小黃魚精子冷凍保存液及小黃魚精子冷凍保存方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及小黃魚精子冷凍保存液及小黃魚精子冷凍保存方法。
【背景技術】
[0002]小黃魚(Larimichthys polyactis)是我國重要經濟魚類，在我國沿海均有分布，由于地理隔離已經形成了包括山東青島、江蘇啟東、浙江舟山和福建寧德等幾個地理種群。小黃魚生性敏感，極易受驚，遠距離運輸死亡率極高，難易運用常規方法使不同地理種群進行自然交配達到雜交育種的目的。而魚類精子超低溫凍存則是解決這一難題的有效途徑:將某一地理群體的雄性小黃魚精液進行冷凍保存，然后再與另一種群雌性小黃魚進行人工授精，即可達到雜交育種的目的。
[0003]小黃魚精子冷凍保存技術還在魚類種質資源保護、遠緣雜交和魚類的雌核發育、雄核發育等方面具有應用參考價值。
[0004]不同魚類的精子對外界環境的敏感性不同，其冷凍方式和復溫方法均會大幅影響精子的活力。目前魚類多采用離心管和麥細管進行冷凍保存，但在降溫和復溫的過程中，管中心位置的溫度變化與管壁并不同步，會降低精子復活后的活力，從而導致受精率和孵化率的下降。

【發明內容】

[0005]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供小黃魚精子冷凍保存液及小黃魚精子冷凍保存方法的技術方案。
[0006]所述的一種小黃魚精子冷凍保存液，其特征在于由保存液和抗凍劑組成，所述的保存液由氯化鈉6?10g，氯化鉀0.2?0.6g，氯化鈣0.3?0.7g，檸檬酸鈉0.1?0.4g，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML得到；所述的抗凍劑包括甘油和乙二醇；所述的保存液:甘油:乙二醇的體積比為85?95:6?10:1?5。
[0007]所述的一種小黃魚精子冷凍保存液，其特征在于所述的保存液由氯化鈉7?9g，氯化鉀0.3?0.5g，氯化鈣0.4?0.6g，檸檬酸鈉0.2?0.3g，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML得到。
[0008]所述的一種小黃魚精子冷凍保存液，其特征在于所述的保存液:甘油:乙二醇的體積比為88?92:7?9:2?4。
[0009]利用一種小黃魚精子冷凍保存液進行小黃魚精子的冷凍保存方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)挑選性腺發育良好的雄性小黃魚，用純水沖洗其生殖孔后擦干，輕壓其腹部，用一次性吸管收集精液；
(2)將收集的小黃魚精液用小黃魚精子冷凍保存液按1:4的比例稀釋，制成混合液；
(3)準備一塊長10cm，寬5cm的醫用紗布； (4)將其置于高壓滅菌鍋內滅菌30min；
(5)將5ml的混合液均勻噴在醫用紗布上，紗布應雙面噴灑；
(6)將紗布置于0°C環境下，保持伸展狀態，穩定1min；
(7)將紗布置于-80°C冰箱內，保持伸展狀態，穩定8min；
(8)將紗布直接投入液氮罐內，應置于液面以下-196°C冷凍保存，得到小黃魚冷凍精液。
[0010]所述的冷凍保存方法，其特征在于所述的小黃魚冷凍精液的使用步驟如下；設定供箱溫度為43 C，待供箱溫度穩定后，將液氣冷凍后的紗布置于一 1000ML燒杯中，放入43°C烘箱3min 1s后取出即可。
[0011]本發明以紗布為平面，無論是降溫，還是復溫，精液的溫度變化都很均勻，保證了精子活力的一致性。采用本發明的冷凍保存液及方法進行冷凍保存的精子復活后能夠保持鮮精活力，利用復活的精子進行受精后，受精率達到85%以上，孵化率達到79%以上。
【具體實施方式】
[0012]為了使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限止本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按常規實驗方法進行。
[0013]實施例1:一種小黃魚精子冷凍保存液的制備
該冷凍保存液由小黃魚精子保存液和抗凍劑組成，其中小黃魚精子保存液的配制方法為:氯化鈉Sg，氯化鉀0.4g，氯化鈣0.5g，檸檬酸鈉0.2g，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML ;抗凍劑為甘油和乙二醇；將小黃魚精子保存液、甘油和乙二醇按體積比90:8:2的比例混合，即得到小黃魚精子冷凍保存液。
[0014]實施例2:—種小黃魚精子冷凍保存液的制備
該冷凍保存液由小黃魚精子保存液和抗凍劑組成，其中小黃魚精子保存液的配制方法為:氯化鈉6g，氯化鉀0.2g，氯化鈣0.3g，檸檬酸鈉0.lg，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML ;抗凍劑為甘油和乙二醇；將小黃魚精子保存液、甘油和乙二醇按體積比85:10:5的比例混合，即得到小黃魚精子冷凍保存液。
[0015]實施例3:—種小黃魚精子冷凍保存液的制備
該冷凍保存液由小黃魚精子保存液和抗凍劑組成，其中小黃魚精子保存液的配制方法為:氯化鈉10g，氯化鉀0.6g，氯化鈣0.7g，檸檬酸鈉0.4g，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML ;抗凍劑為甘油和乙二醇；將小黃魚精子保存液、甘油和乙二醇按體積比92:7:I的比例混合，即得到小黃魚精子冷凍保存液。
[0016]實施例4:小黃魚精子的冷凍保存方法
(1)挑選性腺發育良好的雄性小黃魚，用純水沖洗其生殖孔后擦干，輕壓其腹部，用一次性吸管收集精液；
(2)將收集的小黃魚精液用實施例1制得的小黃魚精子冷凍保存液按1:4的比例稀釋，制成混合液；
(3)準備一塊長10cm，寬5cm的醫用紗布；
(4)將其置于高壓滅菌鍋內滅菌30min； (5)將5ml的混合液均勻噴在醫用紗布上，紗布應雙面噴灑；
(6)將紗布置于0°C環境下，保持伸展狀態，穩定1min；
(7)將紗布置于-80°C冰箱內，保持伸展狀態，穩定8min；
(8)將紗布直接投入液氮罐內，應置于液面以下_196°C，48h后取出進行復活實驗；
(9)小黃魚冷凍精液的復活:設定烘箱溫度為43°C，待烘箱溫度穩定后，將該實施例得到的液氮冷凍后的紗布置于一 1000ML燒杯中，放入43°C烘箱3min 1s后取出，即可；
(10)挑選性腺發育良好的雌性小黃魚，用純水沖洗其生殖孔后擦干，輕壓其腹部，采集卵子；
(11)取100ML新鮮卵子置于放有解凍后紗布的燒杯中；
(12)向燒杯中加入500ML20°C新鮮海水，期間不停攪拌，使紗布與卵子充分接觸；
(13)30s后取出紗布，擰干；
(14)向燒杯中加水至800ML；
(15)Ih后統計其受精率為8