提高牛冷凍精液精子運動性和體外受精率的方法
【專利摘要】本發明提供一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法。該方法的特征在于：在牛冷凍精液的前期處理階段中用SP-TALP洗滌液洗滌時，或在受精前精液的獲能處理階段中使用PHE獲能液進行獲能處理時，或在體外受精階段中制備受精滴時加入純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因；其中每支牛冷凍精液的受精過程中，在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中或在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液中或在含有卵母細胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度均為5mmol/L。本發明將兩種物質聯合分別應用到牛冷凍精液受精過程中的三個階段中，大大提高精子的運動性，提高精子的受精率。
【專利說明】提高牛冷凍精液精子運動性和體外受精率的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于家畜胚胎工程【技術領域】，具體涉及一種能通過添加生物活性物質提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法。
【背景技術】
[0002]目前牛的冷凍精液已經進入商業化生產，而且被廣泛應用于人工受精技術。但是，精液生產和使用中的冷凍解凍過程破壞了精子的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在正常生理條件下的動態平衡狀態，導致精子ROS增加，引起精子膜的過氧化和DNA損傷，從而影響精子活力、質膜完整性及受精潛力等，降低了精液品質。
[0003]谷胱甘肽(GSH)是哺乳動物細胞中重要的非蛋白硫氫化合物，它作為過氧化一還原酶系統的作用物之一，能及時保護精子免遭氧化及過氧化反應終結產物的傷害，使精子脂膜結構保持穩定。人類和其它哺乳動物包括牛、豬的精子經過冷凍和解凍處理后，細胞中GSH的含量顯著下降，精子的運動性和生存能力也因此而顯著降低。Gadea等(2011)報道指出，在人類精液冷凍液中添加lmmol/L谷胱甘肽，能提高總體精子活率，同時能改變精子直線運動速度、平均路徑速度和運動的擺動性。在解凍液中添加lmmol/L或者5mmol/L的谷胱甘肽，能提高總體精子活率和直線運動的精子活率。張文舉等(1997)在牛稀釋精液中添加3mmol/L的谷胱甘肽，明顯提高了公牛的凍精活力，頂體完整率，并且使母牛情期受胎率提高了 6.4%;Saweta等(1995)向牛冷凍稀釋液中添加5mmol/L的谷胱甘肽，冷凍3.0h后解凍，發現精子活力比未添加谷胱甘肽的精子活力提高了 6.4%，精子的頂體完整率提高了3_8%，受胎率提高了 6.3% ;劉璐等(2010)在常規冷凍稀釋液中添加5mmol/L谷胱甘肽解凍后，精子活力、頂體完整率均優于對照組，畸形率低于對照組；但是濃度高于5mmol/L時，精液活力有所下降。`
[0004]咖啡因作為環狀核苷酸酯酶的一種抑制劑，主要通過抑制環腺苷酸酶來使細胞內積累充分的cAMP，使精子內與精子運動、獲能、頂體反應相關的環狀磷酸腺苷(cAMP)含量增高。能在ATP酶活性低的情況下維持精子活力，從而增強精子活動能力。大量的研究表明，添加不同濃度的咖啡因對精子活動能力的影響不同。牛原精液在含6mmol/L咖啡因的基質中，37°C培養4h，精子活率為55.2%，顯著高于對照組(27.2%)(Garbers et al.，1971)。咖啡因的濃度為60mmol/L時，人精子的總活率、運動速度、直線運動的精子活率和運行速度都被抑制，濃度達到120mmol/L時，精子完全停止運動(Μομ ssa，1983)。同時Garbers等(1971)的研究還發現，咖啡因對不同公牛個體精子的作用不同，咖啡因可以迅速激活低活率個體的精子，但是對于高活率個體精子的刺激作用不明顯。文國藝(2000)報道指出，咖啡因在提高精子活率促進精子獲能的同時，對卵母細胞和早期胚胎有毒害作用并最終影響胚胎質量，并且毒性作用隨濃度的增加和時間的延長而增強。因此，咖啡因的添加濃度以及與其它物質是否可以協同使用減少其毒害作用有待于我們的進一步研究。
[0005]在精液的稀釋和冷凍過程中單獨添加谷胱甘肽和咖啡因這兩種精子活性物質能改善精子運動能力的報道較多，由于這兩種物質對精子的作用機制不同，兩者是否存在協同作用以及合適濃度的組合都尚未見報道。但是在精子代謝的過程中，谷胱甘肽和咖啡因有共同作用的位點(Ferrero JL, Neims AH.1983; Hong et al.，1984),這為兩種物質的聯合應用提供了可能。盡管通過分析精子的運動能力可以預測精子的受精能力，但是要全面評價谷胱甘肽和咖啡因這兩種活性物質對體外受精后胚胎的發育情況的影響，仍然需要體外受精試驗的進一步驗證。
[0006]以下是 申請人:檢索的相關資料:
[0007]1、Gadea Jj Molla Mj SelIes Ej Marco MAj Garcia-Vazq μ ez FAj GardonJC.Reduced glutathione content in human sperm is decreased aftercryopreservation:Effeet of the addition of reduced glutathione to thefreezing and thawing extenders.Cryobiology.2011;62:40_6o
[0008]2、張文舉，楊軍祥，黃全成，等.谷胱甘肽提高牛凍精活力及受胎率的研究.甘肅畜牧獸醫，1997 (2):13o
[0009]3、劉璐，張劭俁，張或，等.犬常規冷凍稀釋液中添加谷胱甘肽的研究.北京農業.2010，12:1-9
[0010]4λ Garbers DLj First NLj Sul I ivan JJj Lardy HA.Stim μ lation andmaintenance of ejac μ lated bovine spermatozoan respiration and motility bycaffeine.Biology of reproduction.1971;5:336-9。
[0011]5、Moussa MM.Caffeine and sperm motility.Fertility andsterility.1983;39:845-8。
[0012]6、文國藝.咖啡因預處理解凍精液對牛體外受精的影響.西南農業學報.2000，13(2):95-98 ο`
[0013]7、Ferrero JL，Neims AH.Metabo Iism of caffeine by mouseliver mi cro some s:GSH or cytosol causes a shift in productsfroml，3，7 — trimethyl μ rate to a substituted di amino μ racil.Lifesciences.1983;33:1173-8。
[0014]8、Hong CY，Chiang BNj Ku JjWei YH.Gl μ tathione and caffeineantagonize the sperm-1mmobilizing effect of a vaginal contraceptive.Hμ mantoxicology.1984;3:271-7。

【發明內容】

[0015]本發明是為了解決因牛冷凍精液解凍后精子活性氧增加，而導致的精液品質降低以及體外受精后胚胎早期發育率低的問題，提供了一種通過添加生物活性物質，可以提高冷凍精子運動能力、及時清除體外受精環境中過量的自由基，從而提高牛早期胚胎發育率的方法。
[0016]本發明提供的技術方案:所述一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，依次包括牛冷凍精液的前期處理、受精前精液的獲能處理和與加入卵母細胞的受精滴進行體外受精三個階段，其特征在于:在牛冷凍精液的前期處理階段中用SP-TALP洗滌液對牛精液處理時加入純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在受精前精液的獲能處理階段中使用PHE獲能液對牛精液進行獲能處理時加入純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在體外受精階段中制備含有卵母細胞的受精滴時加入純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，在每個階段加入谷胱甘肽和咖啡因時，其它階段都與現有受精方法相同；其中每支牛冷凍精液的受精過程中，每支牛冷凍精液都是固定的體積為250 μ 1，在牛冷凍精液的前期處理階段加入的谷胱甘肽和咖啡因時，兩者在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中濃度均為5mmol/L，在受精前精液的獲能處理階段加入的谷胱甘肽和咖啡因時，兩者在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液中濃度均為5mmol/L，在體外受精階段加入的谷胱甘肽和咖啡因時，兩者在含有卵母細胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度均為5mmol/L。其中所述谷胱甘肽和咖啡因均有商業化的產品出售，本發明中所用的谷胱甘肽由Sigma公司提供的，咖啡因由Amresco公司提供。
[0017]本發明提供的一種提聞牛冷凍精液精子運動性及體外受:精率的方法，其特征在于在牛冷凍精液的前期處理階段加入谷胱甘肽和咖啡因時，其體外受精的具體步驟如下:
(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻，并向牛精液和SP-TALP洗滌液的混合液中添加純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中的濃度均為5mmol/L，然后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2_3小時；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min,,離心時間5_8min ；
[0018](2)將步驟(I)中溫育處理后的混合液放入離心管中第二次離心并棄上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液，調整精子的濃度為3 X IO6個/mL-4X IO6個/mL，之后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中儲存備用；其中第二次離心的離心速度為1500-1700r/min，離心時間為5_10min，二次離心棄上清后留取的牛精液沉淀混合物為100-120 μ L ；
[0019](3)將步驟(2)中準備的含有精子的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的混合獲能液`，并放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用；
[0020](4)取40-50 μ L的IVF-TALP受精液，加入5_6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞制備成60 μ L含有牛卵母細胞的受精滴，并放入溫度為38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培
養禮備用；
[0021](5)將步驟(4)中制備的含有牛卵母細胞的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的混合獲能液按照體積比1:1的比例混合后放入38.5°C, 5%的CO2和100%飽和蒸汽的培養箱中培養18_20h ；
[0022]本發明提供的一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于在受精前精液的獲能處理階段加入谷胱甘肽和咖啡因時，其體外受精的具體步驟如下:
(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2-3小時；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min2000r/min，離心時間5_8min ；
[0023](2)將步驟(I)中溫育處理后的混合液放入離心管中第二次離心并棄上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液調整精子的濃度為3 X IO6個/mL-4X IO6個/mL，之后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中儲存備用；其中第二次離心的離心速度為1500-1700r/min，離心時間為5_10min，二次離心棄上清后留取的牛精液沉淀混合物為100-120 μ L ；
[0024](3)將步驟(2)中準備的含有精子的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合獲能液，向混合獲能液內添加純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的獲能混合液中的終濃度為5mmol/L，之后將其放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用；
[0025](4)取40-50 μ L的IVF-TALP受精液，加入5_6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞制備成60 μ L含有牛卵母細胞的受精滴，放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用；
[0026](5)將步驟(4)中制備的含有牛卵母細胞的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的混合獲能液等體積混合后放入38.50C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中培養18-20h。
[0027]本發明提供的一種提聞牛冷凍精液精子運動性及體外受:精率的方法，其特征在于在體外受精階段加入谷胱甘肽和咖啡因時，其體外受精的具體步驟如下:(1)取一支牛冷凍精液，將其解凍后放入離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2_3小時；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min,離心時間5_8min ；
[0028](2)將步驟(I)中溫育處理后的混合液放入離心管中第二次離心并棄上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液調整精子的濃度為3 X IO6個/mL-4X IO6個/mL，之后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中儲存備用；其中第二次離心的離心速度為1500-1700r/min，離心時間為5_10min，二次離心棄上清后留取的牛精液沉淀混合物為100-120 μ L ；
`[0029](3)將步驟(2)中準備的含有精子的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的獲能混合液，放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用;
[0030](4)取40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，放入38.5 V，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中預孵2小時，加入5-6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞，然后添加10mmol/L的純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，制備成體積為60 μ L的含有卵母細胞的受精滴，并放入38.50C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用；
[0031](5)將步驟(4)中制備的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的獲能混合液等體積混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的終濃度為5mmol/L，然后放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中培養18-20h。
[0032]本發明進一步的技術方案:在牛冷凍精液的前期處理階段中用SP-TALP洗滌液對牛精液處理過程中加入谷胱甘肽和咖啡因時，是將含有牛精液的SP-TALP洗滌液、濃度為100mmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為lOOmmol/L咖啡因濃儲液按照體積比18:1:1的比例混合均勻，使含有牛精液的SP-TALP洗滌液中谷胱甘肽和咖啡因終濃度均為5mmol/L。
[0033]本發明進一步的技術方案:在受:精如精液的獲能處理階段向含有精子的IVF-TALP受精液與PHE獲能液混合液中加入谷胱甘肽和咖啡因時，是將含有精子的IVF-TALP受精液、PHE獲能液、濃度為lOOmmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為lOOmmol/L的咖啡因濃儲液按照體積比14:13:1.5:1.5混合均勻，使混合后的獲能液中谷胱甘肽和咖啡因終濃度均為5mmol/L。
[0034]本發明較優的技術方案:在體外受精階段向受精滴中加入谷胱甘肽和咖啡因時，是先將40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，將其放入38.5 °C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中預孵2小時，加入5-6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞后使得總體積為48 μ L，按照體積比8:1:1加入濃度為lOOmmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為lOOmmol/L，使得60 μ L的受精滴中含有lOmmol/L谷胱甘肽和咖啡因，之后將含有精子的IVF-TALP受精液和PHE獲能液以17:13的比例混合后再與受精滴等體積混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的最終濃度均為5mmol/L。
[0035]本發明較優的技術方案:所述的SP-TALP洗滌液的配制方法如下:在每IOOml的純水中加入0.579g氯化鈉，0.0230g氯化鉀，0.2104g碳酸氫鈉，0.0047g磷酸二氫鈉，0.3612g乳酸鈉，0.2975gHEPES [中文全稱:4_羥乙基哌嗪乙磺酸；N- (2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸]，0.0294g氯化鈣，0.0224g氯化鎂，并混合均勻后調PH值至7.4，然后通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾后，再向過濾液中添加0.6316g V級的血清白蛋白、5.263mL濃度為2.2mg/mL的丙酮酸和210.53 μ L濃度為5mg/mL的慶大霉素進行混合，再將混合液通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾后形成SP-TALP洗滌液。
[0036]本發明較優的技術方案:所述的IVF-TALP受精液的配制方法如下:在每IOOml的純水中加入0.6665g氯化鈉，0.0235g氯化鉀，0.2104g碳酸氫鈉，0.0047g磷酸二氫鈉，
0.1116g乳酸鈉，0.0294g氯化鈣，0.0102g氯化鎂，并混合均勻后調PH值至7.4，然后通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾后，再向過濾液中添加0.6g血清白蛋白、ImL濃度為
2.2mg/mL的丙酮酸、100 μ L濃度為5mg/mL的慶大霉素和500 μ L肝素并混合均勻，最后將混合液通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾制成IVF-TALP受精液。
[0037]本發明較優的技術方案:所述PHE獲能液是由亞牛磺酸溶液、青霉素鈉溶液和腎上腺素溶液按照體積比5:5:2混合均勻后，再用孔徑為0.22 μ m的過濾器過濾，分裝，在_20°C的環境下永久保存；其中，所述亞牛磺酸溶液是在每IOml生理鹽水中溶解1.09mg亞牛磺酸制成；青霉素鈉溶液是在每IOml生理鹽水中溶解3mg青霉素鈉制成；腎上腺素溶液是在每IOml生理鹽水中溶解1.83mg腎上腺素制成。
[0038]本發明將5mmol/L谷胱甘肽和5mmol/L咖啡因聯合應用，谷胱甘肽競爭性抑制了咖啡因與精子膜的結合，使得谷胱甘肽與咖啡因的配伍濃度較優，在體外處理精子和體外受精的過程中發揮協同作用。兩者的聯合應用，提高精子質量的同時也保證了精子獲能，能有效提高牛精子體外受精后8-16細胞胚胎發育率和卵裂率，為谷胱甘肽與咖啡因在體外受精和體外胚胎生產中的應用提供了依據。
[0039]本發明將兩種物種聯合分別應用到牛冷凍精液受精過程中的三個階段中，分別加到二個階段中均可以大大提聞精子的運動性，精子的運動性是影響受:精率的關鍵，提聞了精子的運動性，便可以提聞精子的受:精率。
【具體實施方式】
[0040]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。對于本發明提供的技術方案分別提出給出三個實施例，每個實施例均以一支牛冷凍精液(采用常規的牛冷凍精液HBQ13201001，每支牛冷凍精液的體積為250 μ L)，在進行具體實施例之前，先配制好以下物質備用:
[0041]配制濃度為lOOmmol/L谷胱甘肽和咖啡因濃儲液:分別取92.4mg谷胱甘肽(GSH，由Sigma提供的)和58.3mg咖啡因(Caffeine,由Amresco公司提供的)，兩者的純度均大于98%，然后各自溶于3mL超純水中，配成IOOmM的溶液，分別分裝到1.5mL的EP管中，冷凍保存。
[0042]配制SP-TALP洗滌液:稱取氯化鈉0.579g，氯化鉀0.0230g,碳酸氫鈉0.2104g,磷酸二氫鈉 0.0047g,乳酸鈉 0.3612g，HEPES0.2975g，氯化鈣 0.0294g,氯化鎂 0.0224g,超純水lOOmL，調PH值至7.4，并0.22 μ m過濾，過濾后向濾液中添加血清白蛋白(V級)0.6316g,丙酮酸5.263mL(濃度為2.2mg/mL)，慶大霉素210.53 μ L (濃度5mg/mL)，混合后再0.22 μ m過濾，然后放在4°C的環境下保存。
[0043]配制IVF-TALP受精液:稱取氯化鈉0.6665g，氯化鉀0.0235g,碳酸氫鈉0.2104g,磷酸二氫鈉0.0047g,乳酸鈉0.1116g，氯化鈣0.0294g,氯化鎂0.0102g,超純水IOOmL,調PH值至7.4，使用孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾后，向過濾`液中添加血清白蛋白(EFAF)0.6g,丙酮酸ImL (濃度為2.2mg/mL),慶大霉素100 μ L(濃度為5mg/mL),肝素500 μ L，配制成常規IVF-TALP受精液，過濾，4°C保存。
[0044]卵母細胞的準備的具體步驟:(1)從武漢市武昌區紅旗村國強畜禽屠宰場采集母牛卵巢，母牛宰殺后割下卵巢放入37°C含有1%雙抗的運輸鹽(稱取9g NaCl溶于IL雙蒸水中，IOml 100 X雙抗制備而成，然后在4 C環境下永久保存)中，在l-3h內運回實驗室，再用37 °C運輸鹽清洗若干次，放入500ml燒杯中封口，37 °C水浴保存；
[0045](2)抽卵和檢卵，抽卵時先用滅菌紗布吸干卵巢表面的水珠，再用帶有18G針頭的IOml注射器吸取約Iml提前溫浴的檢卵液，然后抽取直徑為3_8_的卵泡，盡量避免多次穿針，抽取完后，將注射器緩慢注入提前溫浴的IOml離心管，靜止5min后，用巴氏管吸取離心管底部的沉淀物，然后注入60mm的大皿中，再加入適量的檢卵液稀釋，搖勻，最后，在40X體視鏡下優先挑選有多層卵丘細胞包圍的卵母細胞復合體(COCs)，裸卵和深黑色卵母細胞復合體棄去；檢卵液(OCM)的配制:溶解TCM199粉末10L，稱取3.5g NaHCO3到9L雙蒸水中，加入IOOml 100X雙抗，ρΗ=7.2-7.4，定容至10L，0.22 μ m過濾，4°C永久保存。
[0046](3)體外成熟培養，將上述卵母細胞復合體，用卵母細胞成熟液洗滌4-5次，然后移入提前在CO2培養箱平衡不少于2h的成熟微滴中，每100 μ L滴放入20-30枚，38.5°C,5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中成熟培養22h，成熟培養后觀察，在正常情況下，卵母細胞周圍的卵丘細胞貼壁擴展，周圍可見成片的貼壁生長的單層顆粒體細胞。卵母細胞成熟液(OMM)的配制:量取88ml TCM199到IOOml燒杯中，分別加入22mg丙酮酸鈉，10ml FBS,Iml 雙抗，0.1mgl7 β -E2 和適量的 EGF，FSH, 0.22 μ m 過濾，4°C保存。
[0047](4)成熟卵母細胞準備，先將卵母細胞復合體移入提前溫浴的HEPES-TALP洗卵液中，用檢卵針反復吹打直至卵母細胞周圍僅有3-4層顆粒體細胞，在進行體外受精過程時再移入在CO2培養箱平衡不少于2h的受精滴中，每60 μ L滴中放入5-6個卵母細胞，并移入CO2培養箱中備用。
[0048]實施例一:所述一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，依次包括以下步驟:(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入之前配制好的SP-TALP洗滌液中混合均勻，然后將含有牛精液的SP-TALP洗滌液、濃度為l00mmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為lOOmmol/L咖啡因濃儲液按照體積比18:1:1的比例混合均勻，使含有牛精液的SP-TALP洗滌液中谷胱甘肽和咖啡因終濃度均為5mmol/L，然后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2_3小時；其中第一次離心的離心速度為1500_2000r/min,,離心時間5_8min ；
[0049](2)將步驟(I)中溫育處理后的混合液放入離心管中第二次離心并棄上清液，然后向二次離心后的留取的牛精液沉淀混合物中加入提前配制好的IVF-TALP受精液，調整精子的濃度為3X 106個/mL-4X IO6個/mL，之后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中儲存備用；其中第二次離心的離心速度為1500-1700r/min，離心時間為5_10min，二次離心棄上清后留取的牛精液沉淀混合物為100-120 μ L ；
[0050](3)將步驟(2)中準備的含有精子的IVF-TALP受精液與提前配制好的PHE獲能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的混合獲能液，放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用；
[0051](4)取50 μ L提前配制好的IVF-TALP受精液，制備成受精滴，加入5_6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞使受精滴的體積為60 μ L，放入38.50C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養禮備用;
[0052](5)將步驟(4)中制備的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的混合獲能液按照體積比1:1的比例混合后放入38.50C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中培養18-20h,并觀察記錄其精子的運動性和受精率。
[0053]實施例二:所述一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，依次包括以下步驟:(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后放入離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入提前準備好的SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2-3小時；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min，離心時間 5_8min ；
[0054](2)同實施例一；
[0055](3)將步驟(2)中準備是將含有精子的IVF-TALP受精液、PHE獲能液、濃度為100mmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為lOOmmol/L的咖啡因濃儲液按照體積比14:13:
1.5:1.5混合均勻，使混合后的獲能液中谷胱甘肽和咖啡因終濃度均為5mmol/L，放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用；
[0056](4),(5)均同實施例一；
[0057]實施例三:所述一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，依次包括以下步驟:(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后放入離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入提前準備好的SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2-3小時；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min，離心時間 5_8min ；
[0058]步驟(2)、步驟(3)均同實施例一；
[0059](4)取40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，將其放入38.5 °C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中預孵2小時，加入5-6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞后使得總體積為48 μ L，按照體積比8:1:1加入濃度為lOOmmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為IOOmmol/L,使得60 μ L的受精滴中含有10mmol/L谷胱甘肽和咖啡因，放入38.5°C，5%的CO2和100%飽和蒸汽的培養箱中備用；
[0060](5)將步驟(4)中制備的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的獲能混合液等體積混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的終濃度為5mmol/L，然后放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中培養18-20h，并觀察記錄其精子的運動性和受精率。
[0061]觀測得到以上三個實施例中精子直線運動、精子活率、曲線運動速度、側擺幅度和鞭打頻率均有不同程度的高，體外受精的結果顯示8-16細胞胚胎發育率比不添加物質的提高了 9.91個百分點，卵裂率提高了 12.26個百分點。
[0062]針對上述三個實施例，本發明還做了三個對比試驗。
[0063]對比試驗一:本實驗設定四組對比試驗，每組對比試驗均以一支常規冷凍精液HBQ13201001來完成整個受精過程:
[0064]第一組(對照組):按照實施例一中的步驟不添加任何物質完成體外受精；
[0065]第二組(谷胱甘肽+咖啡因):按照實施例一的步驟完成體外受精；
[0066]第三組(谷胱甘肽): 按照實施例一的步驟，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步驟中單獨添加純度大于98%谷胱甘肽,谷胱甘肽與實施例一中添加的濃度一樣；
[0067]第四組(咖啡因):按照實施例一的步驟，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步驟中單獨添加純度大于98%咖啡因，咖啡因與實施例一中添加的濃度一樣；
[0068]對比試驗二:也設定四組對比試驗，每組對比試驗均以一支常規冷凍精液HBQ13201001來完成整個受精過程:
[0069]第一組(對照組):與對比試驗一的對照組相同；
[0070]第二組(谷胱甘肽+咖啡因):按照實施例二的步驟完成體外受精；
[0071]第三組(谷胱甘肽):按照實施例二的步驟，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步驟中單獨添加純度大于98%谷胱甘肽，谷胱甘肽與實施例二中添加的濃度一樣；
[0072]第四組(咖啡因):按照實施例二的步驟，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步驟中單獨添加純度大于98%咖啡因，咖啡因與實施例二中添加的濃度一樣；
[0073]對比試驗三:也設定四組對比試驗，每組對比試驗均以一支常規冷凍精液HBQ13201001來完成整個受精過程:
[0074]第一組(對照組):與對比試驗一的對照組相同；
[0075]第二組(谷胱甘肽+咖啡因):按照實施例三的步驟完成體外受精；
[0076]第三組(谷胱甘肽):按照實施例三的步驟，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步驟中單獨添加純度大于98%谷胱甘肽,谷胱甘肽與實施例三中添加的濃度一樣；
[0077]第四組(咖啡因):按照實施例三的步驟，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步驟中單獨添加純度大于98%咖啡因，咖啡因與實施例三中添加的濃度一樣。
[0078]并將三個對比試驗的每組試驗中體外受精后的合子用輸卵管合成液mSOF (由SOF基礎液加入1%雙抗和3mg/mLBSA (EFAF) ,0.22 μ m的過濾器過濾后得到，并在4°C保存。)洗滌3-5次，然后轉入與處理組對應的在CO2培養箱中平衡不少于2h的胚胎發育微滴中培養。受精當天記為DayO，受精后Day2統計卵裂率和胚胎發育滴中加入5%FBS，Day6_Day9統計
囊胚胎率。
[0079]在以上試驗過程中，通過儀器對實施例一和兩個對比試驗進行數據分析，檢測出以下參數:直線運動精子活率(%)、A級精子百分率(%)、B級精子百分率(%)、C級精子百分率(%)、D級精子百分率(%)、曲線運動速度(VCL，μ m/s)、直線運動速度(VSL，μ m/s)、平均路徑速度(VAP，μ m/s)、直線性 LIN (VSL/VCL, %)、擺動性 WOB (VAP/VCL, %)、前向性 STR (VSL/VAP, %)、平均移動角度(MAD，。)、側擺幅度(ALH，μ m)、鞭打頻率(BCF，Hz)。
[0080]對比試驗一中的四組對比試驗中精子的活率見表1:
[0081]表I谷胱甘肽、咖啡因及其組合添加在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中的精子活
率
【權利要求】
1.一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，依次包括牛冷凍精液的前期處理、受精前精液的獲能處理和與加入卵母細胞的受精滴進行體外受精三個階段，其特征在于:在牛冷凍精液的前期處理階段中用SP-TALP洗滌液對牛精液處理時加入純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在受精前精液的獲能處理階段中使用PHE獲能液對牛精液進行獲能處理時加入純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在體外受精階段中制備含有卵母細胞的受精滴時加入純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因；其中，在牛冷凍精液的前期處理階段，每支牛冷凍精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量為:兩者在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中濃度均為5mmol/L ;在受精前精液的獲能處理階段，每支牛冷凍精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量為:兩者在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液中濃度均為5mmol/L，在體外受精階段，每支牛冷凍精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量為:兩者在含有卵母細胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度均為5mmol/L。
2.根據權利要求1所述的一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于在牛冷凍精液的前期處理階段加入谷胱甘肽和咖啡因時，其體外受精的具體步驟如下: (1)取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照I: I的體積比加入 SP-TALP洗滌液混合均勻，并向牛精液和SP-TALP洗滌液的混合液中添加純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中的濃度均為5mmol/L，然后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2_3小時；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min,離心時間5_8min ； (2)將步驟(I)中溫育處理后的混合液放入離心管中第二次離心并棄上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液調整精子的濃度為3X IO6個/mL-4X IO6個/mL，之后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中儲存備用；其中第二次離心的離心速度為1500-1700r/min，離心時間為5_10min，二次離心棄上清后留取的牛精液沉淀混合物為 100-120 μ L ； (3)將步驟(2)中準備的含有精子的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的混合獲能液，放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用； (4)取40-50μ L的IVF-TALP受精液，加入5-6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞，制備成60 μ L含有牛卵母細胞的受精滴，并放入溫度為38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽培養箱備用; (5)將步驟(4)中制備的含有牛卵母細胞的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的混合獲能液按照體積比1:1的比例混合后放入38.50C，5%的CO2和100%飽和蒸汽的培養箱中培養18-20h。
3.根據權利要求1所述的一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于在受精前精液的獲能處理階段加入谷胱甘肽和咖啡因時，其體外受精的具體步驟如下: (I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照I: I的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2-3小時；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min2000r/min，離心時間5_8min ；(2)將步驟(I)中溫育處理后的混合液放入離心管中第二次離心并棄上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液調整精子的濃度為3 X IO6個/mL-4X IO6個/mL，之后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中儲存備用；其中第二次離心的離心速度為1500-1700r/min，離心時間為5_10min，二次離心棄上清后留取的牛精液沉淀混合物為 100-120 μ L ； (3)將步驟(2)中準備的含有精子的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合獲能液，向混合獲能液內添加純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的獲能混合液中的終濃度為5mmol/L，之后將其放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用； (4)取40-50μ L的IVF-TALP受精液，加入5-6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞，制備成60 μ L含有牛卵母細胞的受精滴，再放入38.50C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用； (5)將步驟(4)中制備的含有牛卵母細胞的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的混合獲能液等體積混合后放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中培養18-20h。
4.根據權利要求1所述的一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于在體外受精階段加 入谷胱甘肽和咖啡因時，其體外受精的具體步驟如下: (1)取一支牛冷凍精液，將其解凍后放入離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照I: I的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中溫育2-3小時；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min，離心時間5_8min ； (2)將步驟(I)中溫育處理后的混合液放入離心管中第二次離心并棄上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液調整精子的濃度為3X IO6個/mL-4X IO6個/mL，之后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中儲存備用；其中第二次離心的離心速度為1500-1700r/min，離心時間為5_10min，二次離心棄上清后留取的牛精液沉淀混合物為 100-120 μ L ； (3)將步驟(2)中準備的含有精子的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的獲能混合液，放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用； (4)取40-45μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中預孵2小時，加入5-6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞，然后添加IOmmol/L的純度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，制備成體積為60 μ L的受精滴，并放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中備用； (5)將步驟(4)中制備的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的獲能混合液等體積混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的終濃度為5mmol/L，然后放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中培養18-20h。
5.根據權利要求2所述的一種提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于:在牛冷凍精液的前期處理階段中用SP-TALP洗滌液對牛精液處理過程中加入谷胱甘肽和咖啡因時，是將含有牛精液的SP-TALP洗滌液、濃度為lOOmmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為lOOmmol/L咖啡因濃儲液按照體積比18:1:1的比例混合均勻，使含有牛精液的SP-TALP洗滌液中谷胱甘肽和咖啡因終濃度均為5mmol/L。
6.根據權利要求3所述的提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于:在受精前精液的獲能處理階段向含有精子的IVF-TALP受精液與PHE獲能液混合液中加入谷胱甘肽和咖啡因時，是將含有精子的IVF-TALP受精液、PHE獲能液、濃度為lOOmmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為lOOmmol/L的咖啡因濃儲液按照體積比14:13:1.5:1.5混合均勻，使混合后的獲能液中谷胱甘肽和咖啡因終濃度均為5mmol/L。
7.根據權利要求4所述的提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于:在體外受精階段向受精滴中加入谷胱甘肽和咖啡因時，取40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，將其放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養箱中預孵2小時，加入5-6枚經體外培養成熟的牛卵母細胞后使得總體積為48 μ L，按照體積比8:1:1加入濃度為lOOmmol/L的谷胱甘肽濃儲液和濃度為lOOmmol/L，使得60 μ L的受精滴中含有IOmmol/L谷胱甘肽和咖啡因，之后將含有精子的IVF-TALP受精液和PHE獲能液以17:13的比例混合后再與受精滴等體積混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的最終濃度均為5mmol/L。
8.根據權利要求1或2或3或4所述的提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于:其特征在于所述的SP-TALP洗滌液的配制方法如下:在每IOOml的純水中加入0.579g氯化鈉，0.0230g氯化鉀，0.2104g碳酸氫鈉，0.0047g磷酸二氫鈉，0.3612g乳酸鈉，0.2975gHEPES，0.0294g氯化鈣，0.0224g氯化鎂，并混合均勻后調PH值至7.4，然后通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾后，再向過濾液中添加0.6316g V級的血清白蛋白、5.263mL濃度為2.2mg/mL的丙酮酸和210.53 μ L濃度為5mg/mL的慶大霉素進行混合，再將混合液通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾后形成SP-TALP洗滌液。
9.根據權利要求1或2或3或4所述的提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于所述的IVF-TALP受精液的配制方法如下:在每IOOml的純水中加入0.6665g氯化鈉，0.0235g氯化鉀，0.2104g碳酸氫鈉，0.0047g磷酸二氫鈉，0.1116g乳酸鈉，0.0294g氯化鈣，0.0102g氯化鎂，并混合均勻后調PH值至7.4，然后通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾后，再向過濾液中添加0.6g血清白蛋白、ImL濃度為2.2mg/mL的丙酮酸、100 μ L濃度為5mg/mL的慶大霉素和500 μ L肝素并混合均勻,最后將混合液通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進行過濾制成IVF-TALP受精液。
10.根據權利要求1或2或3或4所述的提高牛冷凍精液精子運動性及體外受精率的方法，其特征在于所述PHE獲能液是由亞牛磺酸溶液、青霉素鈉溶液和腎上腺素溶液按照體積比5:5:2混合均勻后，再用孔徑為0.22 μ m的過濾器過濾，分裝，在-20°C的環境下永久保存；其中，所述亞牛磺酸溶液是在每IOml生理鹽水中溶解1.09mg亞牛磺酸制成；青霉素鈉溶液是在每IOml生理鹽水中溶解3mg青霉素鈉制成；腎上腺素溶液是在每IOml生理鹽水中溶解1.83mg腎上腺素制成。
【文檔編號】A61D19/02GK103445882SQ201310383136
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月28日 優先權日:2013年8月28日
【發明者】程蕾, 陳洪波, 劉曉華, 高揚澤, 辛友東, 王定發, 胡修忠, 凌明湖, 夏瑜 申請人:武漢市畜牧獸醫科學研究所