the Interaction between the Chromosome and a Virulence Plasmid, Journal of Rroteome Research, 2010, 9 (2) :843-854"中公開過，公眾 可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，該質粒為溫度敏感型質粒，氨 節青霉素抗性。
[0116] PMD18-T 購自 TaKaRa 公司，貨號為 D101A。
[0117] pET-22b質粒購自Novagen公司，產品目錄號為69744。
[0118] 地OBEG 質粒在文獻"A rapid method for efficient gene r巧Iacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans[J]. Nucleic Acids Res. 2000 NovlS ； 28 (22) :E97"中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，該 質粒為溫度敏感型質粒，氯霉素抗性。
[0119] pCP20 質粒在文獻"Datsenko, K. A. and B. L. Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J]. Proc. natl. Acad. Sci. U. S. A, 2000, 97(12) :6640-6645"中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學 科學院生物工程研究所獲得，氯霉素抗性。
[0120] pET28a (+)購自 Novagen。 陽 12U PMMB66邸購自 ATCC，編號為 ATCC 37620。
[0122] P邸3 在文獻"Datsenko, K. A. and B. L. Wanner, One-St巧 inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(12) :p. 6640-5。"中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院 生物工程研究所獲得。
[0123] P邸46 質粒在文獻"Datsenko, K. A. and B. L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(12) :p. 6640-5。"中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院 生物工程研究所獲得。PKD46的復制子對溫度敏感，37°C培養時丟失，此質粒含有編碼Red 重組的=個重組酶，由阿拉伯糖啟動子控制。 陽124] PACYC184在文獻"于梅，周建光，陳偉，等.一種可轉移的重組工程系統pYM-Red 的建立[J].生物化學與生物物理進展，2005, 32(4) :359-364."中公開過，公眾可從中國人 民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得。
[01巧]Anti-His tag鼠單克隆抗體購自Sigma,貨號為A7058。 陽126] anti-EPA抗體購自Sigma,貨號為P2318。
[0127] 兔源Anti-OPSsfWi抗血清（福氏志賀菌2a型抗血清）購自日本生研株式會化編 號為 210227。
[0128] 兔源抗大腸桿菌0157抗血清購日本生研株式會社，編號為210753。 陽129] HRP-羊抗兔IgG購自TransGen公司，編號為服-101-01。 陽130] C肥LATING SEPH 6 FF親和層析柱購自GE Healthcare,產品目錄號為 17-5203-06。 陽131] G25層析填料購自GE Healthcare。
[0132] Protein化k DEAE細R陽離子交換層析柱購自Waters。
[0133] Superdex 75 FPLC 層析柱購自 GE Healthcare,產品目錄號為 17-1047-01。 陽134] 雌性Ba化/c小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中屯、。
[0135]福氏志賀氏菌 2a 301 野生株僅 fIexneri 2a 301)在文獻"Genome sequence of Shigella flexneri 2a:insights into pathogenicity through comparison with genomes of Escherichia coli K12 and 0157，Nucl. Acids Res2002, 30(20):4432-4441" 中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得。
[0136] 甲型副傷寒沙口氏菌50973株（S. paratyphi CMCC50973)購自中國醫學細菌保藏 管理中屯、。 陽137] E. COli W3110在文獻"于梅，李山虎，陳偉，等.用Red介導的同源重組結合酶 切改構質粒DNA[J].軍事醫學科學院院刊，2005, 29 (3) : 241-243."中公開過，公眾可從中 國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得。
[0138] 氨氧化侶佐劑Rehy化agel LV購自General Qiemical公司。
[0139] 實施例1、一步生物交聯法制備福氏志賀氏菌0-糖基化修飾的重組融合蛋白及其 疫苗
[0140] 志賀氏菌（Shigella SPP.)俗稱頻疾桿菌，作為一種具有高度傳染性的革蘭氏 陰性腸道致病菌，主要通過侵入人結腸上皮細胞最終定位于大腸，而引起典型細菌性頻疾 (發熱、腹痛、里急后重、大便脈血），而毒力大質粒則是其致病性的最主要的因素，毒力大 質粒包含有大概32個與毒力有關的基因，主要包括與III型分泌系統有關的mxi-spa基 因、與細菌侵入上皮細胞密切相關的ipaBCD W及ipgC等毒力基因。為了將其開發為安全 的宿主菌，必須先將其編碼毒力因子的大質粒pCP去除，在此基礎上再將0抗原連接酶基因 waal缺陷，從而開發成適于本發明的宿主菌。 陽141] 一、宿主菌的改造 陽142]( -）毒力大質粒缺失株S.fIexneri 2a 301 ApCP的構建
[0143] 1、福氏志賀氏菌2a 301野生株感受態的制備
[0144] 1)將福氏志賀氏菌2a 301野生株（S. fIexneri 2a 301)接種于LB液體培養基 中，30°C過夜培養后，將Iml培養液轉接到100血低鹽LB液體培養基中，30°C培養至ODe。。達 到 0. 6。
[0145] 2)離屯、收集菌體，用滅菌的體積百分含量為10%甘油的水溶液洗涂四次，最后 用400UL滅菌的體積百分含量為10%甘油的水溶液重懸細菌，即可獲得電擊轉化用的 S.fIexneri 2a 301感受態細胞，分裝待用。 陽146] 2、毒力大質粒的缺失 陽147] 1) inc是志賀氏菌毒力大質粒pCP上與其復制相關的一段序列片段，將帶有inc片 段的地Dinc重組質粒電轉導入步驟1制備的S. fIexneri 2a 301感受態細胞中，得到中間 重組菌，將其命名為S. flexneri 2a 301/p邸inc。
[0148] 2)將S. flexneri 2a 301/p邸inc在含有濃度為50 y g/血的氨節青霉素的LB液 體培養基中連續傳代3次W上，W保證毒力大質粒的丟失，之后將培養的菌液涂布在氨節 青霉素抗性的LB固體培養基上，待長出單菌落之后，提取單菌落的基因組DNA，W其為模 板，分別W ipaA、ip濁、mxiD、VirG的引物為引物，進行PCR擴增，通過驗證毒力基因ipaA、 ip濁、mxiD、virG檢測毒力大質粒pCP是否丟失，同時Ws. flexneri 2a 301的基因組DNA 為對照，進行上述PCR擴增。 陽149] ipaA的引物如下： 陽 1 加 ]ipaApl:5, -AAGATTCTGCCTTTGGACC-3'（沈Q ID No. 1) 陽15U ipaAp2:5,-GTGGTTGAAGAGTTCTGTATG-3'（沈Q ID No. 2) 陽152] ip濁的引物如下： 陽 15引 ip濁 1U:5'-TGCTTTGACGGTATACAGC-3'(沈Q ID No. 3) 陽 154] ip濁 1L:5'-ACTTCCACAGGTTGAATTCG-3'（沈Q ID No. 4) 陽155] mxiD的引物如下： 陽K6] mxiDU:5>-AAGCAGGTTTCTTCTATTGG-3'（沈Q ID No. 5) 陽 157] mxiDL:5,-GAACACATTACCGATTACAGG-3'（沈Q ID No. 6) 陽158] VirG的引物如下： 陽 159] VirGpl:5,-CATCAATCCGTTACTCACT-3'（沈Q ID No. 7)
[0160] VirGp2:5,-ACTACCAGCAACAATACG-3,（SEQ ID No. 8) 陽161] 結果如圖IA所示。
[0162] 圖IA中，301代表福氏志賀氏菌2a 301野生株S. f Iexneri 2a 301 ;301 ApCP代 表步驟2)篩選的單菌落。 陽16引 圖IA表明，在福氏志賀氏菌2a 301野生株中，ipaA、ip濁、mxiD、virG基因都出現 了目的擴增片段，分別為888bp的ipaA目的片段、595bp的ip濁目的片段、986bp的mxiD 目的片段、777bp的VirG目的片段。而在氨節青霉素抗性篩選后的單菌落中，ipaA、ip濁、 mxiD、virG基因均無擴增片段，說明毒力大質粒成功丟失，將該步驟2)篩選的單菌落（利用 質粒不相容原理將毒力大質粒驅除而只保留有pKDinc質粒的重組菌）命名為S. flexneri 2a 301 ApCP/p邸inc。
[0164] 3)再利用地Dine質粒的溫度敏感特性，將S. flexneri 2a 301 ApCP/p邸inc在 無抗生素的液體LB培養基中42°C連續培養2代，將在無抗生素的LB固體培養基上可W生 長，但在含有氨節青霉素抗性的LB固體培養基上不長的菌株命名為菌株S. f Iexneri 2a 301 ApCPo 陽1化]提取S. f Iexneri 2a 301 A pCP的基因組DNA，按照步驟2)的方法檢測毒力基因 ipaA、ip濁、mxiD、virG，同時W福氏志賀氏菌2a 301野生株S. flexneri 2a 301的基因組 DNA為對照，進行上述PCR擴增，結果與圖IA的結果一致，在福氏志賀氏菌2a 301野生株 S.f Iexneri 2a 301 中，ipaA、ip濁、mxiD、VirG 基因都出現了 目的擴增片段，而 S.f Iexneri 2a 301 ApCP中，ipaA、ip濁、mxiD、VirG基因均無擴增片段，說明毒力大質粒不存在。
[0166] 提取S.fIexneri 2a 301 ApCP的基因組DNA，Winc的引物為引物進行PCR擴 增，通過驗證地Dinc質粒上的inc片段檢測地Dinc質粒是否成功丟失，同時W福氏志賀 氏菌2a 301野生株S. flexneri 2a 301的基因組DNA為對照，進行上述PCR擴增。
[0167] inc的引物如下：
[0168] incF:5,-TGCGAGAGAGAGGGGATAAC-3,（沈Q ID No. 9)
[0169] incR:5' -CGCCTTTTCCATCAGTTTC-3'（沈Q ID No. 10) 陽170] 結果如圖IB所示。 陽171] 圖IB中，301代表福氏志賀氏菌2a 301野生株S. f Iexneri 2a 301 ;301 ApCP代 表 S. flexneri 2a 301 ApCP。 陽172] 圖IB表明，在福氏志賀氏菌2a 301野生株S.f Iexneri 2a 301中，具有488bp的 inc基因目的片段，而S.flexneri 2a 301 ApCP中無目的擴增片段，說明地Dinc質粒成功 丟失。
[0173] 上述結果表明，S. flexneri 2a 301 ApCP已經丟失了毒力大質粒pCP，同時也丟 失了外源的地Dinc質粒，毒力大質粒缺失株S.flexneri 2a 301 ApCP構建成功。
[0174] (二）0-抗原連接酶基因 waal缺陷的無毒福氏志賀氏菌S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI的制備 陽17引 1、線性打祀DNA片段的制備 陽176] 1)PCR引物的設計和合成 陽177] 在福氏志賀氏菌2a SOlwaaI基因的上游巧'端）和下游（3'端）各設計一對引物， 即 301waalu5/301waalu3 和 301waald5/301waald3。其中 301waalu5 具有限制性酶切位點 BamH I，301waalu3具有限制性酶切位點Sal I，301waald5具有限制性酶切位點HindIII, 301waald3具有限制性酶切位點化O I。
[0178] 同時，為了驗證突變體是否夠構建成功，設計了基因組上waal基因上下游同源臂 W外的一對引物（301waalw5/301waalw3)，內部檢測引物（301waaln5/301waaln3)，kan 基 因引物化an5/Kan3)及kan基因內部引物化an巧/Kan巧），進行PCR驗證，同時進行測序驗 證。
[0179] 上述引物如表1所示。 陽180] 表1引物列表1
[0181]
[0
陽183] 表1中的下劃線所示的序列為酶切識別位點。 陽184] 2)線性打祀DNA片段的構建 陽 185] (1) W S. f Iexneri 2a 301 A pCP 基因組 DNA 為模板，用 301waalu5/301waalu3 和 301waald5/301waald3分別擴增出waal的上、下游同源臂up和down。 陽 186] ?0?程序如下：94。(：1〇111111;94^3〇3,56^3〇3,72。(：1111111，30個循環；72。(：1〇111111。 陽187] PCR擴增得到的UP片段的核巧酸序列如SEQ ID No. 23中自5'末端起第7-634位 核巧酸所示，down片段的核巧酸序列如SEQ ID No. 23中自5'末端起第2143-2822位核巧 酸所示。 陽18引 （2)祀TKan的構建
[0189] W SEQ ID No. 23中自5'末端起第641-2136位核巧酸所示的DNA分子為模板，W 5 >-GCGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 ' (SEQ ID No. 24) M 5^-CCAAGCTTATGGGAATTAGCCAT GGTCC-3' (SEQ ID No. 25)為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物； 陽190] Sal I和化nd III雙酶切PCR擴增產物，得到基因片段；Sal I和化nd III雙酶切 pET-2化質粒，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒，將其命名 為祀TKan,將祀TKan送測序，結果正確。
[0191] (3)BamH I和Sal I雙酶切up片段，得到基因片段l;BamH I和Sal I雙酶切 質粒祀TKan,得到載體大片段1 ;將基因片段1與載體大片段1連接，得到中間載體1 ; 陽1巧化nd m和化O I雙酶切down片段，得到基因片段2化nd m和化O I雙酶切中 間載體1，得到載體大片段2 ;將基因片段2與載體大片段2連接，得到中間載體2。
[0193] (4) BamH I和化〇 I雙酶切中間載體2,得到目的打祀片段，如SEQ ID No. 23所 示。該打祀片段兩側為同源臂，中間含kan基因。SEQ ID No. 23中自5'末端起第7-634位 核巧酸為UP片段，第641-2136位核巧酸為kan基因，自5'末端第2143-2822位核巧酸為 down片段。
[0194] 2、S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG 的構建 陽1巧]由于地OBEG質粒含有編碼A -Red重組系統所需各種酶，將地OBEG質粒電擊轉化 至S. flexneri 2a 301 A pCP中，涂于含有濃度為50ug/mL的氯霉素的LB平板上，30°C培 養過夜，得到的陽性克隆，將其命名為S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG菌株。
[0196] 3、線性打祀 DNA 片段電擊轉化 S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG
[0197] I)將S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG接種于含終濃度為30 y g/mL氯霉素低鹽 LB液體培養基3(TC培養過夜，并按照體積比1:100將其傳代于低鹽LB液體培養基，進行培 養。 陽19引 2)在步驟1)的培養液ODe。。值達到0. 2時，加入終濃度為1mmol/L的k阿拉伯糖 誘導Red重組系統的表達。 陽199] 3)待步驟2)的培養液ODe。。值為0. 6時，取步驟1制備的濃度為30化g/ y L的打 祀片段電轉S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG，得到轉化后的細胞。
[0200] 4)在轉化后的細胞中快速加入提前預冷的ImL低鹽LB液體培養基，30°C復蘇 2.化左右，然后涂布于含有50ug/mL濃度的卡那霉素的LB平板，放于30°C培養箱培養過 夜，篩選出陽性克隆。 陽201] 5)將陽性克隆接種于含有50 y g/血的卡那霉素的LB液體培養基中，42°C培養傳 代兩次（每次培養1化時間），即可除去地OBEG質粒，最終獲得含卡那霉素抗性、waal缺失 突變株，將其命名為 S.fIexneri 2a 301 ApCP waal::kanl。 陽202] 4、將編碼FRT位點特異性重組酶的質粒pCP20電擊轉入S. flexneri 2a 301 ApCP waal: :kan中，在含50ug/mL濃度的氯霉素及不含卡那霉素的LB平板上30°C培養， 篩選CmrKms (氯霉素抗性、卡那霉素敏感）的陽性克隆。 陽20引 5、將步驟4篩選到的陽性克隆，轉入液體LB中42 °C培養12小時，即可獲得0-抗 原連接酶基因waal缺陷的無毒福氏志賀氏菌2a 301，將其命名為S. flexneri 2a 301 A pCP A waal。 陽204] (pCP20的復制子對溫度敏感，42°C培養時丟失，此質粒含有編碼FLP重組酶的 DNA，由溫敏啟動子控制，42°C培養時誘導FLP重組酶表達，同時該質粒丟失。） 陽205] ( S ) S. f Iexneri 2a 301 A pCP A waal 的分子鑒定 陽2〇6] W S. fIexneri 2a 301 ApCPAwaaI的基因組DNA為模板，分別用一對waal內 部引物（301waaln5/301