專利名稱：中華鱘精子超低溫冷凍保存技術及工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及到魚類精子超低溫冷凍保存方法，特別是對中華鱘精子超低溫保存方法。
背景技術：
隨著魚類苗種人工繁育和遺傳育種研究的發展，魚類精子超低溫冷凍保存技術已引起人們的關注，魚類精子超低溫冷凍保存首次成功是在1968年，用保存30天(-196℃)白鱔魚精，獲得了80-89％的受精率。近年來，魚類精子超低溫冷凍保存已逐步擴展到鯉科、鱸科、鯰科、魚麗科以及鮭魚鱒魚類。
中華鱘是珍稀魚種之一，屬我國一級保護動物，它是我國特有的大型淡水魚類，主要分布于長江水系和珠江水系。近來年，由于水質污染的加劇，以及捕撈強度增大，中華鱘種群銳減，提高中華鱘人工繁殖及人工放流技術，以幫助該種群恢復，已受到黨和政府高度的重視，也是水產界重大的科研課題。
目前，中華鱘親魚的來源完全是葛洲壩下的自然群體，但是在進行人繁殖的過程中，由于是天然捕撈的親魚，個體較大，獲得親魚的數量受到很大的限制，從而極易導致雌、雄親魚性腺成熟不同步。實際繁殖過程中，往往是雄魚成熟了，雌魚尚未排卵；或有了成熟的雌魚，卻沒有雄魚。兩者之間時間相差短的為幾小時，或者1～2天；長的時間甚至可達上十天。
另一方面，由于中華鱘為大型魚類，授精一條雌魚一般需幾百，甚至上千毫升精液，使本來數量有限的親本有效利用率進一步下降，成本增多。而且，中華鱘精子一旦被擠出體外后，允許進行超低溫保存的操作時間為12小時，目前魚類的冷凍保存技術每小時最多只能完成5～8毫升左右的精子保存，而1條中華鱘精液約為1000毫升。以目前的技術，最多只能有100毫升可用于低溫保存，不能適應大型魚類即中華鱘保存精子的需要。

發明內容
本發明的目的是實現對中華鱘精子超低溫冷凍批量保存，解凍后的受精率達到7％以上。
本發明的另一目的是實現我國特有的大型、珍稀、瀕危魚類中華鱘精子的長期超低溫冷凍保存。
本發明的技術方案如下本發明的工藝為鮮精采集及活力檢測、精子稀釋、抗凍劑及分裝、程序降溫、進入液氮。
1、鮮精的采集擠壓成熟雄中華鱘的腹部，即可收集到鮮精，在收集鮮精過程中，應絕對避免精子與水接觸，收集到的鮮精放入密封的塑料袋中，在溫度為4℃的冰箱或容器中保存；2、鮮精鏡檢在10×10倍的顯微鏡下進行鏡檢，計算機輔助檢測鮮精平均活率達到85％，平均曲線運動速度(VCL)達到160微米/秒以上，平均直線運動速度達到90微米/秒以上，即可冷凍；3、中華鱘稀釋液配制魚類精子被激活是依靠精子自身的滲透壓與周圍環境水中滲透壓差來實現的，溫水魚類精子是由淡水環境的低滲所誘發，而海水魚類精子運動則由海水的交滲所刺激。而滲稀釋液的作用是實現精子的長期保存，確保精子在保存過程中處于完全靜止狀態；中華鱘稀釋液的配制20～30毫摩爾Tris-HCl，30～60毫摩爾蔗糖，2～10毫摩爾KCl，蒸餾水定溶1000毫升，HCl調pH值8～8.5，然后再放入溫度為4℃的冰箱內存放；
4、精子稀釋將中華鱘精子與稀釋液按1∶3比例在燒杯中混合并搖勻，然后放置于溫度為4℃的冰箱內平衡20分鐘；5、程序降溫度儀開機連接好程序降溫儀所有線路，液氮罐中加液氮30升以上，放好液氮泵，關好泵上氣閥，打開電腦和程序、機后開關、液氮泵開關、使液氮壓力升至0.2ibf/in2以上；打開降溫儀開關，降溫程序啟動，使降溫倉溫度在15～20分鐘內降至0℃，等待加樣；6、加抗凍劑及分裝將上述稀釋平衡后的精子加入甲醇，使其甲醇終濃度達到9～10％，混勻后立即分裝，用2毫升微量進樣器(10支頭排)進行分裝，分裝入2毫升冷凍管中，一次可裝10支管，約需時間為10秒鐘，于3～4分鐘完成分裝，將分裝好的冷凍管放入冷凍架上，立即放入程序降溫儀的冷凍倉中，所述的抗凍劑，是利用其脫水作用，使精子中的部分水脫出，因為精子內含有大量的水份，當精子在降溫冷凍過程中，在通過冰晶形成區(一般為-15℃～-60℃)時，其內部會形成冰晶，從而破壞細胞膜，導致精子死亡，加入脫水劑之后，可使精子中的水部分脫出，以達到降低精子冰點的目的，防止精子在冷凍過程中嚴重脫水和低溫休克；7、程序降溫降溫程序為0℃開始，以3℃/分鐘的速度從0℃降至-5℃，以5℃/分鐘的速度從-5℃降至-15℃，以10℃/分鐘速度從-15℃降至-25℃，再以20℃/分鐘速度從-25℃降至-80℃，最后平衡5分鐘，降溫完成后，直接將精子從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃溫度中保存，從0℃開始降溫起一直到精子轉入液氮罐中止，其操作時間約需要20分鐘完成；8、每批精子按第4～6步驟可冷凍100毫升鮮精，當第1批精子進行到第7步時，第2批精子可從第4步開始操作。
本發明的優點是
1、能對中華鱘精子批量超低溫冷凍保存，解凍后的受精率達到70％以上，為中華鱘人工繁殖提供足夠的精子資源，特別是是當中華鱘雌、雄魚性腺成熟不同步時，能提供足夠量精子資源。
2、在魚類種質資源保存中，為進一步研究中華鱘物質的長期保存。提供了參考依據和方法。
3、中華鱘精子冷凍保存采用的配制的稀釋劑成分、滲透壓、含量、pH值穩定。
4、中華鱘精子冷凍保存采用冷凍抗凍劑脫水保護穩定。避免了精子在冷凍過程中形成冰晶。
5、中華鱘精子與其他幾種魚類精子超低溫冷凍保存相關參數比較。

通過上述表內比較結果可以說明中華鱘精子個體較大，精液量多，本發明通過調整凍前平衡時間，操作方法分步降溫等，實現了對中華鱘的精子批量冷凍保存。
具體實施例方式實施例1下面以冷凍500毫升中華鱘鮮精為例，說明具體操作過程1、擠壓成熟雄中華鱘的腹部，收集500毫升以上的鮮精，收集過程中應絕對避免精子與水接觸，收集到的鮮精按每袋100毫升的量放入沖氧后的密封的塑料袋中，共裝5袋，然后放進溫度為4℃的冰箱內保存；2、在10×10倍的顯微鏡下進行鏡檢，計算機輔助檢測鮮精平均活詳細達到85％，平均曲線運動速度(VCL)達到160微米/秒以上，平均直線運動速度達到90微米/秒以上，達到比標準即可冷凍；3、中華鱘精子稀釋液的配制2000毫升稀釋配制法1摩爾Tris-HCl20毫升，1摩爾蔗糖30毫升，1摩爾氯化鉀2毫升，蒸餾水定溶至1000毫升，HCl調pH值至8.5，配2次，共配制2000毫升，在溫度為4℃冰箱中存放、備用。
4、每次從1袋中華鱘精液中用量筒取100毫升鮮精，取300毫升稀釋液在500毫升燒杯中混合并搖勻，使其總體積為400毫升，再放入溫度為4℃冰箱內平衡20分鐘；5、在液氮罐內加入30升以上的液氮，并打程序降溫儀和液氮罐上的液氮泵開關，放液氮壓力升至0.2ibf/in2以上，程序降溫儀的降溫倉溫度在15～20分鐘內降至0℃；6、將上述平衡后的精子加入40毫升甲醇，并使其濃度達到9～10％，搖勻后用2毫升微量進樣器進行分裝到2毫升冷凍管中，一次可裝10支管，約需10秒鐘，分裝完畢約為3～4分鐘，分裝好的冷凍罐放入冷凍架上，每個冷凍架上放10支管，共40個冷凍架，立即將其放入程序降溫儀的冷凍倉中。
7、降溫從0℃開始，以3℃/分鐘的速度從0℃降至-5℃，以5℃/分鐘的速度從-5℃降至-15℃，以10℃/分鐘的速度從-15℃降至-25℃，最后以20℃/分鐘的速度從-25℃降至-80℃，然后平衡5分鐘，從程序降溫儀中將精子取出立即放入-1％℃的液氮中保存，整個操作時間約需20分鐘；8、當第7步進行了到5分鐘時，可從第4步，開始第2個100毫升鮮精的冷凍過程作；按上述冷凍過程操作計算，完成500毫升鮮精的冷凍時間為2.5～3小時，而中華鱘精子的有效冷凍時間為8～12小時，因此，該方法是以完成一條中華鱘的所有精子的冷凍保存。
實施例2下面以冷凍1000毫升中華鱘鮮精為例，需4000毫升稀釋液，其配置如下1 摩爾Tris-HCl 20毫升，1摩爾蔗糖30毫升，1摩爾氯化鉀2毫升，蒸餾水定溶至1000毫升，HCl調pH值8.5，配4次，共配制4000毫升，4℃冰箱存放、備用；其他操作方法與上述實施例1相同。
權利要求
1.一種中華鱘精子超低溫冷凍保存技術及工藝，其特征是鮮精的采集擠壓成熟雄中華鱘的腹部，即可收集到鮮精，在收集鮮精過程中，應絕對避免精子與水接觸，收集到的鮮精放入密封的塑料袋中，在溫度為4℃的冰箱或容器中保存；鮮精鏡檢在10×10倍的顯微鏡下進行檢，計算機輔助檢測鮮精平均活率達到85％，平均曲線運動速度(VCL)達到160微米/秒以上，平均直線運動速度達到90微米/秒以上，即可冷凍；中華鱘稀釋液配制20～30毫摩爾Tris-HCl，30～60毫摩爾蔗糖，2～10毫摩爾KCl，蒸餾水定溶1000毫升，HCl調pH值8～8.5，然后再放入溫度為4℃的冰箱內存放；精子稀釋將中華鱘精子與稀釋液按1∶3比例在燒杯中混合并搖勻，然后放置于溫度為4℃的冰箱內平衡20分鐘；程序降溫度儀開機連接好程序降溫儀所有線路，液氮罐中加液氮30升以上，放好液氮泵，關好泵上氣閥，打開電腦和程序、機后開關、液氮泵開關、使液氮壓力升至0.2以上；打開降溫儀開關，降溫程序啟動，使降溫倉溫度在15～20分鐘內降至0℃，等待加樣；加抗凍劑及分裝將上述稀釋平衡后的精子加入甲醇，使其甲醇經濃度達到9～10％，混勻后立即分裝，用2毫升微量進樣器(10支頭排抱)進行分裝，分裝入2毫升冷凍管中，一次可裝10支管，需時間為10秒鐘，于3～4分鐘完成分裝，將分裝好的冷凍管放入冷凍架上，立即放入程序降溫儀的冷凍倉中；程序降溫降溫程序為0℃開始，以3℃/分鐘的速度從0℃降至-5℃，以5℃/分鐘的速度從-5℃降至-15℃，以10℃/分鐘速度從-15℃降至-25℃，再以20℃/分鐘速度從-25℃降至-80℃，最后平衡5分鐘，降溫完成后，直接將精子從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃溫度中保存，從0℃開始降溫起一直到精子轉入液氮罐中止，其操作時間需20分鐘完成；每批精子按第4～6步驟可冷凍100毫升鮮精，當第1批精子進行到第7步時，第2批精子可從第4步開始操作。
全文摘要
中華鱘精子超低溫冷凍批量保存技術及工藝為鮮精采集及檢測、精子稀釋、凍前平衡、加抗凍劑及分裝、程序降溫、最后進入溫度為－196℃液氮罐中保存；每批可冷凍100毫升鮮精，當第1批精子進行到工藝中的程序降溫5分鐘后，第2批精子可從工藝中的精子稀釋開始操作，如此重復，直至全部精子在中華鱘精子的有效時間8－12小時前冷凍完畢。所述的稀釋劑為20～30毫摩爾Tris－HCl，30～60摩爾蔗糖、2～10毫摩爾氯化鉀，蒸餾水定溶至1000毫升，HCl調pH值8～8.5；所述的抗凍劑為甲醇。本發明能有效地實現對中華鱘精子超低溫冷凍批量保存及長期超低溫冷凍保存，為中華鱘人工繁殖提供足夠量的精子資源。
文檔編號A01N1/00GK101084927SQ20071005159
公開日2007年12月12日 申請日期2007年2月15日 優先權日2007年2月15日
發明者柳凌, 危起偉, 張潔明, 郭峰, 朱永久 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所