一種高效保護玻璃化冷凍牛卵母細胞線粒體功能的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高效保護玻璃化冷凍牛卵母細胞線粒體功能的方法，從而極大提 高冷凍卵母細胞中線粒體的功能及其發育能力。
【背景技術】
[0002] 隨著世界人口的劇增和環境污染的日益嚴重，哺乳動物遺傳資源儲備急劇減少， 卵母細胞的冷凍保存成為保護物種資源多樣性和拯救瀕危動物的有效手段。同時，它也是 加快家畜品種改良、建立動物基因庫和胚胎移植產業化的重要組成部分，并為克隆、轉基因 等現代生物技術提供豐富的試驗材料，使卵母細胞的供給和使用不受時間和空間的限制。
[0003] 然而，盡管哺乳動物和人卵母細胞冷凍保存研宄逐步開展并取得很大進展，但是 卵母細胞冷凍保存的研宄遠遠不及胚胎或精子冷凍保存的水平。研宄表明，相對于程序法 冷凍而言，玻璃化冷凍保存卵母細胞的效果要較好，但卵母細胞玻璃化冷凍保存后的發育 能力仍明顯下降，例如：牛卵母細胞玻璃化冷凍后進行體外受精，囊胚率（17. 50% )較新鮮 卵母細胞（32.06% )下降了 50%左右。
[0004] 線粒體是細胞中含量豐富的細胞器，也是細胞的能量工廠，它通過氧化磷酸化為 細胞的各項生命活動提供ATP，同時它又是細胞凋亡的調控中樞和重要鈣庫。許多研宄已經 證實，線粒體的分布、膜電位等對卵母細胞的發育潛力有著非常重要的影響。目前，關于玻 璃化冷凍對線粒體冷凍造成的損傷、采用何種方法或措施能夠減輕此損傷，都還缺乏深入 研宄。
【發明內容】
[0005] 針對上述不足，本發明提供了一種高效保護玻璃化冷凍牛卵母細胞中線粒體功能 的方法。
[0006] 本發明方法是在牛卵母細胞玻璃化冷凍過程中，在牛卵母細胞體外成熟液、玻璃 化冷凍液中添加MT，來高效保護牛卵母細胞中線粒體的功能。
[0007] 優選地，所述MT的添加濃度為KT7~KTkiIL更優選，所述MT的添加濃度為1(T9M。
[0008] 本發明還提供用于保護玻璃化冷凍牛卵母細胞中線粒體功能的玻璃化冷凍液，該 冷凍液含有MT，MT的含量優選為10_7~KTkiM,更優選為10_9M。在本發明實施例中，玻璃化 冷凍液為EDFSF40:EG、DMS0和FSF液按照體積比（v/v)2 : 2 : 6混勻，其中FSF液：含有 30%(?八）聚蔗糖？1(：〇1170、0.511蔗糖和20%?83的0?85溶液。
[0009] 此外，本發明還提供MT在保護玻璃化冷凍牛卵母細胞線粒體中的應用。
[0010] 本發明研宄表明，玻璃化冷凍會顯著性提高牛卵母細胞中ROS水平，而異常升高 的ROS水平會導致線粒體膜功能異常（如膜電位下降等），MT處理能夠顯著性降低冷凍卵 母細胞中ROS水平、且與新鮮對照組無顯著性差異。進一步研宄表明，玻璃化冷凍會使牛卵 母細胞中ATP含量顯著降低（新鮮對照組0? 86pmol/卵母細胞，冷凍對照組0? 58pmol/卵 母細胞），而在牛卵母細胞體外成熟液和玻璃化冷凍液中添加MT時，能夠有效保護卵母細 胞中線粒體功能，尤其是在添加KT9MT時表現出顯著效果，其ATP產量與新鮮卵母細胞無顯 著性差異（MT冷凍組0. 84pmol/卵母細胞，新鮮對照組0. 86pmol/卵母細胞）。說明在體 外成熟液和玻璃化冷凍液中添加KT9M MT，能夠有效保護維持線粒體的功能。對冷凍卵母 細胞進行孤雌激活后發現，MT冷凍組卵母細胞孤雌激活后卵裂率（85. 63%，137/160)、囊 胚率（44. 53% ,61/137)均顯著性高于冷凍對照組（54. 30%，101/186 ;26. 73%，37/101)， 且與新鮮對照組（88. 79%，95/107 ;46. 32%，44/95)無顯著性差異，說明MT通過高效保護 卵母細胞中線粒體的功能，進而促進了冷凍卵母細胞的發育能力。
[0011] 本發明的優點，操作簡單，對卵母細胞無毒無害，能有效保護冷凍卵母細胞的線粒 體功能及其發育能力，這對于提高冷凍卵母細胞的應用范圍，具有重要的理論和實際意義。
[0012] 本發明的處理方法操作簡單、費用不高、本發明將在牛的卵母細胞超低溫冷凍研 宄領域發揮巨大作用。
【附圖說明】
[0013] 圖1是卵母細胞中ROS染色圖標尺=20 ym;
[0014] 圖2是MT處理、CsA處理對玻璃化冷凍牛卵母細胞中ROS水平影響的比較。
【具體實施方式】
[0015] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0016] 實施例1、MT、環孢霉素（CsA)對玻璃化冷凍牛卵母細胞線粒體功能保護功能的比 較
[0017] 1、卵母細胞的收集和體外成熟
[0018] 牛卵母細胞從當地屠宰場收集，保存在加有75 yg/mL青霉素和50 yg/mL鏈霉素 的35°C生理鹽水中2h內送回實驗室，從直徑為2-8mm的卵泡中抽出卵丘-卵母細胞復合 體，挑選至少有3層致密卵丘細胞的復合體洗滌后用于體外成熟，約50個卵丘-卵母細胞 復合體一組放在500 y L成熟液做成的覆蓋有礦物油的4孔板中38. 5 °C，5 % 0)2最大濕度 條件下培養。成熟液配方:M-199 (GibcoBRL公司，格蘭德島，紐約，美國）和IOyg/mL的卵 泡刺激素$311)，10 1^/1^黃體生成素（1^)，11^/1^雌二醇，10%的胎牛血清$85,6讓(3〇 BRLDivision，格蘭德島，紐約，美國），IOyg/mL的肝素。
[0019] 2、OPS的制備
[0020] 按照Vajta等介紹的方法，做些改變制備OPS管，0.25mL的塑料管（I. M. V，萊格 勒，法國），高溫變軟后人為拉長，用顯微控制儀測量使頂端外部直徑為0. 23mm，管壁厚約 0. 02mnu
[0021] 3、預處理和玻璃化冷凍液
[0022] 預處理液：含有10%乙二醇（EG)+10%二甲基亞風（DMSO)的DPBS溶液。
[0023] 玻璃化冷凍液EDFSF40 :EG、DMS0和FSF液按照體積比（v/v)2 : 2 : 6混勻
[0024] FSF 液：含有 30% (w/v)聚蔗糖 Ficoll 70、0. 5M 蔗糖和 20% FBS 的 DPBS 溶液
[0025] 4、卵母細胞的冷凍與解凍
[0026] 體外成熟培養22-24h后，用0. 1%的透明質酸酶消化l-2min，消化掉復合物中的 卵丘細胞，挑選出有第一極體和胞質均勻的卵母細胞用于實驗。卵母細胞在ED中孵化30s 轉入EPFSF40中培養25s，然后裝入OPS管中直接投入液氮中凍存。
[0027] 解凍時，把OPS管從液氮中取出，將裝有卵母細胞的部分迅速溶于0.25M、38. 5°C 的蔗糖中，用口吸管將卵母細胞從OPS管吹出放于0. 25M的蔗糖中lmin，0. 15M的蔗糖中 5min，再