至67位氨基酸編碼序列， 第2188至第2217位為柔性linker和his標簽編碼序列，第7位至第63位為化bA信號膚 編碼序列。巧PA4573?t蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 58所示。第1位至第19位為化bA 信號膚，第22位至第50位、第291位至第319位、第699位至第727位為Pi化的第45至 73位氨基酸，第694至698位為柔性linker,第728至736位為柔性linker和his標簽序 列。
[0316] 用EcoR I和化nd III雙酶切沈Q ID No. 57所示的DNA分子，得到基因片段；用 EcoR I和化nd III雙酶切PMMB66EH，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到 重組質粒，命名為pMMB66EH-rEPA4573NM"將重組質粒pMMB66EH-rEPA4573NMe送測序，結果均 正確。
[0317] (S)糖基工程福氏志賀氏菌的制備
[0318] 按照步驟二中（S)的糖基工程福氏志賀氏菌的制備方法，分別構建糖基工程菌 S.f Iexneri 2a 301 ApCP A waaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-;rCTB45732和 S.f Iexneri 2a 301 A pCP A waaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573眶。
[0319] (四）rCTB45732和巧PA4573 WMC在糖基工程福氏志賀氏菌中的糖基化修飾與檢測 陽32〇]挑取糖基工程菌 S. f Iexneri 2a 301 A pCP A waaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rCTB45732和 S.flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA4573?t單克隆，接種于含有終濃度為100 y g/mL氨節青霉素和50 y g/mL卡 那霉素的LB培養基，37°C培養至ODe。。約為0. 6時，加入終濃度為ImM的IPTG，并降溫至16°C 誘導20h。 陽32U 次日取上述16°C誘導20h的菌液1血，離屯、取各菌體，用IX還原樣緩懸起，沸水浴 lOmin，用SDS-PAGE電泳，電泳完畢后用Bio-L油半干轉轉印儀將蛋白轉至PVDF膜上，20V 恒壓轉印比，用Anti-His tag鼠單克隆抗體檢測，結果如圖10所示。 陽32引 同時 W S. f Iexneri 2a 301 A pCP A waaI/pMMB66EH-rCTB45732^ S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pMMB66EH-;rEPA4573(^Me、S.flexne;ri 2a 301 ApCPAwaaI/ 祀Ttac28-pglL/pMMB66EH-;rCTB4573、S. flexneri 2a 301 ApCP A waaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA4573、S. flexneri 2a 301 ApCP A waaI/pMMB66EH-rCTB4573、S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pMMB66EH-rEPA4573 作為對照。 陽32引 圖 10 表明，糖基工程菌 S. flexneri 2a 301 ApCP AwaaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rCTB45732 和 S. flexneri 2a 301 ApCP AwaaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA4573?e表達的重組融合蛋白rCTB4573、rEPA4573發生O糖基化修飾，同時加 入多個糖基化位點后，出現多簇糖基化條帶表明多個位點均有效糖基化。
[0324] 屯、一步生物交聯法制備福氏志賀氏菌0抗原多糖-重組TTC融合蛋白結合物 陽325]( -）重組TTC融合蛋白表達載體的構建
[0326] 根據GeneBack公布的破傷風毒素C蛋白（AF154828. 1)氨基酸序列，在其N端融 合化bA信號膚，C端融合Pla的多膚（即Pi化的S45~K73)和6X化S tag標簽，構建重 組破傷風毒素C蛋白的融合蛋白rTTC4573。 陽327] rTTC4573的編碼基因序列如SEQ ID No. 59所示，其中自5'末端起第64位至第 1371位為TTC編碼序列，第1387位至第1473位為Pi化的第45至67位氨基酸編碼序列， 第7位至第63位為化bA信號膚編碼序列。
[0328] rTTC4573蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 60所示，自N端起第20至第455位為 TTC氨基酸序列，第461至第489位為Pi化的第45至73位氨基酸，第490至第498位為柔 性linker和his標簽，第1位至第19位為化bA信號膚序列。 陽329] 用EcoR I和化nd III雙酶切SEQ ID No. 59所示的DNA分子，得到基因片段；用 EcoR I和化nd III雙酶切PMMB66EH，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到 重組質粒，命名為pMMB66EH-rTTC4573,將pMMB66EH-rTTC4573送測序，結果正確。
[0330](二）糖基工程福氏志賀氏菌的制備 陽33U 將 pMMB66EH-rTTC4573 轉化 S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pETtac28-pglL， 構建糖基工程福氏志賀氏菌 S. flexneri 2a 301 ApCP A waaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rTTC4573〇 陽332] ( = ) rTTC4573在糖基工程福氏志賀氏菌中的糖基化修飾與檢測 陽33引 挑取糖基工程菌 S. flexneri 2a 301 ApCP A waaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rTTC4573單克隆，接種于含100 y g/mL氨節青霉素和50 y g/mL卡那霉素的LB培 養基中，37°C培養至ODe。。約為0. 6時，加入終濃度為ImM的IPTG，并降溫至25°C誘導20h。 陽334]同時 Ws. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pMMB66EH-rTTC4573 進行上述誘導實 驗，作為對照。
[0335] 次日取上述25°C誘導20h的菌液1血，離屯、取各菌體，用IX還原樣緩懸起，沸水浴 lOmin，用SDS-PAGE電泳，電泳完畢后用Bio-L油半干轉轉印儀將蛋白轉至PVDF膜上，20V 恒壓轉印比，用Anti-His tag鼠單克隆抗體檢測，結果如圖11所示。 陽336] 圖11表明，底物蛋白巧TC4573在寡糖轉移酶PglL的存在下，發生0糖基化修飾。 陽337] 實施例2、一步生物交聯法制備甲型副傷寒沙口氏菌0多糖-重組CTB融合蛋白 陽33引 一、O-抗原連接酶基因waaL缺陷的甲型副傷寒沙口氏菌的制備
[0339] (一）線性打祀DNA片段的制備
[0340] 1、PCR引物的設計和合成 陽341] 依據NCBI上甲型副傷寒沙口氏菌50973株（S.paratyphi CMCC50973)全基因 組序列（NC_006511)中所列 WaaL 基因（GeneBank 號為 CP000026 的第 3 位）及其上、下游序列，在WaaL基因的上游（5'端）和下游（3'端）各設計一對引物，即 73waaLul/73waaLu2和73waaLdl/73waaLd2。為了方便操作，限制性酶切位點BamH I和 Sal I將被添加到上游同源臂UP的引物末端，限制性酶切位點化ndin和化O I被添加到下 游同源臂down的引物末端。 陽342] 同時，為了驗證突變體是否夠構建成功，設計了基因組上WaaL基因上下游同源臂 W外的一對引物（73waaLwl/73waaLw2)，內部檢測引物（73waaLnl/73waaLn2) W及kan基因 引物化anl/Kan2)進行PCR驗證，同時進行測序驗證。
[0343] 上述引物如表2所示。
[0344] 表2引物列表2
[0345]
[0346] 表2中的下劃線所示的序列為酶切識別位點。
[0347] 2、線性打祀DNA片段的構建
[0348] 1) W甲型副傷寒沙口氏菌50973株基因組DNA為模板，用73waaLul/73waaLu2和 73waaLdl/73waaLd2分別擴增出WaaL基因的上下游同源臂up和down。
[0349] PCR 程序如下：94°C IOmin ;94°C 30s，50°C 30s，72°C 30s，30 個循環；72°C lOmin。
[0350] 2)祀TKan的構建同實施例1。 陽351] 3)BamH I和Sal I雙酶切up片段，得到基因片段3巧amH I和Sal I雙酶切質粒 祀TKan,得到載體大片段3 ;將基因片段3與載體大片段3連接，得到中間載體3 ; 陽352] 化ndin和化O I雙酶切down片段，得到基因片段4 ;化ndin和化O I雙酶切中間 載體3,得到載體大片段4 ;將基因片段4與載體大片段4連接，得到中間載體4。 陽35引 4)用BamH I和化O I雙酶切中間載體4,得到兩側為同源臂中間含kan基因的目 的打祀DNA片段，該片段的核巧酸序列如SEQ ID No. 71所示。 陽354] SEQ ID No. 71中自5'末端起第7-571位核巧酸為up片段，第578-2073位核巧酸 為kan基因，第2080-2543位核巧酸為down片段。 陽355] W沈Q ID No. 71所示的DNA片段為模板，W 73waaLul和73waaLd2為引物，再次 PCR擴增打祀片段，即可獲得濃度高達30化g/ y L的線性打祀DNA片段。 陽356] (二）S. paratyphi CMCC50973/地OBEG 的構建 陽357] 由于地OBEG質粒含有編碼A -Red重組系統所需各種酶，將地OBEG質粒電擊轉化 至甲型副傷寒沙口氏菌50973感受態細胞中，涂于氯霉素抗性（pKOBEG質粒的抗性，氯霉 素）的LB平板上，30°C培養過夜，得到的陽性克隆，將其命名為S. paratyphi 50973/地OBEG 菌株。 陽35引 （S )線性打祀DNA片段電擊轉化S. paratyphi 50973/地OBEG 陽359] 1、將S. paratyphi CMCC50973/地OBEG接種于含終濃度為30 y g/mL氯霉素低鹽LB 液體培養基30°C培養過夜，并按照體積比1:100將其傳代于低鹽LB液體培養基，繼續培養。 陽360] 2、在步驟1的培養液在ODe。。值達到0. 6前Ih加入終濃度為1mmol/L的k阿拉 伯糖誘導Red重組系統的表達。
[0361] 3、待步驟2的培養液0〇6。。值為0. 6時，取步驟（一）制備得到的30化g/ y L的線 性打祀 DNA 片段 5 y L 電擊轉化 S. paratyphi CMCC50973/地0BEG。
[0362] 4、在轉化后的細胞中快速加入提前預冷的ImL低鹽LB液體培養基，30°C復蘇2.化 左右，然后涂布于含有50ug/mL卡那霉素的LB平板，放于30°C培養箱培養過夜，篩選出陽性 克隆。 陽363] 5、將陽性克隆接種于液體LB培養基（有卡那霉素抗性，濃度為50 y g/mL)中， 42°C培養傳代兩次（每次培養1化時間），即可除去地OBEG質粒，最終獲得含卡那霉素抗性 WaaL 缺失突變株，將其命名為 S. paratyphi CM(X50973 waaL: :kan。 陽364](四）將編碼FRT位點特異性重組酶的質粒pCP20電擊轉入S. paratyphi CM(X50973 waaL: :kan，在含50ug/mL氯霉素及不含卡那霉素的LB平板上30°C培養，篩選 CnfKmS(氯霉素抗性、卡那霉素敏感）的陽性克隆。 陽3化](五）將步驟（四）篩選到的陽性克隆，轉入液體LB中42°C培養12小時，即可獲 得不含卡那霉素和質粒PCP20的目的基因缺失突變株，將其命名為S. paratyphi CM(X50973 AwaaU即為脂多糖合成缺陷的甲型副傷寒沙口氏菌。 陽366]二、S. paratyphi CM(X50973 A WaaL 的分子鑒定 陽367]分別 W S. paratyphi CMCC50973、S. paratyphi CMCC50973 AwaaL 基因組 DNA為模板，分別用一對waaL內部引物（73waaLnl/73waaLn2)，一對waaL外部引物 (73waaLwl/73waaLw2)和 kan 引物化anl/kan2)進行 PCR 驗證。
[0368] 結果如圖12所示。
[0369] 圖 12 中，50973 AwaaL 代表 S. paratyphi CMCC50973 AwaaL ;50973 代表 S. paratyphi CM(X50973d
[0370] 圖 12 表明，W S. paratyphi CMCC50973 AwaaL 的基因組 DNA 為模板，^waaL 內 部引物為引物進行PCR擴增，沒有目的條帶；而W S. paratyphi CM(X50973的基因組DNA 為模板，W WaaL內部引物為引物進行PCR擴增，具有目的條帶。并且由于S. paratyphi CMCC50973 AwaaL 敲除了 waaL 基因，W S. paratyphi CMCC50973 AwaaL 的基因組 DNA 為 模板，W WaaL外部引物為引物進行PCR擴增得到的條帶比W S. paratyphi CMCC50973的基 因組DNA為模板，W WaaL外部引物為引物進行PCR擴增得到的條帶小。由于最終去除了 Kan抗性基因，W S. paratyphi CM(X50973 AwaaL的基因組DNA為模板，Wkan引物為引物 進行PCR擴增，沒有目的條帶。 陽37U 上述結果證明成功構建WaaL基因缺失、無抗生素基因的甲型副傷寒沙口氏菌 50973 突變株 S. paratyphi CM(X50973 A waaL。 陽37引 S、S. paratyphi CM(X50973 A waaL 的表型鑒定
[0373] 取I血S. paratyphi CMCC50973 AwaaL的37°C過夜培養物，離屯、收集菌體，用PBS 洗一次，加入100 y L裂解緩沖液（該裂解液由10% SDS 2血，2-琉基乙醇0. 4血，100 %甘 油1血，2M P冊.8的Tris-肥L 5血，10%漠酪藍20 y L，d地2〇 1. 6血混勻得到）充分混勻， 沸水煮10分鐘，加4 y L20mg/血的蛋白酶K的水溶液，60°C反應1至2小時，，得到裂解液； 取裂解液15ul上樣，進行SDS-PAGE電泳，將膠于固定液中放置過夜，加入增敏液作用30分 鐘，用去離子水洗3次，每次15分鐘，加硝酸銀溶液作用20分鐘，用去離子水洗2次，每次 1分鐘，加顯影液進行顯色，最后終止反應，用去離子水洗。
[0374] 同時W S. paratyphi CM(X50973進行上述實驗，作為對照。 陽375] 結果如圖13所示。 陽376] 圖 13 中，50973 AwaaL 代表 S. paratyphi CMCC50973 AwaaL ;50973 代表 S. paratyphi CM(X50973。
[0377] 圖13表明，野生株S. paratyphi CM(X50973有ladder形式的條帶，而突變株因敲 除了 0-抗原連接酶基因waaU由于WaaL的功能是將0抗原多糖（OP巧連接到類脂A-核屯、 寡糖上形成脂多糖（LP巧，所W沒有ladder形式的條帶。
[0378] 四、一步生物交聯法制備甲型副傷寒沙口氏菌0多糖-重組EPA融合蛋白結合物
[0379] ( 一）糖基工程甲型副傷寒沙口氏菌S. paratyphi QVKX5O973 A WaaL/ 祀Ttac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573 的構建 陽380] 先后將載體祀Ttac28-pglL和pMMB66EH-rEPA4573電擊轉化宿主菌S. paratyphi CM(X50973 A waaU涂布含有終濃度為50 y g/mL卡那霉素和100 y g/mL氨節青霉素的LB 雙抗固體培養基，長出的克隆即為糖基工程甲型副傷寒沙口氏菌S. paratyphi CM(X50973 A waaL/祀Ttac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573。 陽3W](二）重組EPA融合蛋白的糖基化修飾與檢測 陽3扣]挑取糖基工程菌 S. paratyphi CMCC50973 AwaaL/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA4573單克隆，接種于含有終濃度為100 y g/mL氨節青霉素和50 y g/mL卡那 霉素的LB培養基，37°C培養至ODe。。約為0. 6時，加入終濃度為ImM的IPTG，并降溫至25°C 誘導20h，得到糖蛋白巧PA-OPSspty日。973。 陽38引次日取上述25°C誘導20h的菌液1血，離屯、取菌體，用IX還原樣緩懸起，沸水浴 lOmin，用8%的SDS-PAGE電泳，電泳完畢后用Bio-L油半干轉轉印儀將蛋白轉至PVDF膜 上，20V恒壓轉印比，用anti-EPA抗體進行western-blot檢測。 陽384] 同時 W 轉入 pMMB66EH-rEPA4573 而不轉祀Ttac28-pglL 的 S. paratyphi CMCC50973 AwaaL 構建得到的 S. paratyphi CMCC50973 A waaL/pMMB66EH-rEPA4573 為對 照，進行上述誘導實驗，作為對照。 陽385] 結果如圖14所示。 陽386] 圖14表明，底物蛋白巧PA4573在寡糖轉移酶PglL的存在下，發生0糖基化修飾。 陽387] 五、一步生物交聯法制備甲型副傷寒沙口氏菌O多糖-重組CTB融合蛋白結合物 陽388]( 一）糖基工程甲型副傷寒沙口氏菌S. paratyphi CM(X50973 A WaaL/ 祀Ttac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573 的構建 陽389] 先后將載體祀Ttac28-pg化和pMMB66EH-rCTB4573電擊轉化宿主菌S. paratyphi CM(X50973 A waaU涂布含有終濃度為50 y g/mL卡那霉素和100 y g/mL氨節青霉素的LB 雙抗固體培養基，長出的克隆即為糖基工程甲型副傷寒沙口氏菌S. paratyphi CM(X50973 A waaL/祀Ttac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573。 陽390](二）重組CTB融合蛋白的糖基化修飾與檢測 陽391]挑取糖基工程菌 S. paratyphi CM(X50973 AwaaL/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rCTB4573單克隆，接種于含有終濃度為100 y g/mL氨節青霉素和50 y g/mL卡那 霉素的LB培養基，37°C培養至ODe。。約為0. 6時，加入終濃度為ImM的IPTG，并降溫至16°C 誘導 20h，得到糖蛋白 rCTB-0PSspty5<B73。 陽39引次日取上述16°C誘導20h的菌液1血，離屯