專利名稱：：精子的冷凍和解凍方法及精子的冷凍和解凍裝置的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫學中的輔助生育領域，涉及少量睪丸精子、附睪精子的冷凍和解凍方法以及用于上述方法中的裝置。
背景技術：
：現代輔助生育技術能對少精癥或無精癥患者(通過睪丸、附睪活檢獲得少量精子)進行卵細胞漿內單精子注射(Intracytoplasmicsperminjection,ICSI)治療而獲得子代。由于每個ICSI治療周期的妊娠率在35%-40%,為了獲得妊娠，部分患者需要重復數次ICSI治療。如果沒有對其精子凍存，每個周期都要排精或進行睪丸、附睪活檢。少精癥者精子不穩定，可能得不到精子以致本周期失敗，而睪丸、附睪活檢是創傷性手術，多次反復操作不但給患者帶來額外的心理壓力和經濟負擔，而且還可能造成睪丸、附睪組織纖維化，導致不可逆的睪丸萎縮、生精功能退化，甚至內分泌功能喪失而需要外源性睪酮替代治療。但如果能將排出的少量精子或睪丸、附睪活檢得到的精子冷凍，在平常或診斷性睪丸、附睪活檢時即可進行精子的制備和凍存，可以大大提高這類患者輔助生育治療的靈活性。中國專利申請200510061871.5號提供一種睪丸精子的凍存與復蘇方法，該發明提供睪丸精子的凍存與復蘇方法，以胞漿抽空的透明帶為載體，將活檢的睪丸精子裝入封閉的透明帶內，進行精子冷凍保護劑的添加和洗脫，凍存復蘇過程中精子封閉保存于透明帶內，該方法中透明帶精子復蘇不必經過繁鎖的不連續密度梯度分離及洗滌離心過程，可直接在顯微操作儀下吸出精子，直接用于ICSI。但是在上述方法中，以冷凍麥管，空透明帶、冷凍環等裝載精子，不少精子在操作過程中丟失，造成得到的精子數量少，活動力低，常規凍存復蘇后，往往難以找到活精子進行ICSI。因此，在臨床操作中凍存精子回收失敗甚至放棄冷凍是輔助生育臨床的常見問題。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種操作簡便、容易尋找精子、精子存活率高、精子回收率高的精子的冷凍和解凍方法，同時，也提供了一套用于上述方法中的裝置。本方法所述的步驟如下所述。一種精子的冷凍和解凍方法，其包含以下步驟(1)少量精子的冷凍制備含有甘油的冷凍液，恒濕條件下在冷凍片的片部上做一個微滴，顯微操作用針將少量精子放入微滴中，套上冷凍套，緩慢進入液氮蒸氣中，暴露5分鐘后，直接投入液氮，進行長期冷凍保存；(2)少量精子的解凍將冷凍片從液氮中取出，置入37攝氏度礦物油中復溫，鏡下尋找精子，用注射針將精子轉移至mHTF(人輸卵管液)微滴中備用。其中，實現步驟(1)中所述的恒濕條件需準備一個濕盒，該濕盒的上方設有一端開口的尾狀袖套，注射針桿可從該開口進入該濕盒內部，所述濕盒的底部由透明的材料制成。所述濕盒內加水以保持濕度。所述尾狀袖套由透明的、柔軟的或有彈性的薄膜制成。所述濕盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。其中，步驟(1)中的冷凍片包含一桿部以及一片部，所述片部為長片狀或者槽狀，所述的冷凍片以透明且較硬的材料制成。所述冷凍片由玻璃或者聚苯乙烯制成。當冷凍片為槽狀時，可在所述微滴上蓋油保濕。其中，在步驟(1)中，冷凍套內還設有用于維持恒濕條件的濕潤棉花。其中，在步驟(2)中，在冷凍片置入礦物油后，在冷凍片上放置一可壓住冷凍片的小重物。精子的冷凍和解凍裝置，其中，該裝置是一種可承載精子的冷凍片，所述冷凍片包含桿部和片部，所述片部為長片狀或者槽狀，所述的冷凍片以透明且較硬的材料制成。其中，為了達到更佳的效果，所述的精子的冷凍和解凍裝置還包括一種可以制造恒濕條件的濕盒，該濕盒的上方設有一端開口的尾狀袖套，注射針桿可從該開口進入該濕盒內部，所述濕盒的底部由透明的材料制成；其中，所述尾狀袖套由透明的、柔軟的或有彈性的薄膜制成。所述濕盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。其中，所述冷凍片由玻璃或者聚苯乙烯制成。本發明的主要優點是(1)精子置于微滴中，在油中解凍，精子不會丟失，精子回收率接近100%;(2)冷凍液中含有甘油，精子存活動率可達90%;(3)操作相比現有技術簡便易行。本發明很好地解決了目前精子凍存技術中出現的嚴重少弱精子、睪丸、附睪精子凍存后精子回收容易失敗的難題，使無精子癥患者接受輔助生育治療的靈活性極大提高。圖l為濕盒的結構示意圖2為注射針桿伸入濕盒,內的示意圖3為片部為長片狀的冷凍片的結構示意圖4為片部為槽狀的冷凍片的結構示意圖5為冷凍套的結構示意圖。主要符號含義:1濕盒2底部3尾狀袖套4注射針桿6冷凍片片部8片部9冷凍套10濕潤棉花具體實施例方式現依據附圖并結合實施例，對本發明做進一步的描述。首先請參見圖l及圖2所示，圖中為濕盒l，盒內加水以保持濕度，所述濕盒1的上方設有一端開口的尾狀袖套3，注射針桿4可從該開口進入所述濕盒1內部，所述濕盒1的底部2由聚苯乙烯制成。所述尾狀袖套3由透明塑料制成。請參見圖3及圖4所示，圖中為冷凍片6，所述冷凍片6包含桿部和片部，其中圖3中的冷凍片的片部7為長片狀，圖4中的冷凍片的片部8為槽狀。請參見圖5所示，圖中為冷凍套9，所述冷凍套9內空部分的底部設有濕潤棉花10。實施例1取少量正常排出的精子置入少量的改良人輸卵管液(mHTF)中，將放置精子的皿放入濕盒1內，在冷凍片6的片部7上做一個冷凍液微滴，顯微操作用針吸取20個精子放入微滴中，此時，檢視凍前存活率，然后在冷凍片6上套上預先濕潤的冷凍套9，將冷凍套9緩慢放入液氮蒸氣，暴露5分鐘后，直接投入液氮，進行長期冷凍保存。復蘇時，在液氮中取下冷凍套9，將冷凍片6置入37攝氏度礦物油中，緩慢移動，剪刀剪下冷凍片6的片部7，將小重物(未圖示)靠近冷凍液微滴壓住冷凍片6。倒置顯微鏡下用注射針吸走精子放入mHTF微滴中備用，此時檢視凍后的存活率。實施例2將活檢取出的曲細精管置入少量的改良人輸卵管液(mHTF)中，曲細精管經彎頭鑷子碾碎，將該放置曲細精管的皿放入中的濕盒1內，在冷凍片6的片部8內做一個冷凍液微滴，加礦物油覆蓋保濕，用注射針吸取10個精子放入微滴中，此時，檢視凍前存活率，然后在冷凍片6上套上預先濕潤的冷凍套9，將冷凍套9緩慢放入液氮蒸氣，暴露5分鐘后，直接投入液氮，進行長期冷凍保存。復蘇時，在液氮中取下冷凍套9，將冷凍片6置入37攝氏度礦物油中，緩慢移動以復溫，剪刀剪下冷凍片6的片部8，將小重物(未圖示)靠近冷凍液微滴壓住冷凍片6。倒置顯微鏡下用注射針吸走精子放入mHTF微滴中備用，此時檢視凍后的存活率。實施例3將活檢取出的曲細精管置入少量的改良人輸卵管液(mHTF)中，曲細精管經彎頭鑷子碾碎，將該放置曲細精管的皿放入中的濕盒1內，在冷凍片6的片部8內做二個冷凍液微滴，加礦物油覆蓋保濕，用注射針吸取20個精子放入微滴中，此時，檢視凍前存活率，然后在冷凍片6上套上預先濕潤的冷凍套9，將冷凍套9緩慢放入液氮蒸氣，暴露5分鐘后，直接投入液氮，進行長期冷凍保存。復蘇時，在液氮中取下冷凍套9，將冷凍片6置入37攝氏度礦物油中，緩慢移動以復溫，剪刀剪下冷凍片6的片部8，將小重物(未圖示)靠近冷凍液微滴壓住冷凍片6。倒置顯微鏡下用注射針吸走精子放入mHTF微滴中備用，此時檢視凍后的存活率。實驗結果請見下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在上述實施例中，在濕盒上方設置尾狀袖套是因為在具體操作時較柔軟的尾狀袖套可以鎖住注射針桿，以使濕盒內保持相對封閉的狀態，同時濕盒可隨載物臺做小范圍移動。所述濕盒的底部采用透明的材料制成是為了不影響觀察。所述的冷凍片也要求用透明的材料制成是由于冷凍片作為精子的載體若不透明很難在操作中找尋精子。具體操作中用到的小重物是為了壓住冷凍片防止其移動之用。無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發明。因此，前面的優選具體實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。權利要求1、一種精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，其包含以下步驟(1)少量精子的冷凍制備含有甘油的冷凍液，恒濕條件下在冷凍片的片部上做一個微滴，顯微操作用針將少量精子放入微滴中，套上冷凍套，緩慢進入液氮蒸氣中，暴露5分鐘后，直接投入液氮，進行長期冷凍保存；(2)少量精子的解凍將冷凍片從液氮中取出，置入37攝氏度礦物油中復溫，鏡下尋找精子，用注射針將精子轉移至人輸卵管液微滴中備用。2、如權利要求1所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，步驟(1)中的冷凍片包含一桿部以及一片部，所述片部為長片狀或者槽狀。3、如權利要求2所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，當冷凍片為槽狀時，可在所述微滴上蓋油保濕。4、如權利要求2所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述的冷凍片以透明且較硬的材料制成。5、如權利要求4所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述冷凍片由玻璃或者聚苯乙烯制成。6、如權利要求1-3任意一項所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，實現步驟(1)中所述的恒濕條件需準備一個濕盒，該濕盒的上方設有一端開口的尾狀袖套，注射針桿可從該開口進入該濕盒內部，所述濕盒的底部由透明的材料制成。7、如權利要求6所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述濕盒內加水以保持濕度。8、如權利要求6所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述尾狀袖套由透明的、柔軟的或有彈性的薄膜制成。9、如權利要求6所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述濕盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。10、如權利要求1所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，其中，在步驟(1)中，冷凍套內還設有用于維持恒濕條件的濕潤棉花。11、如權利要求1所述的精子的冷凍和解凍方法，其特征在于，在步驟(2)中，在冷凍片置入礦物油后，在冷凍片上放置一可壓住冷凍片的小重物。12、一種用于權利要求1所述方法的精子的冷凍和解凍裝置，其特征在于，該裝置為一種可承載精子的冷凍片，所述冷凍片包含桿部和片部，所述片部為長片狀或者槽狀，所述的冷凍片以透明且較硬的材料制成。13、如權利要求12所述的精子的冷凍和解凍裝置，其特征在于，所述的精子的冷凍和解凍裝置還包括一種可以制造恒濕條件的濕盒，該濕盒的上方設有一端開口的尾狀袖套，注射針桿可從該開口進入該濕盒內部，所述濕盒的底部由透明的材料制成。14、如權利要求13所述的精子的冷凍和解凍裝置，其特征在于，所述尾狀袖套由透明的、柔軟的或有彈性的薄膜制成。15、如權利要求13所述的精子的冷凍和解凍裝置，其特征在于，所述濕盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。16、如權利要求12所述的精子的冷凍和解凍裝置，其特征在于，所述冷凍片由玻璃或者聚苯乙烯制成。全文摘要本發明提供一種操作簡便、容易尋找精子、精子存活率高、精子回收率高的精子的冷凍和解凍方法，同時，也提供了一套用于上述方法中的裝置。本發明的主要優點是(1)精子置于微滴中，在油中解凍，精子不會丟失，精子回收率接近100％；(2)冷凍液中含有甘油，精子存活動率可達90％；(3)操作相比現有技術簡便易行。本發明很好地解決了目前精子凍存技術中出現的嚴重少弱精子、睪丸、附睪精子凍存后精子回收容易失敗的難題，使無精子癥患者接受輔助生育治療的靈活性極大提高。文檔編號C12M3/00GK101671651SQ20081004269公開日2010年3月17日申請日期2008年9月9日優先權日2008年9月9日發明者匡延平,彭秋平申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院