要】本發明涉及一種精子冷凍保護劑及其制備方法，所述每125mL精子冷凍保護劑含有下列成分：蔗糖，碳酸氫鈉，甘油，人血白蛋白以及五蒸水。本發明所采用的新型的精子冷凍保護劑配方，不含卵黃，僅包含蔗糖、碳酸氫鈉、甘油、20％(g/mL)人血白蛋白等幾種常用的且化學成分明確的試劑，不存在動物源性致病菌感染的風險，而且所得到的冷凍效果與現有配方相仿，精子冷凍復蘇率平均值在75％-80％左右。
【IPC分類】A01N1/02
【公開號】CN105532643
【申請號】CN201511028340
【發明人】朱文兵, 盧光琇, 范立青, 彭向杰
【申請人】中信湘雅生殖與遺傳專科醫院有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月31日