專利名稱：：改造植物細胞壁多糖結構的方法
技術領域：
：本發明涉及通過體內表達多糖修飾酶方式改造高等植物細胞壁多糖結構的方法。
背景技術：
：、現有技術與本發明的區別特征高等植物的細胞壁是由纖維素、主要有半纖維素聚合體形成的互相支撐的結構，果膠基質聚合物和球形及非球形蛋白構成。除了球形蛋白以外，所有的聚合物在細胞壁中都起著結構性作用。當細胞壁成熟時，形成交連、鏈間和鏈內連接，最后木質素沉積在細胞壁上，從而使細胞壁變得非常穩定，使其組分難于分離、消化和處理。本發明涉及在體內控制復合細胞壁多糖的結構。在簡單的細胞壁聚合物中，不含有半晶質的纖維素微纖維，這類聚合物是不同種類的聚合物，該聚合物是由非糖組分組成，如蛋白質、木質素、木栓質和在表皮細胞壁中發現的臘質。半纖維素和果膠廣義地描述了復合的細胞壁多糖，如果這種多糖中在某種特定物種或組織中含量特別高或有特別的作用，那么其名稱在一定程度上可以表明其類別，例如，落葉松屬樹木中的阿拉伯半乳聚糖和谷類種子中的β-葡聚糖。本發明的內容中，從這類復合細胞壁多糖中排除在外的是那些不是結構組分但有其他作用的多糖，典型的是在種子萌發過程中貯藏量發生變化的碳水化合物，如瓜爾豆中的半乳甘露聚糖和羅望子中的木葡聚糖。在禾本植物、苔類植物及其親緣關系相近的種族的植物和維管植物中，半纖維素聚合物的類型和含量是不同的。Carpita和Gibeaut(1993)將非禾本植物型的細胞壁稱為I型細胞壁，禾本植物型的細胞壁稱為II型細胞壁。初級的I型細胞壁幾乎都是由纖維素、半纖維素和果膠組成。在未分化的細胞中，主要的半纖維素聚合物是木葡聚糖(不要與上文提到的種子中存在的木葡聚糖相混淆)。在II型細胞壁中，木葡聚糖是次要的半纖維素多糖(～5％)，與I型細胞壁相比果膠的含量也較低。許多種類的半纖維素多聚物，如木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和葡聚糖構成II型細胞壁中半纖維素聚合物的其他成分。在本發明中，這些半纖維素聚合物是特別相關的，被用來改造II型細胞壁中的多糖結構。對于I型聚合物來說，本發明特別的使用基質聚合物，如果膠。果膠由兩個基本部分組成，如一個基本的由半乳糖醛酸基(同型聚半乳糖醛酸，作為光滑區是已知的)組成的無支鏈聚合物和一個由鼠李糖基與半乳糖醛酸基交替形成的聚合物，后一種聚合物能被長的中性側鏈(鼠李糖聚半乳糖醛酸I，帶有“毛發”，作為毛發狀區是已知的)所取代。果膠多糖構成雙子葉植物細胞壁的30-50％(Carpita和Gibeaut1993)，植物細胞壁的果膠基質是同型聚半乳糖醛酸(HGA)、鼠李糖聚半乳糖醛酸I(RG-1)和鼠李糖聚半乳糖醛酸II(RG-1I)聚合物的復雜混合物(Voragen等.1995)。HGA是一種無支鏈的、可被有差別地甲基酯化和/或酰化的1，4-α-D-半乳糖醛酸(GalA)殘基。相關的未酯化的HGA長度(連接區)能使Ca2+與其他的HGA分子的相似區域交連，從而形成聚合物和能形成凝膠體的高級結構，但是，高度酯化的HGA降低了鈣促凝膠化的能力。其他的凝膠化機制一般依賴于高的甲基酯含量。RG-1是1，2-α-L-鼠李糖(Rha)和1，4-α-D-GalA殘基交連形成的支鏈雜聚物(Lau等1985)，其帶有連接在RG-1主鏈的鼠李糖(Rha)殘基上的、主要成分是1，4--D-半乳糖(Gal)和/或1，5-α-L-阿拉伯糖(Ara)殘基的中性側鏈。他們可以是單獨的單元(β-D-Galp-(l(4))，也可以是聚合物，如阿拉伯半乳聚糖I和阿拉伯聚糖。其它形式的阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖II主要和蛋白質(阿拉伯半乳聚糖蛋白質)相連。毛發的支鏈模式是種族(類)依賴的，RG-1的側鏈可以通過羥基肉桂酸殘基，如肉桂酸(Fry1986)利用酯連接與其他的果膠分子交連。一般來說，同型聚半乳糖醛酸(HG)和鼠李糖聚半乳糖醛酸I(RG-1)共價連接，但是，光滑區和毛發狀區延伸的恰當序列還沒有確定。高度保守的RG-II分子有一個有側鏈的同型聚半乳糖醛酸主鏈，該側鏈富含各種不同的已知的糖和不同連接，其可通過硼酸二酯交連形成二聚體(O’Neill等1996)。除了決定細胞壁的多孔性外，果膠聚合物還有其他的功能，包括調節細胞與細胞間的連接、細胞的膨脹(McCann和Roberts1994)、細胞壁機械性能(Chanliaud和Gidley1997)，作為信號分子的來源(寡聚糖素)(Cote和Hahn1994)，還參與細胞的分化和器官形成(Satoh1998)。用于食品應用的果膠的實用性通過許多參數來衡量，包括其分子量、中性糖的含量、光滑區與毛發狀區的比率、甲基和乙酰基酯化的程度，還包括同型聚半乳糖醛酸主鏈中酯基團的分布(Daas等1998，Braccini等.1999)，例如，如果只存在很少量的多毛發，就能促進同型聚半乳糖醛酸的Ca2+交連，于是形成了穩定性增強的凝膠。在許多含量豐富的來源中，如馬鈴薯的塊莖和產糖甜菜中，初級結構的果膠與蘋果和柑橘類植物中的果膠相比，其在食用性上的質量較差，特別的，馬鈴薯果膠的毛發狀區比率太高，且甲基酯化的程度太低(Ryden等.1990)，后者潛在地由采后起作用的果膠甲基酯化酶引起。關于內源酶活性的其他問題在于調整馬鈴薯的果膠結構需要擁有令人滿意的膠凝化性質，以得到高質量的果膠。已經從植物中提取幾種對人細胞和組織有生理學影響的果膠制劑，并證實其能與人源大分子復合物發生生化相互作用(Paulsen2000)。例如，已經表明來源于毛發狀區的化合物在體外可以和補給系統發生反應，因此，可以推斷這些化合物可能履行免疫系統的功能(免疫調節)(Samuelsen等.1998，1999，Yamada和Kiyohara1999)。但是，大量藥學問題的產生應歸因于活性物質差的性能。因此，不能控制果膠的結構使準確確定這些生化/生理活性物質的結構與活性的關系成為不可能。對于制備果膠或作為一種改造多糖屬性以適合于現有的和新的應用的方法，用酶處理果膠和其他植物細胞壁的觀念，在過去20年里取得令人矚目的成就。這些酶具體包括葡聚糖酶、木葡聚糖酶、纖維素酶、巖藻糖苷酶、木聚糖酶、內源多聚半乳糖醛酸酶(endo-PGs或EPGs)、果膠酯化酶、特異于不同種類帶有乙酰基修飾的多糖的乙酰酯化酶、果膠裂解酶、外源多聚半乳糖醛酸酶和果膠酸鹽裂解酶。一些新型的鼠李糖聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、半乳聚糖酶、阿聚糖酶和相應的呋喃糖苷酶也引起一定的關注。α和β特異性酶都是引人注意的。比如使用半乳糖苷酶，一些α半乳糖苷酶的同功酶能消化半乳甘露聚糖，而獨特的β特異的變體能使果膠半乳聚糖體發生解聚。上文列出的所有多糖修飾酶的作用情況是相似的。許多酶行使其本身的功能，或者通過人為選擇以修飾藻類和微生物多糖，這些酶對于高等植物細胞壁也被認為是有效的，因為不同組成和來源的多糖具有相同的基本單元。通過上文的描述，我們能夠看出多糖，如果膠，是細胞壁中非常復雜的組分，且對單個多糖的精細結構有了一個非常完全的了解。考慮到聚合物的復雜性，有許多酶參予到他們的降解中是不奇怪的，這也意味著要一個很大的“工具盒”來改造這些聚合物。然而，修飾植物細胞壁多糖的常用方法主要是建立在采(集)后處理方法的基礎上。于是用采后處理的方法來修飾果膠，首先從原料植物材料中提取果膠，接著進行修飾，從而產生具有用于既定用途所需要性質的修飾果膠。相反，能夠在體內修飾細胞壁多糖是有利的，例如果膠，通過修飾果膠的結構，如毛發狀區的結構，這將開拓一個新的不同途徑，由于技術和/或經濟原因，通常認為這是不可能或不能實現的。所以，本發明的主要目標是控制活體植物中復合多糖結構，包括果膠結構，從而獲得細胞壁多糖經過修飾了的與母本植物相關的具有新型的細胞壁多糖結構植物材料。此處所用術語“新型的多糖結構”和“新型的果膠結構”指的是具有新的排列和/或改變了的聚合物單糖結構封端比例的聚合物。在下文對測定連接模式的描述中，由于分子量降低(例如成熟過程中)，那些在數量上無關緊要的新的末端基團被忽略，且大小發生改變的聚合物在本發明中不被認為是一種新的結構。在測定單糖側鏈和連接模式中，非糖取代基也被忽略，因此在優點上只有唯一的不同，如增加了甲基酯化的多糖也不能認為是一種新的結構。相應的，與現有技術相反，本發明如上文所述提供在體內生產的新的復合細胞壁多糖結構在下文中(和在下文的實施例中)，在體內修飾復合的植物細胞壁多糖結構的可能性通過用馬鈴薯的果膠結構為例來證實，但這決不是將本發明限定到果膠或馬鈴薯，本發明適用于修飾大范圍的細胞壁多糖，它適用于許多農作物物種和許多除塊莖之外的植物部位(器官)。但在許多國家馬鈴薯是一種重要的農作物，這不僅僅是因為它能夠原樣消費(煮、烤等)或處理后消費(炸薯條、炸土豆片、做湯)，還因為它能提供能用于許多工業應用中的高質量淀粉。在馬鈴薯塊莖中提取淀粉后，殘余的大量副產品(如纖維和蛋白質)主要被用來作為動物飼料。然而，這些副產品中含有能夠生產更高價值產品的成分。馬鈴薯的纖維組分是不同多糖的聚集體，它們一起形成細胞內容物的包裝材料，即植物細胞壁。在這些多糖中，果膠可能是最主要的引人注意的聚合物，因為它是許多食品應用領域的公知膠凝劑(Visser和Voragen1996，Daas等.1998)。在本發明中，特別關注的是果膠的毛發狀區，而不是例如帶有酯基的同型聚半乳糖醛酸的修飾。毛發狀區的數量決定了中性糖與糖醛酸的比例，當該比例高時，果膠的水結合能力也高。這在一些食品應用領域和非食品應用領域是有利的。當該比例低時，果膠結構接近柑橘類果膠的結構，這一般在食品工業領域是優選的。因此，降低中性糖與糖醛酸的比例對于提高馬鈴薯淀粉、產糖甜菜等產品的果肉副產品的價格是重要的。因此，本發明的另一重要目標是通過基因修飾降低植物中果膠的毛發狀區的比例，這除了有利于提高馬鈴薯果膠的膠凝性外，還有利于淀粉的提取工藝，以得到高產量的淀粉。另一個目標是剪接和重新構建果膠的毛發狀區，以使其適用于低粘性食物產品(例如飲用性酸奶酪和相似的日用產品)。本發明中稱為“自處理”塊莖(或一般地稱為自處理植物材料)的實施方式提供的另外一種技術能滿足這種需求。“自處理”是指植物組織中斷采后釋放貯存在細胞中的酶的屬性。這些釋放的酶催化細胞壁材料的修飾，特別是容易回收有益的多聚或寡聚糖。該技術也可用于剪切的果膠聚合物和其低聚物的醫藥用途。和使用降解酶修飾采后果膠聚合物結構不同，在體內的修飾還可以使用編碼生物合成酶或合成酶復合體的組分的基因。應當理解上調或下調合成酶或修飾酶的活性將增加操作的選擇。已經鑒定了幾種修飾轉移酶，證明它們可能在這方面是有用的(Perrin等.1999，Edwards等.1999，WO99/60103)，這樣的酶是本發明果膠修飾的候選酶。一些酶的核苷糖基會發生互變是公知的，基于定性的突變體(見下文)我們可以預見，編碼這些酶的基因可以用于間接操縱果膠和其他細胞壁多糖的生物合成。然而，目前已經證實，編碼用于采后處理果膠修飾的多糖修飾酶的基因是體內修飾果膠的優選工具。已經分離出幾種表現出細胞壁修飾表型的突變的鼠耳芥(Arabidopsis)屬。其中有一些受核苷酸糖庫的水平的影響。僅僅一種現有的細胞壁突變體mur8可能是特異的果膠突變體，因為它缺乏鼠李糖(Reiter等.1997)，而mur1(缺乏海藻糖)和mur4(阿拉伯糖含量減少)(Mayer1998)可能受其他的細胞壁多糖中的果膠的影響。然而，通過任意的可用方式產生這樣的突變體在鼠耳芥屬中容易處理，但在進行了相關的細胞壁多糖修飾的農作物植物中不易處理。WO91/08299公開了一種利用反義技術來抑制植物細胞中的基因產物產量，從而達到控制水果成熟的目的的方法。目標基因包括果膠酯化酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶和木聚糖酶。但并不涉及本文提供的在體內產生新的復合細胞壁多糖。WO99/07857公開了編碼植物和轉基因植物及其部分和改變了果膠酸鹽裂解酶活性的其后代中的果膠酸鹽裂解酶基因。雖然已經證明增強植物中果膠酸鹽裂解酶的活性可以改變果膠，但是這種改變只是果膠聚合物的分子量的改變，并不能產生本文的新的果膠結構。WO93/13212公開了編碼果膠酯化酶同功酶的DNA，將該DNA轉化如馬鈴薯，可以降低果膠酯化酶的活性。Sorensen等(1999)發表的標題為“通過在馬鈴薯中表達真菌內源性β-1，4半乳糖酶來修飾果膠”的文章表明，通過減小與RG-1中的鼠李糖殘基連接的線狀半乳聚糖的數量來修飾馬鈴薯果膠的毛發狀區是有希望的，而且可以預計這些半乳聚糖能被來源于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的真菌內源性半乳聚糖酶降解。這篇文章還報道生產了一些轉基因植物，這些轉基因植物的葉和塊莖中表達半乳聚糖酶的基因是在顆粒束縛(GranuleBound)淀粉合成酶(GBSS)啟動子或patatin啟動子的控制之下。但是，半乳糖酶的表達對細胞壁多糖可能產生的影響既沒有理論說明也沒有試驗說明。因此，現有技術表明控制植物細胞壁的成熟進程是可能的，且這些處理能改變聚合物的分子量分布和取代基的修飾如甲基酯化。調節植物的成熟速度，就像植物的自然成熟一樣控制植物的成熟是可能的。但在本發明中，這種改變并不被看作是新的細胞壁多糖結構。一些工作者發現基因表達會對細胞壁的特性產生非常大的非特異性下游影響，但沒有發展特異性技術。在了解了植物在生長過程中是活躍地用一種謹慎的調節方式調節細胞壁的新陳代謝的情況下，植物能夠忍受除了加速或降低細胞壁新陳代謝自然進程的細胞壁再加工是令人驚奇的。但是現有技術中與成熟延遲有關的細胞壁新陳代謝的速率改變與本發明中所達到的程度有明顯的區別，在現有技術中，當聚合物成分大部分保持不變時聚合物的酯化作用和分子量的改變占優勢，而本發明提供了一種新的定點剪切復合細胞壁多糖的技術，從而在單糖分布和/或測定的，如甲基化分析的整個連鍵方式上提供高度可預測性的改變。因此，本發明涉及新的定點、特異性地改造或修飾復合植物細胞壁多糖的技術。一般來說，該技術的好處在于以下四大方面1、改善農作物的農學特性修飾植物結構.某些有選擇對細胞壁新陳代謝的進程的干擾將影響細胞的分化、形態和生長，例如，通過修飾決定細胞分化方向和生長進程的重要的細胞壁成分可以構建自整枝植物。繁殖能力.在種子的傳播中細胞的分離是一個關鍵的生長步驟(WO97/13865)，花粉的傳播和花粉管沿著花柱中層的生長及生長進程都可以通過修飾細胞壁來改變。病原體的入侵.病原性真菌和細菌通過產生一系列的破壞宿主細胞細胞壁結構的多糖降解酶入侵到植物組織。本發明提供一種改變細胞壁從而阻止滲透的方法。象信號分子一樣，在病原體入侵過程中從細胞壁中釋放所謂的寡聚糖，這些從細胞壁中釋放的不同連接的寡聚糖產生一種新的細胞壁結構，于是改變了致病的過程。從而減少癥狀的產生。2、改良植物產品食用纖維.修飾細胞壁可以提高食用產品中的食用纖維的量，改變可溶的和不可溶的食用纖維的比例，其中后者跟很多健康問題有關。結構.細胞壁構成蔬菜和水果的結構，在蔬菜和水果貯存中結構改變起著重要的作用。使用本發明的方法可以修飾結構和保藏時間。與保存有關的同時，本發明還提供了現有技術中描述的通過轉基因修飾來補充控制成熟(加速和延遲)的技術。材料特性.木材和纖維的結構特性依賴于植物解剖學、纖維細胞的幾何學、次生壁的結構、木質化和多糖聚合物的構成。后者的植物材料原性可以通過利用本發明改造靶細胞的細胞壁加以改良。與醫藥材料、包被植入物的水膠體以及一些醫藥器械有關的特性包括水結合能力。如同本發明，通過修飾，如修飾果膠的結構，可以控制水結合能力(還可參見下文標題4的“剪切果膠”)。提高副產品的價值.來源于紙產品或纖維制品、釀酒、淀粉或糖產品的紙漿是復合植物多糖的一種豐富的來源，該多糖達不到特定工業用途的標準，使用本發明構建農作物，從而使其成為具有更高價值的多糖來源從而升值。在下文中以果膠成分價格為例來說明。飼養型細胞壁的功能組分很大程度上決定其在家畜和家禽中的可消化性和氮利用率。特別是在非反芻動物中，如小豬和家禽中，細胞壁多糖的可消化性在飼料有效利用方面是一個限制因素。應用本發明的新技術，可以使飼料產品具有更優的可消化性，因此提高了動物的生長速度。在反芻動物中，增加多糖和細胞壁成分的可消化性將會影響蛋白質在瘤胃中的分解，因為在瘤胃中的微生物將會利用釋放的糖類來代替蛋白質，這樣在瘤胃中較少的蛋白質被分解，產生較少的氨，于是多糖和細胞壁組分可消化性性的增加會使蛋白質在瘤胃中免遭降解，因此更多的蛋白質成分在腸道中被吸收。這樣，提高細胞壁組分和多糖的可消化性將增加蛋白質的利用率，減少瘤胃降解蛋白質而從瘤胃中釋放的氨或氮。3、改善加工特性飲料的過濾性.植物材料的液化應用于果汁和酒制造中，如利用食品工業酶增加產量和防止過濾物的凝結，本發明在補充或替代這些措施和減少/除去某種在處理過程中導致麻煩的多糖成分是有用的。麥芽糖的性質.在制備麥芽糖的過程中，淀粉被分解，然而穎果中只是特定的細胞壁β-葡聚糖能溶解，這樣就可能導致有關啤酒是否澄清的問題。針對這個問題的大多數生物技術方法是構建能完全消化β-葡聚糖的酵母菌，利用本發明可以改善細胞壁中β-葡聚糖的加工性質。一般來說，是改良麥芽糖在制備過程中的加工方式，并改良終產品。烘烤性.通常用富含對細胞壁多糖具有活性的木聚糖酶和葡聚糖酶的工程酶來修飾生面團的流變學性質。利用本發明的方法修飾了細胞壁多糖的起始材料，可以補充或代替加入工程酶的方法，另外對多糖和細胞壁組分進行其他的修飾，可以改善生面團的性質，提高其烘烤性。纖維的浸漬.用工業酶處理或通過傳統已知的作為浸漬法的“發酵”處理方法分離纖維，如亞麻。利用本發明，可以修飾與細胞壁的性質有關的纖維植物纖維或含有纖維的植物組織，其可以補充或代替這種方法。另外，利用本發明來還可改良(包括加工)其他用于制造紡織品植物纖維(棉花、大麻等)。4、分離的多糖作為食物成分和添加劑的被剪切的果膠.通過本發明可以獲得設計過的果膠，例如，從如上文所述的含有劣質果膠的植物材料中獲得。一般來說，該技術的優點包括能保持低粘性果膠的生理活性，酯分布的均一性，產生高分子量低粘性的產品，除去廢水中的酸和制備分子量不降低的低酯果膠。其他優點還包括工藝簡單，高產量，高強度，利用便宜的原材料，反應條件溫和，回收容易，低消耗，對環境的影響小和產物的質量高。另外，本發明技術還可以利用非精制的產品(例如，沒有經過傳統的大部分提取步驟的產品)，可以利用本發明的技術除去不需要的多糖和細胞壁成分，例如，產生非適口性的成分，從而提高低質量成分的組分質量。作為醫學材料和藥物的剪切的果膠.已經檢測了幾種植物種中(其中的一些是外來植物)細胞壁多糖中的生物活性多聚和寡聚糖，包括果膠。本發明能對細胞壁多糖的聚合物結構進行有效的控制，例如設計農作物植物中的多聚和寡聚糖，使其具有生物活性。在糖制品廠、淀粉制品廠、啤酒廠等使用公知的處理步驟處理的好處包括高效率、低消耗，優選一種或多種特定的農作物植物。發明概述本發明的第一方面涉及提供轉基因植物材料的方法，其與野生型狀態相比復合細胞壁多糖結構被修飾，該修飾至少涉及糖苷鍵形式和單糖分布中的一個，該方法包括以下步驟(i)提供含有核苷酸序列的核酸構建體，該構建體轉化到植物細胞中后，能導致至少一種靶細胞壁修飾酶的產量改變，(ii)用核酸構建體轉化植物細胞，和(iii)于轉化植物細胞中取得植物細胞培養物，植物組織或轉基因植物，其中至少一種細胞壁多糖修飾酶的產量發生改變，于是獲得轉基因植物細胞、植物組織或植株，其與野生型的植株相對比，靶底物細胞壁多糖被修飾，具有的單糖分布中至少一種單糖的比例改變至少10％，或至少一種糖苷鍵的比例改變至少10％。在這方面的一個實施方案中的核苷酸序列(在將構建體轉化到植物細胞中，導致至少一種靶細胞壁多糖修飾酶產量改變)是編碼一種酶的核苷酸序列，比如真菌或微生物來源的細胞壁多糖修飾酶，其能修飾實施方案中的目標細胞壁多糖，其中編碼序列可操作性的與指導其表達的啟動子連接。這種啟動子可以來源于植物，如植物組織或在器官的特異性啟動子，包括貯藏器官特異性啟動子。在本文中，目的啟動子是那些能指導馬鈴薯塊莖中細胞壁多糖修飾酶的表達的啟動子，包括選自顆粒束縛的淀粉合成酶(GBSS)啟動子和B33啟動子的啟動子。在另一個實施方案中，至少一種產量發生改變的靶細胞壁多糖修飾酶是一種內源酶，即在轉化植物細胞中自然產生的酶，包括特別的方案，其中在將核酸構建體轉化到植物細胞中導致至少一種靶細胞壁多糖修飾酶的產量變化的核酸序列是調節內源序列表達的序列，該內源序列編碼能修飾靶細胞壁多糖的酶。作為該實施方案的一個實施例，調節編碼能修飾靶細胞壁多糖的酶的內源序列表達的序列是編碼反義序列的序列，該反義序列降低抑制劑的表達或減少內源靶細胞壁多糖修飾酶抑制劑的產生。在另一個實施例中，調節編碼能修飾靶細胞壁多糖的酶的內源序列表達的序列重組后，導致一個新的或修飾過的啟動子的插入，該啟動子可操作性的與內源靶細胞壁修飾酶連接，所述啟動子能指導細胞壁修飾酶編碼序列的表達。在以上方法的另一個實施方案中，將其構建體轉化到植物細胞中導致至少一種靶細胞壁多糖修飾酶的產量改變的核酸序列通過重組，使能修飾靶細胞壁多糖的酶的內源編碼序列表達，該酶定位到植物細胞中的特定區域，而在正常情況下該區域不存在這種酶。在以上方法的有利實施方案中，核酸構建體是病毒載體，將其轉化到植物細胞中后并不整合到細胞基因組中。在以上方法的具體實施方案中，被細胞壁多糖修飾酶修飾的靶復合細胞壁多糖是果膠或半纖維性多糖。合適的果膠或半纖維素修飾酶包括內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶、內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、內源性半乳聚糖酶(endo-galactanases)、內源性阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶，如β-半乳糖苷酶、木糖苷酶和外源性半乳糖醛酸酶及其orthologs或同功酶。在以上方法的另一個實施方案中，將其構建體轉化到植物細胞中導致至少一種靶細胞壁多糖修飾酶的產量改變的核酸序列和宿主植物內源性基因是完全不同的，因此共抑制不會發生。在以上方法的又一個實施方案中，輔助酶，包括如甲基酯化酶、乙酰酯化酶或糖苷酶除去多聚物中的單個單糖(例如將阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、木糖苷酶或巖藻糖苷酶)與靶細胞壁多糖修飾酶共表達，其中共表達使多糖修飾酶更容易接近其作用底物。本發明的另一個方面涉及修飾植物細胞中的至少一種復合細胞壁多糖的生物合成，以獲得轉基因植物材料的方法，該轉基因植物材料與野生型形態相比其中復合細胞壁多糖的結構被修飾，該修飾至少包括糖苷鍵形式和單糖分布中的一個。該方法包括以下步驟(i)提供含有核苷酸序列的核酸構建體，在植物中表達該構建體，使至少一種細胞壁多糖修飾酶定位到植物細胞的間隙中，而該間隙在正常情況下不存在該酶，或者在植物細胞中產生的一種天然多肽，從而影響細胞壁多糖的生物合成的表達發生變化，(ii)用該核酸構建體轉化植物細胞，和(iii)于所說的轉化植物細胞取得植物細胞培養物、植物組織或轉基因植物，相應于野生型植物，其在不同的間隙產生至少一種細胞壁多糖修飾酶。上述方法包括實施方案，其中與野生型的植株相比，在獲得的轉基因植物細胞、植物組織或植株中，靶底物細胞壁基質多糖被修飾，具有的單糖分布中至少一種單糖的比例改變至少10％，或至少一種糖苷鍵的比例改變至少10％。在以上方法更具體的實施方案中，至少一種細胞壁多糖修飾酶定位到高爾基體，包括與高爾基Stacs融合或從上萌芽的膜囊，其中，在植物細胞中表達導致至少一種細胞壁多糖修飾酶定位到高爾基體的核酸序列是編碼嵌合基因產物(該基因產物包括至少一種細胞壁多糖修飾酶)的序列，和能使嵌合基因產物定位到高爾基體的序列。這種定位序列為II型膜錨定高爾基蛋白(例如唾液酸轉移酶、N-乙酰葡萄糖氨基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、木糖基轉移酶或半乳糖基轉移酶及其片段)，或者可溶性高爾基體靶蛋白(如Pisumsativum逆向糖基化多肽(RGP1)或其片段)。以上修飾細胞壁多糖生物合成方法的另一個具體實施方案中，核酸序列(其在植物細胞中表達，導致至少一種細胞壁多糖修飾酶定位到植物細胞間隙，而在正常情況下該酶不存在)可操作地與一個其將導入的植物細胞基因組中的啟動子連接。本發明的另一方面涉及提供轉基因植物的方法，該轉基因植物中含有至少有一種復合細胞壁多糖，如果膠或半纖維素多糖的部分，采集后，該部分能用植物材料自身存在的酶處理，即“自處理”植物，該方法包括(i)提供含有核苷酸序列的核酸構建體，將該構建體轉化到植物細胞后，在植物細胞的原生質體(non-apoplastic)或非高爾基體間隙中表達細胞壁多糖修飾酶或表達在體內條件下無活性，但在來源于植物細胞的植物材料采集后能被激活的細胞壁多糖修飾酶，(ii)用該核酸構建體轉化植物細胞，和(iii)于所述轉化植物細胞中取得轉基因植物材料，在合適的采后條件下，其中至少一種復合細胞壁多糖在采后可被酶處理，方法是將至少一種復合細胞壁多糖和細胞壁多糖修飾酶接觸(該酶在原生質體和非高爾基體間隙中表達)，或將采集的植物材料放在一定的條件下，在該條件下在體內以失活形式表達的酶被激活。關于這方面的一個具體的實施方案中，在將核酸構建體轉化到植物細胞后，使細胞壁多糖修飾酶在原生質體或非高爾基體結構中表達的核酸序列是使細胞壁多糖修飾酶在植物生長過程中定位到細胞間隙(選自液泡、內質網、細胞質和質體)的序列，包括，在原生質體或非高爾基體空隙中表達的多糖修飾酶的編碼序列是包含于轉化到植物細胞中的核酸構建體中的序列，或者是核酸構建體轉化的細胞的基因組中存在的內源序列。在以上制備采后自處理植物的方法的有用的實施方案中，細胞壁多糖修飾酶選自內源性多聚半乳糖醛酸酶、內源果膠裂解酶、果膠酸鹽裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、內源葡聚糖酶、內源木聚糖酶和其同功酶或ortholog。在有利的實施方案中，該酶的表達受植物啟動子的指導。在以上方法的具體實施方案中，當采集后被處理的細胞壁多糖是果膠時，果膠被處理的區域是鼠李糖半乳糖醛酸區和同型聚半乳糖醛酸區之間的區域。在提供采后“自處理”植物的方法中，一個有用的實施方案是其中的植物細胞進一步被核酸序列轉化，該核酸序列使一種能在體內修飾至少一種復合細胞壁多糖(包括能在采集后能被植物材料自身存在的酶處理的細胞壁多糖)結構的酶表達。這樣的核酸序列可以是編碼細胞壁多糖修飾酶的序列，或者是編碼一種產物的序列，該產物影響編碼細胞壁多糖修飾酶內源性序列表達。在有用的實施方案中，細胞壁多糖修飾酶定位到非原生質體。在體內能修飾至少一種復合細胞壁多糖結構的有用酶包括內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸酶水解酶、內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸酶裂解酶、內源性半乳聚糖酶、內源阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶，如β-半乳糖苷酶，木糖苷酶和外源性半乳糖醛酸酶及其同功酶或orthologs。本發明的另一個方面涉及提供植物細胞壁多糖材料的方法，與野生型形態比，該細胞壁多糖的結構和組分被修飾。該方法包括以下步驟(i)利用上文提供采集后“自處理”植物的方法提供轉基因植物，如馬鈴薯植株，(ii)培養和采集該植株，從中分離至少有一種復合細胞壁多糖，如果膠的部分，其可在采集后被植物材料自身存在的一種酶處理，(iii)將所說的部分放置在一定的條件下，在該條件下在原生質體和非高爾基體結構中表達的細胞壁多糖修飾酶，與其細胞壁多糖底物接觸，或者在體內條件下表達的無活性細胞壁多糖修飾酶被活化，從而獲得修飾的細胞壁多糖，和(iv)分離修飾的細胞壁多糖材料。在該方法的有用實施方式中，獲得的材料中的修飾過的細胞壁多糖含有至少一種單糖的改變比例至少為10％或至少一種糖苷鍵的改變比例至少為10％的單糖分布。本發明的另一個方面是提供植物細胞壁多糖材料，相對應于野生型的形態來說，通過以上方法獲得的該多糖材料，具有修飾過的結構和組分。本發明也提供用本發明第一方面的提供轉基因植物材料的方法提供轉基因植物或其后代或其部分，該轉基因植物材料相對于野生型形態來說，其復合細胞壁多糖結構被修飾，相對于含有相應的野生型細胞壁多糖的材料來說，這種轉基因植物或其后代或其含有轉基因植物材料的部分的植物細胞壁多糖含有材料至少有一種發生改變的功能性特征，比如改變的藥物活性、水結合能力、可加工性、膠凝性、粘稠性和可消化性。本發明的又一方面涉及以上轉基因植物或其后代或其部分或含有細胞壁多糖的植物材料在制造食品、食品添加物、飼料、藥學或醫學產品和化妝品和含有以上含有細胞壁多糖的植物材料的藥學或醫學產品，如藥物組合物、移植材料、醫學裝置和外科粘合劑中的用途。本發明的再一方面是提供生產含有復合植物細胞壁多糖的材料的方法，其中的多糖相對于相應的野生型形態的細胞壁多糖來說具有修飾的結構和/或修飾的組分，該方法包括如下步驟(i)用本發明第一方面的方法或用上文修飾植物細胞中至少一種復合細胞壁多糖的生物合成的方法提供可培養的轉基因植物，如馬鈴薯植株，或者其可培養后代，(ii)在合適的植物培養條件下培養所述轉基因植物或其后代，以得到含有至少一種具有修飾結構和/或修飾組分的復合細胞壁多糖的植物材料，和(iii)從培養的植物中分離含有修飾過的細胞壁多糖的材料。在該方法的有用的實施方案中，從培養的植物中分離的材料含有細胞壁多糖，該多糖相對于野生型植物來說被修飾，具有其中至少一種單糖被改變的比例至少為10％或至少一種糖苷鍵被改變的比例至少為10％的單糖分布。發明詳述在下文的描述和權利要求中，幾個上位的和下位的術語和表達被用來限定本發明，下文將對這些術語和表達進行限定和解釋術語“新的多糖結構”和“新的果膠結構”指的是具有新的糖苷鍵排列和/或聚合物中單糖結構單元的比例改變了的聚合物，即改變了的單糖側分布。在測定連鍵形式時，由于分子量降低(例如成熟過程中)，那些在數量上無關緊要的新的末端基團被忽略，且只大小發生改變的聚合物在本發明中不被認為是一種新的結構。在測定單糖分布和連接形式中，非糖取代基的修飾也被忽略，因此只是由于如增加了甲基酯化而不同的多糖也不認為是一種新的結構。多糖或多糖混合物中的單糖分布可以通過如多糖水解產物乙酰衍生物氣相色譜法，或者通過有或無糖醛酸分離的HPAEC法測定。連鍵分析可以通過下面的方法進行去除多聚或寡聚糖上的非糖修飾物，然后，在進行水解和氣相色譜之前甲基化所有的自由羥基。在測定單糖分布和連鍵形式中，一些殘留的淀粉會影響測定結果，因此試驗者需要對非隨機可變因素進行估計。單糖分布既是定量屬性，也是定性屬性，而連鍵形式在很大程度上是定性上的特征。特別地，定性特征具有生物學可變性。本發明在復合細胞壁多糖中導入本發明限定的新結構，通過與野生型對照(參照下文)對比予以確認。與野生型植物相比，如果單糖分布的一種單糖相差至少10mol％，包括至少15mol％、20mol％或25mol％，或在至少一個殘基連鍵方式分析中，相差至少10mol％，包括至少15mol％、20mol％或25mol％，那么就認為是不同于野生型形態的轉化子。單糖分布和連鍵方式不需要同時改變，但可能發生同時改變。一些可能的修飾只考慮到重排，并只在新的連鍵形式中出現，而其它只是單糖分布發生改變的修飾是純組成性修飾。術語“轉基因的”或“轉化的”植物指的是通過基因轉化過程使其含有下列核酸序列的植物DNA-甲基化形式，其在正常情況下不存于植物中，或正常情況下植物中存在的序列之外的核酸序列，或正常情況下植物中存在但與天然的序列相比發生了改變的DNA序列。在本文中，改變也包括DAN甲基化形式的改變或在基因組中的排列的改變。術語“野生型”指的是既沒有被穩定轉化也沒有被處理使之瞬間表達外源遺傳材料的植株。野生型植株用來測量生物變異，通過對比可以確定表現出一種真正地新表型的已被處理的植株。在研究中，野生型對照植株應與修飾的植物進行同樣培養，在基本一致的條件下生長，使其成為本發明中合適的對照物。在相同的生長階段，從試驗植株和對照植株中取出器官和組織樣品用于對照分析。術語“核酸”指的是任意核酸物質包括，包括DNA、RNA、LNA(lockednucleicacids)、PNA、RNA、dsRNA、能夠改變遺傳材料遺傳性或穩定性的RNA-DNA雜合體和/或植物中的甲基化DNA。還包括由非天然產生的核苷構成的核酸。術語“核酸構建體”指的是用于轉化植物細胞以產生子代轉基因植物的遺傳序列。核酸構建體包括至少一個編碼目標基因產物的編碼區，為了在植物中表達而連接在5’和3’端的調節序列。這樣的構建體可以是嵌合體，即由不同來源的序列混合構成，或者是非嵌合體。根據基因產物的預定功能，編碼區的方向可以是有義或反義方向。近來已經證實在高等植物中通過同源重組進行轉化是可能的(Kempin等，1997)。可以預料這將可變和開辟制備上述轉基因植物的方法。因此，“核酸構建體”的定義可以被理解為包含了這些新技術。利用同源重組實現本發明的特殊技術方法包括，但不限于通過替換啟動子或敲除(knock-out)抑制因子來補充內源性細胞壁多糖修飾酶。這對于植物來說通常是可接受的，或者至少在所述基因存在幾種同功酶時是可接受的。根據同樣的原理，通過取代其信號序列，可以改變內源基因產物的亞細胞定位。最后，通過內源基因的取代可以將異源基因的全部或他們的編碼區引入到植物基因組中。而且，利用植物病毒將外源遺傳材料攜帶到植物中，從而修飾感染細胞基因的表達是可行的，并且是一個植物基因修飾的有效方法，不產生穩定轉化的植物。可在采集后立即對成熟植物進行感染，所需要的表型一形成就回收修飾組織。如果直接應用此處所述的轉化細胞，則暗指這些被瞬間修飾的細胞。術語“反義”指的是與有義鏈互補的DNA鏈序列，并且其不能被翻譯成結構基因編碼的多肽。為了達到本發明的目的，反義指的是在反方向上與啟動子的全部或部分序列可操作性連接的核酸構件，因此轉錄形成RNA分子后，有義和反義系列能發生雜交，于是減少所述多肽的水平。術語“有義”此處是指結構基因DNA的序列，其被轉錄成mRNA分子，然后翻譯成該結構基因編碼的多肽。術語“可操作性連接”指的是編碼序列表達必須的調節序列位于核酸分子中相對于編碼序列的合適位置，從而影響編碼序列的表達。選擇地，在被編碼序列轉化的細胞的基因組中，編碼序列可以與調節序列可操作性地連接。此處所用術語“啟動子”指的是引起或者將DNA轉錄成RNA分子所必需的DNA序列。該啟動子可以是組織特異性或器官特異性啟動子、在特定生長階段具有活性的啟動子或可誘導的啟動子，如下文所述的一種可誘導的啟動子或現有技術中已知的另一種可誘導的啟動子，或一種組成性啟動子，如花椰菜花葉病毒35S啟動子或現有技術已知的另一種組成性啟動子。術語“載體”指的是在細胞中能夠復制的核酸分子(或者在體外能夠擴增，如通過PCR方法)，該核酸分子在細胞中能和其他的核酸分子可操作性連接，使連接的核酸序列發生復制。常用載體如下所述，并包括細菌質粒和噬菌體。利用常規的核酸重組技術可將上文所述的核酸構建體摻入到植物細胞中。一般來說，該技術包括將核酸插入到表達載體中，該載體具有轉錄和表達插入的蛋白編碼序列所需的元件和用于篩選轉化細胞或植株的一個或多個標記序列。一旦核酸構建體被克隆到表達載體中后，利用本領域技術人員公知的常規轉化方法將其導入到植物細胞中。這個過程包括，但不限于，使用土壤桿菌屬(Agrobacterium)載體，如根瘤土壤桿菌(A.Rhizogenes)和毛根土壤桿菌(A.rhizogenes)，用PEG處理原生質體，DNA傳送，用包被有核酸構建體的金顆粒轟擊，原生質體電穿孔或如《植物組織培養雜志》中通常所述(Lindsey，1992，KluwerAcademicPubs.，Dordrecht)的核酸直接吸收。根據不同的預轉化植株使用合適的轉化方法對于本領域的普通技術人員來說是顯然易見的。此處所用的術語“轉化”指的是將核酸轉化到植物細胞中的這個事實，而不考慮核酸接下來是否摻入到轉化細胞的基因組中。術語“植物細胞”包括任何來源于植物的細胞，包括未分化的組織，如愈傷組織和懸浮培養物，以及植物種子、花粉或植物胚。適合于轉化的植物組織包括葉組織、根組織、分生組織、原生質體、胚軸、子葉、盾片、苗端、根、未成熟胚、愈傷組織、體細胞胚、胚胎發生結構、花粉及花藥。術語“定向(targeted)”，當涉及在體內進行細胞壁多糖的改造或修飾的方法時，是指本發明與天然存在的隨機突變方法相區別，也與改變多糖聚集前體庫的轉基因方法相區別。后一種方法通常通過影響結構單元來改變所有聚合物的單糖分布，而利用本發明可以定向的修飾特定的細胞壁聚合物。另外，術語“定向”還表明了對定向的多糖組分的副作用，如降低細胞壁原纖維或木質素的含量，其被認為隨機修飾。在任何主要組分減少后，細胞壁的剩余成分就會由其他的細胞壁結構單元補充。術語“復合細胞壁多糖”指的是一類來自本發明涉及的維管植物的聚合物。不包括細胞內的復合多糖、淀粉和果聚糖。不考慮種子貯藏多糖，如甘露聚糖、半乳甘露聚糖和在種子次生壁中的貯藏木葡聚糖。簡單的、纖維素的晶體絲不能滿足本文中的“復合”要求。該定義涵蓋下文例子中的半纖維素和果膠。術語“半纖維素”或“半纖維素多糖”指的是結構性木葡聚糖(相對于貯藏性木葡聚糖)、木聚糖、阿拉伯糖木聚糖和多種非纖維質β-葡聚糖。術語“果膠”或“果膠多糖”指的是上文描述的多糖一般稱為果膠，即在植物細胞壁中以同型聚半乳糖醛酸、木糖聚半乳糖醛酸、鼠李糖聚半乳糖醛酸和阿拉伯半乳聚糖聚合物的混合物形式存在的多糖材料。術語“光滑區”指的是主要由同型聚半乳糖醛酸組成的果膠基本直鏈的、非支鏈區域，其中含有的半乳糖醛酸單元可以被不同程度地酯化，一般是O-乙酰基和O-甲基。該光滑區還可以進一步含有一段木糖聚半乳糖醛酸和鼠李糖聚半乳糖醛酸II。術語“毛發狀區”指的是含有鼠李糖聚半乳糖醛酸I的果膠支鏈區。其主鏈由GalA和Rha構成，多種側鏈主要由阿拉伯糖和半乳糖構成。術語“多糖修飾酶”指的是修飾復合細胞壁或其部分的結構的任何酶。如果一種多糖表現出如上文所述的新的結構，那么該多糖的結構就認為是新的。在新的多糖中非糖修飾被忽略，負責轉移這些組分的酶不認為是多糖修飾酶(還可參見下文“輔助酶”的定義)。在本文中，多糖主鏈的生物合成中所涉及到的糖基轉移酶也不認為是多糖修飾酶。操縱合成酶的表達可以使多糖的結構發生重大的改變，但是與本發明相比，這種方法與獲得新的多糖的方法有根本性的不同，該技術并不依賴于修飾。但本發明也與鑒別具有多糖單糖殘基修飾功能的基因有關(參見下文“修飾酶”的定義)。一般來說，多糖修飾酶屬于參與多糖降解或代謝的酶類。這種酶的非限制性例子包括內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶、內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、內源性多聚半乳糖醛酸酶、內源性果膠酸鹽裂解酶、內源性果膠裂解酶、內源性半乳聚糖酶、內源性阿拉伯聚糖酶、內源性木糖葡聚糖酶、內源性葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、木糖聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、巖藻糖苷酶、外源性半乳糖醛酸酶和木糖苷酶。特別的多糖修飾酶的特定登記號包括棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)內源性半乳聚糖酶(登記號為L34599)或其同功酶或ortholog，例如來自塔賓曲霉(Aspergillustubigensis)的orthologAJ012316，鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶(登記號為L35500)或其同功酶或ortholog，和棘孢曲霉內源性1，5-α-阿拉伯糖苷酶(WO94/20611中的SEQIDNo1)或其同功酶或ortholog，例如來自黑曲霉(Aspergillusniger)的orthologL23430。術語“修飾酶”指的是一種酶，如轉移酶，該酶將單糖側鏈或非糖取代基，一般如feroyl、乙酰基或甲基酯加到果膠主鏈或支鏈上。修飾酶從也是轉移酶的進行果膠的主鏈多聚化的(同型聚半乳糖醛酸和改變鼠李糖聚半乳糖醛酸主鏈)和長側鏈(大量的半乳聚糖和阿拉伯聚糖)合成酶中分離出來。術語“輔助酶”指的是能除去由于上文定義的修飾酶而產生的果膠修飾酶。修飾使果膠不受多糖修飾酶的作用，于是，將多糖修飾酶與匹配的輔助酶共表達能促使大部分酶與果膠底物發生反應。輔助酶包括酯酶，如對同型聚半乳糖醛酸酶和鼠李聚半乳糖醛酸酶都具有特異性的甲基酯酶和乙酰酯酶，和能從聚合物中除去單個單糖的糖苷酶，如阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、木糖苷酶和巖藻糖苷酶。“分子養殖”是指利用植物作為載體進行與蔬菜、水果或其部分(如果汁或面粉)不同的特異分子的生產實踐。典型的用于回收精確限定的分子的植物產物是植物油、糖和淀粉。轉基因技術大大地增加了可以在植物中養殖的分子的范圍，此處所用的該術語特指這些較寬的含義。術語“ortholog″用來表示下列兩種來自不同有機體的基因(編碼酶)的關系如果序列相似性表明了進化相關性(但是邊緣的)，那么這些基因就認為是ortholog，他們的基因產物催化同樣的反應，他們在兩種有機體中具有基本相似或重疊的生理功能。術語“同工酶”用來表示下列兩種來自同一有機體的基因的關系如果序列相似性表明了進化相關性，且編碼的酶催化相似的反應，那么該基因就編碼同一基因產物的同工酶。同工酶可以，或不可以在有機體中行使不同的生理功能。術語“組織特異性”和“器官特異性”在用來指啟動子時，也包括可被同化誘導的啟動子。可同化誘導型啟動子只是由于其同化物，如蔗糖的誘導其接收器官中直接表達。為了實踐的目的，本文中的啟動子是貯藏器官特異性的。復合細胞壁多糖貯藏在細胞壁中，即原生質體的外面，然而其主要生物合成步驟發生在高爾基體。因此，多糖修飾酶從高爾基體轉移到原生質體，與其底物接觸，并在這些位置發生作用。本發明的一方面涉及到植物基因的異位表達，或者微生物基因的異源表達，一般來說，不考慮任何以確保其亞細胞器的準確定位的修飾。由植物基因編碼的非原生質體酶的信號序列一般能跨植物種起作用，當將其用于嵌合體結構中時也能指導表達產物進入正常情況下不積累該基因產物的器官中。甚至分泌型真菌酶在植物細胞中表達時也能定位到非原生質體。本領域的技術人員都知道構建一個基因的可用方法，該基因可分泌到內源基因不產生功能的非原生質體中，即一般用一個已知功能的植物或真菌序列代替非功能信號序列，或者提供無替換的所說序列基因。利用植物信號序列確促轉基因產物在高爾基體中的準確定位，顯然，本領域的技術人員能用合適的序列構建轉移基因用來在合成位點修飾細胞壁多糖，包括果膠。下文的實施例8描述了本發明的一個具體實施方式，其優點在于將能跨種系遠距離地準確操縱鼠基因的信號序列用于確保高爾基體的定位。本發明的另一步方面涉及編碼酶基因的共表達，該酶除去了一種特別的果膠修飾以促進其和底物接觸，從而催化所需多糖改造。本發明的這個實施方案涉及到用一種輔助酶，下文的實施例9將詳細介紹其構建和轉化。一般成對的酶(除非需要輔助酶以發揮合適活性的酶)的共表達的另一個方面涉及到自處理植物材料(如馬鈴薯中的自處理塊莖)。該實施方案包括用酶剪切預選擇部分或靶細胞壁多糖片段，如果膠，其部分或片段可以進行也可以不進行發行(在后者中，該技術不包括共表達)。用一種貯藏在植物細胞中與底物的分離的酶在采集后剪切預選擇部分或片段，即該酶在生長植物中不催化細胞壁多糖的任何改變。能產生這種剪切作用的酶的可能位置包括，但不限于液泡、內質網、細胞質和質體。根據在植物中的穩定性和該基因產物對植物的毒性來選擇位置。但是，如果能利用一種在室溫下能基本失活的或在植物非原生質體pH范圍(pH3-7.5)內能基本失活的酶避免與底物的互相作用(避免結合)，以便于在需要時合適地改變條件能使該酶激活，該酶也可以是直接貯藏在非原生質體中。激活處理包括(但不限于)加熱、加入鹽、加入有機化合物、物理處理(pH改變)、加入蛋白酶(例如切除修飾酶抑制部分的蛋白酶)、加入蛋白質(如修飾酶的另一種必需亞基)。概括的說，在需要的情況下靶多糖在體內被修飾。植物在采集后被處理，如通過在酶具有剪切活性的條件下溫育浸泡的植物材料，使貯藏的酶與其底物發生作用。然后在適于純化的階段回收釋放的片段。該技術在兩個方面優于使用工業酶工業酶很少具有足夠高的純度使之只對多糖需要剪切的片段和部分作用而不會因為存在側鏈活性而降解產物。許多植物器官、貯藏器官如馬鈴薯塊莖，內源多糖修飾酶的含量非常低。而且，具有剪切活性的這種酶相對于工業酶來說能更好的與其底物接觸，工業酶是另外加入的，其效果依賴于植物組織的均一化，不包括當酶和其底物在一起時或在其底物緊密相當的間隙中的情況。下文的實施例3和10表明細胞壁多糖修飾酶在細胞內質網中的滯留及將該酶定位于液泡中。實施例12提供了設計自處理植物材料，包括釋放修飾毛發區半乳聚糖酶的馬鈴薯塊莖的具體策略的例子，該實施例也證實了基因產物在細胞質中積累。迄今為止已有的技術應用，包括分子養殖剪切的寡和多糖。使用任何領域的技術可能使其它工業副產品的價值提高。來源于產糖甜菜產品的和來源于淀粉產品的果肉，是富含細胞壁多糖(包括果膠)的副產品的非限制性例子，其在天然狀態下價值低，但可通過本發明的方法提高其價值。醫藥應用包括提供藥物化合物和藥物材料，如傷口敷料、移植或植入材料、生物相容性的外科粘合劑、免疫調節化合物和血液凝結調節劑等。本發明的技術的用途不限于只是終產品的分子養殖，但是在發明的過程中是重要的。產生剪切多糖如果膠的植物，能用于包括一些醫藥用途的結構活性空間的聚合物庫和寡聚物的庫的系統發生，即在應用時功能不變的情況下描述允許的結構可變性。對于這些庫的評價數據，怎樣使用化學統計學多變量分析、QSAR(數量結構活性關系，quantitativestructureactivityrelationships)和QSPR(數量結構特性關系，quantitativestructurepropertyrelationships)是已知的。為了實現本發明的目的，欲進行修飾，即屬于微管植物的任何植物的復合細胞壁多糖的酶修飾，包括被子植物中的單子葉植物和雙子葉植物。考慮到剪切果膠，雙子葉植物和非鴨跖草苷(non-commelinoid)單子葉植物是特別重要的。相反地，在后者種類的一些種中修飾半纖維素聚合物是非常重要的，不僅飼料草和谷類。其他的用本發明可以修飾的商業上的重要植物包括，但不限于大豆、煙草、歐芹、胡蘿卜、花椰菜、甘藍、椰菜、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、甜菜、蘿卜、紅蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、胡椒粉、芹菜、柳樹、白楊樹、倭瓜、南瓜、夏季南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、李子、櫻桃、桃子、油桃、杏、草莓、葡萄、樹莓、黑莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、柑橘類、阿布屬類、鴨草(duckweed)和番茄。在非維管植物中，藻類和海草是重要的。在本發明的具體實施方案中，直接用酶來修飾果膠的毛發狀區，如通過去除光滑區的毛發狀區，和/或去除或縮短毛發狀區的單個側鏈。因此，為了產生其中的果膠的毛發狀區在體內被修飾的轉基因植物，表達這種酶的核酸序列是重要的。在本發明的涉及到“自處理植物材料”具體實施方案中使聚合物部分更好溶或使其從細胞壁其質中釋放出來的酶是重要的。因此，本發明的關鍵是能切斷所述多糖聚合主鏈的酶。本發明的技術人員能意識到，本發明中的細胞壁多糖是植物細胞壁在數量上和功能上都重要的組分。必須承認對于修飾的程度可能具有某種天然存在的限制。因此很明顯在本發明中進行的修飾就不會那么劇烈以至產生無生育能力的植株。在生長過程中，細胞壁的變化被削弱，從中產生的一些發展的變化可以獲得部分細胞切除，從而開發為制備雄性不育和提到的其他目的特性的路線。另一方面，如上文所述，本發明者驚訝的發現對單糖分布和整個細胞壁多糖的連鍵形式進行明顯的修飾是可能的，而且植株還保持生育能力。基于這些驚人的發現，用本文的這些技術在體內對細胞壁多糖進行各種修飾而不犧牲植物的發育能力。修飾復合細胞壁多糖的方法根據本發明，可以用幾種不同的方法在植物中或在采集所述的植物材料后修飾復合細胞壁多糖，下文將作簡要的介紹(i)通過調節與復合細胞壁多糖的生物合成直接相關的植物基因，如轉化和聚合步驟(通過操縱富集池的大小和底物分子的運輸)或通過表達多糖修飾酶來干擾聚合物的生物合成來操縱生物合成，其中多糖修飾酶在被翻譯和進入分泌路徑后被保留在高爾基體中，因此在果膠或半纖維碳水化合物合成的位置更新果膠或半纖維碳水化合物。(ii)通過表達合適的具有信號的多糖修飾酶進行保存后修飾，其中該信號能確保酶在翻譯后直接轉移到非原生質體空間及細胞壁，于是在到達或被吸附到細胞壁中后與酶底物直接相互作用。(iii)采集后釋放一種或多種在植物中產生的多糖修飾酶，接著在合適的細胞器官中進行翻譯后積累或通過選擇那些僅僅在采集后條件下具有活性而在活體植物中無活性的酶來間接隔室化。細胞壁多糖修飾酶的器官/組織特異性表達本發明欲定點表達多糖修飾酶，僅僅使所給植株的某些部分的細胞壁多糖被修飾，使更大范圍的細胞壁多糖的體內修飾成為可能。例如，想在馬鈴薯中，僅僅在塊莖中表達多糖修飾酶，而植株其他部分保持他們原有的多糖結構。根據本發明的這種定點表達多糖修飾酶可以通過使用組織特異性調控序列來實現。在現有技術中許多組織特異性序列是已知的。例如，US5,723,757公開了使用植物基因的5’轉錄調控區確保目標DNA序列的“接收組織”特異性表達。該轉錄調控序列使目標DNA序列的表達特異地發生在“接收器官”，即植物地光合成失活部位，如根、谷粒、果實或塊莖。于是，目的基因產物在某種組織中或被表達或被抑制。該調控區特別的來源于編碼patatin蛋白的基因，該基因屬于I類patatin基因。US5,436,393公開了一種含有來自馬鈴薯的patatin基因的馬鈴薯塊莖特異性調控區表達盒DNA序列，特別的是patatin基因的B33啟動子序列。用該表達盒轉化馬鈴薯細胞可能產生轉基因馬鈴薯植株，在該植株中，異源的DNA序列與B33啟動子序列融合，能在塊莖中特異性表達。其他已知的指導在塊莖中表達的啟動子包括來自馬鈴薯的推定的金屬羧肽酶(metallocarboxypeptidase)抑制劑(登記號為U30388)，馬鈴薯脂肪氧化酶(登記號為X95513)和組織蛋白酶D抑制劑(登記號為X74985)。本領域的技術人員能夠剪切其他具有目的特異性的啟動子區，與目標多糖修飾酶構建出嵌合基因結構。因為至少一些塊莖特異性啟動子的器官特異性是由于他們的蔗糖可誘導性，因此這些啟動子經常用于其他的蔗糖積累的種中，例如，甜菜根(煙草葉中的GBSS啟動子的活性將在實施例10中說明)是不奇怪的。相反，對于本領域的技術人員來說，蔗糖可誘導的啟動子可以從其他種物種中分離，且發現不僅僅在其來源植物中具有器官特異性，在馬鈴薯中還具有塊莖特異性是不奇怪的，確保高表達(如在馬鈴薯塊莖中)的啟動子包括GBSS和B33啟動子。修飾植物細胞壁多糖的生物合成利用在不同合成水平起作用的酶修飾果膠或半纖維多糖的機會(i)保持核苷糖的聚集，(ii)特定主鏈的多聚化，和(iii)用多種取代基(糖基、甲基和乙酰基)修飾這些主鏈。根據本發明，可以通過使多糖修飾酶定位于高爾基體干擾生物合成實現干擾生物合成。構建這種酶，使其能錨定在膜上，于是保持在高爾基體上，或者將其作為可溶性酶定位在高爾基體上，最終和細胞壁多糖一起分泌到非原生質體中。驚奇的發現，錨定在高爾基體膜上的酶成功地與結合在膜上地生物合成復合體發生反應。因此，膜錨定和可溶性變體，都具有所期望的高特異性。該實施方案還提供了一種解決由于一些分泌多糖水解酶對植物的毒性而產生的問題的方法。幾個證據支持通過用誘導的酶降解植物細胞壁釋放的寡聚半乳糖醛酸能引起植物細胞中的特異性反應的觀點(Moloshok等，1992)。因此，根據本發明可能一種或幾種用于植物細胞的體內修飾的潛在候選酶將會釋放碳水化合物類寡聚物，這些聚合物能引起與寡聚半乳糖醛酸所引起的相似的反應。已經發現來自煙草N-乙酰葡糖酰氨轉移酶I的N末端的77個氨基酸足夠滯留Nicotianabenthamiana細胞高爾基體的報告蛋白。Essl等(1999)和Dhugga等(1997)克隆了在多糖合成有暗示作用多肽，這些多肽和高爾基體相關聯，不是整合的蛋白(Pisumsativum可逆型糖基化多肽(RGP1)U31565)。來源Arabidopsis的一種乙酰葡糖酰氨轉移酶AJ243198和一種木糖轉移酶AJ272121已經被鑒定。完成Arabidopsis基因組的序列測定之后，本領域的技術人員都知道怎樣尋找能量外產生高爾基體定位基因產物的基因組。當鑒定出其它可溶的和整合的植物高爾基體蛋白后，其序列可用于構建高爾基體定位的多糖修飾酶。目前，有利的事實是至少有一些高爾基體靶序列在不相關物種中都具有功能。在本發明的一個具體實施方案中，可用來源于鼠基因的一個序列，該序列在實施例8中將被證實。細胞壁多糖的沉積后修飾下文的實施例5描述了利用真菌半乳聚糖酶使細胞壁多糖的預選片段或部分，例如果膠的毛發狀區的單糖分布發生定點改變，半乳聚糖側鏈被縮短到一定程度，使該側鏈不再與酶發生反應。植物通過增加糖醛酸的相對和絕對含量和增加乙酰化程度來補償。在本發明中，半乳聚糖幾乎不含有或不含有短的單糖側鏈修飾(一般是阿拉伯糖基修飾)，因此共表達輔助酶是不必要的。對于必要的情況，本發明的一個具體實施方案使用含有目的發造酶外加輔助酶的雙構建體，在處理過程中輔助酶起輔助作用，見實施例4和9。此外實施例2和7描述了鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶的表達，即一種能切斷果膠毛發狀區主鏈，能夠剪切果膠聚合物而對乙酰基和甲基酯修改不反應的酶。其中，輔助酶，一般為鼠李糖聚半乳糖醛酸或同型聚半乳糖醛酸乙酰酯酶或甲基酯酶，和主要的改造酶共表達從而使主鏈切斷不屬于上述情況。采集后修飾和自處理植物材料同上文解釋的那樣通過在植物組織中貯存一種和多種酶設計自處理植物材料，如塊莖，使其中的酶在體內不能和它的/他們的底物發生反應，而在采集后剪切目標片段。這種表達可以和在生長過程中催化靶細胞壁多糖改造的附加酶協同表達。如上文所述，在植物生長過程中處理酶的匯集可以是液泡、內質網、細胞質和/或質體，也可以是化學匯集。內部貯藏的酶可以利用KDEL滯留信號定位在內質網或者利用來源于patatin或sporamin的信號序列定位在液泡。接著進行采集后處理，一般為勻漿或軟化形式的物理處理，使內部貯藏的酶與細胞壁多糖接觸從而催化細胞壁材料的采集后修飾。采集后修飾的一個重要且有意義的實施方案是從漿汁材料中釋放體內修飾的聚合物。以剪切過的果膠毛發狀區作為例子，通過酶的作用切斷果膠的光滑區釋放出聚合物。下文的實施例12描述了將植物或真菌內源性多聚半乳糖醛酸定位到細胞質、液泡和滯留在內質網(ER)。在這些點內部，根據穩定性和酶在每一位點獲得的積累以及當貯存在不同位點時酶對植物可能的毒性來挑選細胞內位點。根據內部貯存的酶的特性、在植物組織中對內源性酶的阻礙、恢復的聚合物或寡聚物穩定性可能來選擇自處理植物材料的軟化和溫育條件。根據上文描述，我們能夠明白酶或許需要一種輔助酶，因此，可以制備三元的或更高級別的載體結構來擴展本發明的該實施方案。具有能從細胞壁多糖網孔中釋放果膠多糖屬性的酶特別包括那些能切斷多糖主鏈的酶(任選地在輔助酶地協助下)。果膠和果膠酯水解酶和裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶和裂解酶是公知地具有這種特性的酶。對木糖聚半乳糖醛酸具有活性的酶同樣是有用的，他們被作為對多糖主鏈的特別結構特征具有活性的例子。在本發明中，能除去果膠側鏈的酶被認為是主要的改造酶。但是很明顯側鏈的去除將促進特定寡糖的溶解。很明顯，將酶進行內部貯藏的技術可以用于分子養殖。同樣地，很明顯該技術可以用于制造功能性飼料。“功能性飼料”是指家禽和牲畜的飼料，在該飼料中一種或更多地細胞間積累的多糖修飾酶提高了植物材料自身和與其混合的其他飼料成分的可消化性。實施例10證實了在馬鈴薯葉的內質網中積累了阿拉伯聚糖酶。修飾的果膠或其片段在食品工業上的應用果膠是一種重要的食物添加劑和配料，是決定植物材料結構的重要因素。果膠的結構修飾，特別是在分子嚴重分支的區域(毛發狀區)將改變聚合物的物理特性和細胞壁材料的性質。該技術調控中性糖側鏈和同型聚半乳糖醛酸的比例。食品工業主要感興趣的，與這個比例相關的果膠的功能性質包括凝膠性、凝膠的穩定性和水結合效率。當毛發狀區的比例較高時聚合物的水結合效率較高，當同型聚半乳糖醛酸的含量高時凝膠性和凝膠的穩定性較好。由于馬鈴薯果膠具有高的中性糖含量和存在乙酰基阻礙凝結，所以沒有發現其在食品應用中有任何用途。從歷史的觀點來看，高質量的檸檬和酸柚果膠一般被直接用于一方面為凝膠劑、果醬等(高甲基酯果膠)和另一方面為低糖產品(低甲基酯果膠，如果膠酸鈣)。但是，在最近二十年中，應用領域已經擴大，現在包括用作乳化劑和穩定劑和烘干前作為產品的衣殼。果膠來源的分子的新的應用包括用作可飲用性節食纖維。其中有一個問題是果膠有很高的粘性。但是，已經證實，當降解果膠中的同型聚半乳糖醛酸部分時，鼠李糖聚半乳糖醛酸部分(修飾過的毛發狀區，MHR)保持同樣的纖維效果，而其粘性大大降低(EP0868854-A2)。通過本發明從剪切過的馬鈴薯果膠產品中能得到相似的MHR。優點是馬鈴薯漿汁原材料的兩個特性低消耗和原材料豐富。理想地，在淀粉處理過程中，馬鈴薯中的PG活性被激活，直接在馬鈴薯的汁液中，如自處理塊莖中修飾毛發狀區。這樣處理淀粉比較容易且修飾毛發狀區的耗費低。淀粉的易化處理可以是由于提高了可萃取性或者是由于“較少包裝”的塊莖細胞，即作為細胞壁的一種有意剪切或作為一種果膠修飾的副作用的細胞的細胞壁變薄。除了只與貯藏器官相關的淀粉抽提外，與一些(豐富的)原料的果膠量低相關的問題，及本技術提供的方法，都不是是馬鈴薯特異性的。該技術也適合用于其他農作物，如產糖甜菜。更進具體地食品應用還需要控制水結合能力和粘性和聚合物溶液的“口感”。鼠李糖聚半乳糖醛酸，無論是原有的還是剪切的，可以用于低粘度產品如牛奶shakes、飲用型酸乳等。果膠加工技術可以更進一步地用于果汁、蘋果酒和葡萄酒工業，因此，與葡萄、蘋果和其他水果有關。果汁和鮮葡萄汁經常要過濾以除去水狀膠質和懸浮的寡聚和多糖，從而使果汁澄清，防止在后續處理步驟中產生渾濁或沉淀。過濾剪切的果膠以增加穩定性，或相反的增強可沉淀性。本發明提供控制這些果汁和鮮葡萄汁性質的新方法，這些果汁的性質依賴于可溶解和懸浮的果膠聚合物。最后，因為果膠調節細胞壁的孔隙(Baron-Epel等，1988)，所以剪切的果膠可能會影響鈣的固化和罐頭制造的相似處理過程。于是本發明利用含有上文描述的修飾果膠的植物材料，提供了一種提高植物材料食品工業可處理性的方法，一般地如在罐頭制造、鈣固化、過濾等。修飾過的植物細胞壁多糖的醫藥用途除了上文討論的修飾果膠多糖用于不同工業應用的多種可能性外，修飾細胞壁多糖包括修飾果膠基質，還可以用于藥品和醫療領域的多種應用。例如本發明使在體內修飾細胞壁多糖的結構以產生具有特別屬性，如免疫調節性的修飾多糖或成為可能。更進一步地，根據本發明制備和產生的修飾過的細胞壁多糖還適合于用作許多種炎癥反應的消炎化合物的廣泛應用，無論是因為什么原因，包括物理損傷、化學試劑和生物試劑，如細菌、真菌、病毒和其他微生物引起的炎癥。剪切的復合細胞壁多糖的應用涉及到兩個基本領域藥學的和醫學的材料。目前用來制備用于慢性的、未愈合傷口、牛皮癬(對于疾病具有一種自我免疫的成分)導致的傷口、壞疽的傷口和造口術成品傷口敷料的材料幾乎完全依賴于藻酸鹽和根據物理性質挑選的修飾的纖維素(他們一般含有許多果膠和半纖維素聚合物)。對于治療各種形式慢性傷口的傷口敷料，物化屬性是重要的。這些屬性包括膠凝能力和膠凝強度、水結合能力、電荷濃度和親水性。對這些屬性與植物多糖的食品工業應用的關系進行研究。修飾過的細胞壁多糖能夠產生水緩沖系統的作用，在其中敷料既可以除去傷口中的水，也可以將水提供給干性壞疽以使細胞免疫系統能夠進入表面。但是，果膠的生物學活性是果膠所獨有的。需要的生物活性包括果膠作為細胞生長因子池，從而促進慢性傷口中的細胞生長的潛能。另一個有意義的方面是利用果膠膜作為預移植的皮膚細胞再生長的支架。用作抑制自身免疫過程或預防或治療免疫過程影響的藥物的用途是可以預料的可以用于較寬范圍的疾病。某些形式的潰瘍被認為與自身免疫有關，并發現在這種情況下果膠的結構(可能是鼠李糖聚半乳糖醛酸)有活性(Sakurai等，1998)。更進一步，這種與自身免疫有關的疾病的非限制性例子包括自體免疫型肝炎、初級膽硬化、初級硬化型膽管炎，自體免疫型溶血型貧血癥、Grave’s病、肌無力、I型糖尿病、炎性骨骼肌變、多發性硬化、淋巴瘤性甲狀腺腫、自體免疫型腎上腺炎、Crohn’s病、潰瘍性結腸炎、血管球性腎炎、漸進式系統硬化癥(硬皮病)、Sjogren’s病、紅斑狼瘡、初級血管炎、風濕性關節炎、原生性關節炎、結締組織綜合癥、牛皮癬、天皰瘡(Pemfigus)、類天皰瘡(Pemfigoid)、皰疹樣皮炎等。修飾的果膠和其他的多糖的另一種可以預料的用途是能用來治療一些形式的癌癥。有證據表明，修飾過的柑橘類果膠(MCP)能治療多種形式的癌癥，包括惡性黑素瘤(皮膚癌)和前列腺癌。這種效果被認為是與MCP在轉移的早期階段具有抑制細胞生長或抗粘連活性有關(RalphW.Moss，http/ralphmoss.comlmcp.html)。通過使用本發明的方法來鑒定和制備修飾的果膠多糖，我們相信適合于用來作為抗癌試劑的包括修飾過的果膠糖在內的細胞壁多糖能夠開發，且能夠商業制備，例如通過分子養殖技術。在醫學領域的應用并不嚴格限制在藥學的和醫學的材料，還與在先發現階段有關，即作為制備細胞壁多糖寡聚和多糖文庫和鑒定該寡聚和多糖所需藥物活性的所必需的結構的工具。例如，合成的果膠聚合物包括重復結構，這些重復結構又由其他的更小的重復結構組成。然而本文的改造技術不改變果膠聚合物的性質發生改變的事實，可能會產生分子群，其中這些分子的差別是相當清楚的。例如，實施例5描述的來源于能表達內源性半乳聚糖酶的塊莖的鼠李糖聚半乳糖醛酸和相應的野生型多糖相比，其半乳聚糖毛發的長度、乙酰化程度和糖醛酸含量是不同的。因此可以鑒定這些特征是否是所觀察生物活性所必需的。以果膠作為例子，入口不同的已知(即使還不知道其精確結構)文庫能用以下步驟制備1)從一些轉基因植物收集剪切的果膠，其中每種轉基因植物以精確限定的方式產生修飾的多糖。2)將步驟1中的樣品再分離，在體外用酶進行采集后處理。3)將步驟2中的樣品再分離，在體外通過化學處理，如皂化和部分水解及衍生的方法進行修飾；后者包括但不限于預甲基化、乙酰化、環氧化和酰氨化。衍生的方法的類型和方法本身是食品工業、紡織工業和有機物合成和碳水化合物光譜學領域公知的。如果需要，步驟2和3可以以相反的順序進行，于是化學修飾的目的是保護或使分子的一些部分暴露于酶反應。然后，用現有技術已知的監測方法監測文庫的醫藥活性。當特定化合物的結構和功能的關系變得明顯時，這提供了有用的信息來決定是否要轉移一些用于采集后的酶處理劑(步驟2)到植物上(植物的補償允許，從而制備出轉化植物以用于起始材料的分子養殖，其中起始材料通過體內處理果膠的方式被盡可能剪切。將通過下文的非限制性實施例和附圖對本發明作進一步的描述。圖1顯示了使用探測性主成分分析(PCA)來區分野生型和兩種表達來自野生型棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)內源性半乳聚糖酶的轉基因馬鈴薯植株T11.1和T13.1，用第三和第五主成分(PC)數值將T13.1和野生型作了對照；圖2顯示了鼠李糖聚半乳糖醛酸(RGI)大小排阻色譜分析(通過折射率檢測)(任意單元)，RGI特異地分別從經過真菌EPG和PME的聯合處理的野生型馬鈴薯塊莖(WT)和轉基因馬鈴薯植株T11.1和T13.1的細胞壁中分離出來。相對于野生型，這種EPG/PME處理從轉化塊莖的細胞壁中釋放出兩倍的糖醛酸(UA)。如同UA含量和折射率檢測所顯示的那樣，用EPG/PME從細胞壁中抽提出的RGI含有兩種主要的成分成分A(分子量大于500Kda)和成分C(分子量為0.2-8KDa)。T11.1和T13.1中EPG/PME抽提物與野生型的不同，含有較少的成分A，更多的成分C，另外還有野生型中不存在的小于120KDa的片段(成分B)。其中的星號表示不含果膠材料的樣品緩沖鹽的存在而導致的大波峰；和圖3表示野生型(A，C)和表達內源性半乳聚糖酶(T13.1)(B，D)的馬鈴薯塊莖的切面，其用單克隆抗體LM5金標記，銀增強，通過反射聚焦掃描顯微鏡(A，B)和透射電子顯微鏡(C，D)觀察。野生型的實質細胞的細胞壁被強烈標記(A中的白色，C中的黑色顆粒)，但是在T13.1的塊莖中，標記的密度大大降低，且標記的位置僅僅在靠近質膜(D中的箭頭)的一些細胞的角落(B中的箭頭)。星號代表淀粉粒曾經占過的空間。ML表示這些填滿的角落中膨脹的中央薄片。比例A和B是100mm，C和D是2mm。實施例材料和方法試劑和酶除非另有說明，常規分子生物學方法所用的所有酶都是從丹麥的Boehringer購得。用于細胞壁性質的化學藥品和試劑都是從Sigma公司購得。豬胰腺α-淀粉酶是從Merck(Darmstadt，德國)購得，來自Bacillusacidopullulyticus的支鏈淀粉酶和來自黑色曲霉的內源性多聚半乳糖醛酸酶從MegazymeInternational(Bray，愛爾蘭)購得，純化的來源于棘孢曲霉的重組果膠甲基酯酶(PME)是由KirkSchnorr博士(NovoNordiskA/S，Bagsvaerd，丹麥)贈與的。植物的轉化煙草(Nicotianatabacum(L.))cv.Xanthi.葉盤的轉化基本上與Horsch等1985所描述的相同。來源于轉化植物和野生型植物的體外節間被轉移到溫室中使之發育成成熟植株。采集葉子用于分析。馬鈴薯、cvPosmo和Karnico用于根瘤土壤桿菌介導的轉化(Visser，1991)。將在體外轉基因的枝條和對照克隆轉到溫室中使之發育成成熟植株。DNA分析根據Rogers和Bendlich(1988)所描述的CTAB方案從在液體N2中研磨的葉子中抽提取DNA。為了鑒定轉基因克隆中轉基因的存在，分離基因組DNA，用在cDNA中剪切兩次的EcoRl和在cDNA中剪切一次的Kpnl消化。電泳分離消化的DNA，根據Sambrook等描述(1989)的方法在堿性條件下將其印跡到HybondN膜(Amersham)上。如同alehuzzaman等(1992)所描述的方法，用32P-ATP標記的鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶/pYES2的1kb的Kpnl-XbalcDNA片段來雜交膜。RNA分析用Kuipers等(1994)所描述的方法從每個轉基因系的一個塊莖中抽提RNA，將組織(5g)在液體N2中研磨，和5ml的抽提緩沖液(50mMTris，pH9.0，10mMEDTA，2％SDS)和5ml的苯酚混合。離心(2，000g10分鐘)該混合物，用5ml的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提上清，再次離心混合物。用5ml的異丙醇沉淀核酸，離心(10分鐘，2000g)，將沉淀溶解到1125ul的H2O中。加入375ul的8MLiCl在0℃條件下過夜沉淀RNA并離心(10分鐘，13,000g)，將RNA沉淀溶解到0.4ml的水中，用40ul的3MNaAc和1ml的乙醇沉淀。離心后用70％的乙醇沖洗沉淀，干燥，重懸于水中。按Sambrook等(1989)所述方法，每個樣品用40ug的塊莖RNA來進行RNA凝結印跡和雜交。用32P-ATP標記的cDNA探針鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶/pYES2的1kb的Kpnl-Xbal片段和馬鈴薯28S核糖體RNA基因的2.3kb的EcoRl片段(L和smann和Uhrig，1985)來雜交膜。葉和塊莖抽提物的制備將新采集的葉片冷凍于液體N2中，每克組織(鮮重)加入3ml的抽提緩沖液A(25mMNaOAcpH5.0，含有完整的TM，BoehringerMannheim)，用研棒和研缽研粹。在冰上將樣品保溫10分鐘，離心(18,000xg)10分鐘沉淀不可溶物，回收上清，在20℃下保藏。將新采集的塊莖切成小塊，在液體N2中冷凍，用電子研磨機研成粉末。根據上述方法用抽提緩沖液A抽提粉末。半乳聚糖酶活性分析利用含0.5％上層和1％下層瓊脂(在pH4.5的50mM檸檬酸鈉中)的平板法測定酶活。上層含有懸浮的底物天青蛋白偶聯的馬鈴薯半乳聚糖(MegazymeInternational，Bray，愛爾蘭)，濃度為1mg/ml。部分(20ul)組織上清加到上層所打的孔中，將平板在室溫下保溫24小時。可溶解的半乳聚糖酶的定量分析.對野生型和轉化體(T11.1和T13.1)中的塊莖抽提物中的內源-半乳聚糖酶活性進行分析，方法是以0.1mNaOAc(pH4.0)中的濃度為0.1％的馬鈴薯半乳聚糖(從Megazyme購得的P-GALPOT)作為底物，在40℃下利用p-羥基苯甲酸雜交分析法分析。阿拉伯聚糖酶活性分析利用含0.5％上層和1％下層瓊脂(在pH5.5的50mM檸檬酸鈉中)的平板法測定酶的活性。上層含有懸浮的底物天青蛋折偶聯的馬鈴薯半乳聚糖(MegazymeInternational，Bray，愛爾蘭)，濃度為1mg/ml。部分(20ul)組織上清加到上層所打的孔中，將平板在室溫下保溫24小時。曲霉菌RG-裂解酶測定將冰凍的馬鈴薯組織在加有液態氮的研缽中研碎。用Ultra-TurraxTP18-10(14,000rpm，kaWerk，Staufen，德國)在2ml含有0.4MNaCl的0.25M磷酸鈉緩沖液(pH6.5；4℃)中將約1g的馬鈴薯組織研粹，在4℃抽提(周期性搖晃)1小時后，離心(10分鐘，2,000g)懸浮液。上清用作酶抽提物。然后，將5ul的上清加到245ul0.25％w/v的皂化的蘋果MHR(溶于0.1m，pH5.0的磷酸緩沖液)溶液中。在漩渦混合器中40℃保溫15分鐘，在100℃加熱5分鐘使酶失活。用HPSEC(BioGelTSK40XL，30XL，和20XL柱系列)來測定皂化蘋果MHR的降解。SDS-PAGE和Western印跡根據標準方法，進行塊莖抽提物的SDS-PAGE和Western印跡分析。印跡用兔抗體來檢測，該抗體對純化的曲霉菌半乳聚糖酶(由哥本哈根大學的Jens-ChristianNavarroPulsen，CentreforCrystallographicStudies贈送)具有抗性。傅立葉(Fourier)轉化紅外線微光譜分析將來源于體外植物20片葉的剝落的表皮和來源于20個新鮮采集的野生型和轉基因型(11.1，11.2和13.1)塊莖的Vibratome切面(60um)封固在氟化鋇窗口上，風干。該氟化鋇窗口安裝在Bio-RadFTS175cFTIR分光計的UMA500顯微鏡附件處，該分光計安裝有液態氮冷卻型碲鎘汞檢測器。挑選層皮和環髓區域的100um2的面積并取得光譜。收集在8cm-1的溶液和共增加的以提高每個樣品信噪比的傳輸模式中的六十四干涉圖。將光譜進行基線校正和區域標準化。使用WINDISCRIM軟件(E.K.Kemsley，InstituteofFoodReseach(食品研究學院)，Norwich，英國)在1800到800cm-1的區域進行區域標準化的光譜探測性主成分分析(PCA)。分析轉基因馬鈴薯塊莖中的果膠為了測定馬鈴薯植株中果膠的精細結構，首先必須從馬鈴薯塊莖中分離細胞壁材料(CWM)。馬鈴薯塊莖去皮，切成方塊，在液態氮中冷凍。然后，將100g組織用BraunMultimixMR860廚用切粹機(2×30秒，350watt)切成粉末。在300ml含有TritonX100(2mg/ml)的陽離子混合緩沖液(10mMNaOAC，3mMKCl，2mMMgCl2和1mMCaCl2)中，4℃下用Ultra-TurraxT25(24,000RPM)7×60s將該粉末勻漿。加入幾滴辛醇以減少混合過程中產生的泡沫。用冷卻的陽離子混合緩沖液沖洗通過250和36um的網篩以除去其中的去污劑。這個過程在4℃下進行。除去網篩中的殘余物質，在50％的冷丙酮中攪拌。過濾樣品，倒入一個大炔杯中稱重。加入5倍樣品重量的飽和酚溶液。攪拌30分鐘后，吸去飽和酚，在3級燒結玻璃漏斗上用陽離子混合緩沖液沖洗剩余物。剩余物在液氮中冷凍成稱小顆粒，在咖啡研磨器中低溫研磨2×15秒，樣品融化后立即與陽離子混合緩沖液混合成糊。迅速該糊攪拌將加到大體積的煮沸的陽離子混合緩沖液中，并煮沸30秒煮沸后后立即將混合物倒入到冷卻的陽離子混合緩沖液(10倍體積)中迅速冷卻。在含有0.01％w/vNaN3的陽離子混合緩沖液中用1,500單位的α淀粉酶(Boehringer)和400單位的支鏈淀粉酶(Megazyme)除去淀粉。在軌道搖床上37℃攪拌樣品過夜。如果還存在淀粉，用酶重復處理。用1％比Kl/0.5％I2在光照顯微鏡下檢測淀粉的存在。當用Kl染色檢測發現淀粉去除完全后，在36um的網篩上沖洗細胞壁以除去其中的葡萄糖和鹽。剩下的物質冷凍干燥作為細胞壁材料。根據Huisman等(1999)描述，用不同的溶劑抽提以分離獲得的CWM。每1g的CWM用70ml0.05M乙酸鈉緩沖液，pH5.2在室溫下抽提兩次60分鐘，用40ml0.05M乙酸鈉緩沖液，pH5.2在70℃下抽提三次45分鐘，用35ml含有0.05MEDTA和0.05M草氨酸的0.05M乙酸鈉緩沖液，pH5.2在70℃下抽提三次45分鐘，最后用40ml0.05M乙酸鈉緩沖液，pH5.2在2℃下抽提三次45分鐘。在每次抽提步驟后，將懸浮液在3級燒結玻璃漏斗上過濾。于是產生5個不同組分冷緩沖可溶性固體(CBSS)，、熱緩沖可溶性固體(HBSS)、螯合劑可溶性固體(ChSS)、堿性可溶性固體(ASS)和富含半纖維素的殘余物(Res)，每一種組分含有不同的細胞壁聚合物。在進行進一步的分析之前，將所有的組分都冷凍干燥。用不同的技術鑒定CWM和組分通過使樣品被1MH2SO4水解(100℃下3小時)來鑒定中性糖的組分。然后，釋放的中性糖轉變為他們的糖醇乙酸酯，在CarloErbaFractovap2300氣相色譜儀(意大利的米蘭(Milan，Italy))中用2mm的被3％0V275(Chrompack，Middelburg，荷蘭)包被，裝有ChromWAW80-100目的玻璃柱在200℃下分離，安裝一個火焰電離檢測器，設置為270℃，用環己六醇作為內部標準。利用Voragen等(1986)的方法通過HPLC測定乙酰基和甲基酯化的程度。果膠酶，例如多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶、內源性阿拉伯糖酶、內源性半乳聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、半乳糖苷酶、果膠裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶，與高效大小排阻層析法(BioGelTSK40XL，30XL，和20XL系列柱)和高效陰離子交換層析結合進一步測定果膠組分的結構，其中高效陰離子交換層析使用安裝有DionexCarboPacPA-100柱(250×4mm，20C)的Dionex(Sunnyvale，CA，USA)Bio-LCGPM-II四梯度模式。但是溶解性問題會阻礙本實驗的進行。對野生型馬鈴薯的結構分析獲得的結果將用來與轉基因馬鈴薯果膠進行比較，使組分保持溶解狀態而不將他們冷凍干燥被認為能解決酶定性過程中發生的溶解性問題。進一步地，利用MALDI-TOFMS通過研究純的和很好定性的酶所釋放的片段能獲得額外的信息。果膠多糖的分離根據O’Neill等(1990)的方法，將脫淀粉細胞壁材料(10mg)懸浮在2ml含有0.05％疊氮化鈉的pH4.5的50mM甲酸銨中。加入EPG(1u，每分鐘1單位釋放1umol的降解半乳糖醛酸酯)和PME(1u，每分鐘1單位釋放1umol的甲醇)，在40℃下溫育懸浮液16小時。然后將懸浮液過濾通過一個雙層尼龍(孔徑30um)，從而使EPG/PME抽提物和殘余的細胞壁材料分離，殘余的細胞壁材料懸浮在1ml含有10mM硼氫化鈉的50mM的冰凍碳酸鈉中。懸浮液在4℃保溫1小時，接著在室溫下培養4小時，通過一個雙層尼龍過濾除去不溶材料。將濾出液的pH值調到5，加入EPG(1u)，在40℃保溫混合物4小時，使溶解的果膠材料部分解聚。這種被消化的溶解細胞壁材料命名為碳酸鹽抽提物。用Superose12柱(1×30cm，AmershamPharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)進行EPG/PME和碳酸鹽抽提物大小排阻層析。在抽提物上柱之前用50mM的pH5.0的甲酸銨平衡柱，用同樣的緩沖液在0.4ml/min的低速下isocratically洗脫。用折射指數檢測儀(Model131，Gilson，Middleton，WI)監測洗脫液，用m-羥基聯苯分析法(Blumenkrantz&Asboe-Hansen1973)測定收集的組分(0.8ml)的糖醛酸含量。富集某些組分，冷凍干燥，測定其單糖組成。將其滯留時間與標準葡聚糖(Fluka，Buchs，瑞士)和半乳糖醛酸的滯留時間相比較，估算流出液組分的分子量，單糖組成分析用Seaman水解法(Selvendran等，1979)水解的天然或不溶的細胞壁殘渣進行單糖組成分析，而用2MTFA水溶液在121℃下作用可溶細胞壁組分1小時使之水解成單糖。Seaman水解法如下所述進行將細胞壁殘渣(2-4mg)加入到裝有100ul超純水的螺口硼硅酸鹽測試管中，加入300μl濃H2SO4，懸浮液在室溫下偶爾旋轉放置3小時。然后用6.6ml超純水稀釋，100℃加熱2小時。冷卻后，用飽和氫氧化鋇中和溶液。離心(1000xgmax)5分鐘除去BaSO4沉淀，剩下的上清液通過轉子汽化濃縮，測定其單糖組成。單糖混合物(5-15ug)加到Carbo-PacPA10柱(Dionex，Sunnyvale，CA，USA)中，用1.5ml/分鐘流速的水洗脫。向柱上加入氫氧化鈉(300mM)，繼續以0.5ml/分鐘的流速連續洗脫，用脈沖電流檢測計(Dionex)監測洗脫液。通過與標準糖(海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖)的滯留時間相比較鑒定洗脫的單糖，通過比較各個單糖產生的標準曲線和整合其各自的波峰面積來定量洗脫的單糖。通過m-氫氧聯苯法(Blumenkrantz和Asboe-Hansen1973)測量每種單糖混合物中的糖醛酸含量。測定酯化程度根據Voragen等(1986)描述的方法通過HPLC估算乙酰基和甲基酯化的程度。馬鈴薯塊莖的免疫金標記基本如同Bush和McCann(1999)的描述對轉化子和野生型的塊莖細胞壁進行性質分析。簡要的說，用戊二醛固定的來源于野生型和轉化子13.1的塊莖的低溫樹脂包埋部分，用mAbLM5(識別1，4-β-半乳聚糖(Jones等1997))對該塊莖進行免疫金標記，銀增強，用上述McCann等(1992)的方法，用反射激光掃描聚焦顯微鏡和電子顯微鏡進行分析。實施例1用于植物轉化的一般DNA構建體DNA構建體pPGB121s-new用聚合酶鏈反應(PCR)擴增載體pPGB121s(R.Visser贈送)中顆粒束縛的淀粉合成啟動子區，引物序列是5’GATTACGCCAAGCTTTAACG3’(SEQIDNO1)和5’GGTTTGTCGACGAAATCAGAAATAATTGGAGG3’(SEQIDNO2)，從而在PCR產物的3’末端導入了一個HindIII5’位點和一個SalI位點，另外，PCR方法刪除了GBSS5’非編碼區的一個假轉錄起始密碼子。該產物通過瓊脂糖凝膠電泳純化，連接到pGUSNos(L.Sander贈送)的HindIII/SalI酶切產物pGBSS-GUSNos上。用HindIII和XbaI從pGBSS-GUSNos中切除GBSS啟動子片段，純化后，克隆到HindIII/XbaI消化的pBI121(Datla等1992)上，得到載體pPGB121-new。將該載體用Smal和Sacl消化，以除去GUS編碼區。接著，用Klenow片段使Sacl粘性末端變平，通過連接封閉載體形成pPGB121s-new。DNA構建體pPGB121s-B用SalI和BamHI完全消化載體pPGB121s-new，通過瓊脂糖凝膠電泳純化。通過兩個合成的寡核苷酸序列5’TCGACCGGTACCTAGGCCCGG’3(SEQIDNO3)和5’GATCCCGGGCCTAGGTACCGG3’(SEQIDNO4)退火產生多(位點)接頭，在Sall/BamHI酶切的載體上克隆該多接頭。該步驟得到含有MCS的載體pPGB121s-B，MCS具有唯一的AgeI，KpnI，AvriI，SmaI和XmaI位點。DNA構建體pGEd用HindIII消化pPGB121s-new，接著在核苷酸存在的情況下用Taq酶在72℃反應7分鐘填平粘性末端，從而除去HindIII位點。將得到的產物用瓊脂糖凝膠電泳純化并封閉連接，產生pPGB121s-new-DHindIII。通過用兩種合成的寡核苷酸序列5’TCGACAAGCTTTCTAGAGCCTCGAGG3’(SEQIDNO5)和5’GATCCCTCGAGGCTCTAGAAAGCTTG3’(SEQIDNO6)退火產生新的多接頭，將該多接頭克隆到原始多克隆位點(MCS)的保留部分，產生質粒pGED。新的MCS導入了HindIII，XbaI和XhoI的限制位點。DNA構建體pADAP用SalI和BamHI消化pGED，通過瓊脂糖凝膠電泳純化。通過用兩種合成的寡核苷酸序列5’TCGACCGGTACCAAGCTTGCGGGCTCTAGACTCGAGCCTAGGCCCGG’(SEQIDNO7)和5’GATCCCGGGCCTAGGCTCGAGTCTAGAGCCCGCAAGCTTGGTACCGG’(SEQIDNO8)退火產生一種新的多接頭，將該多接頭克隆到pGED的原始MCS的保留部分中，產生質粒pADAP。新的MCS導入了AgaI，KpnI，HindIII，XbaI，XhoI，AvriI和SmaI的限制位點。DNA構建體pPGB121s-B-B33用EcoRI消化載體pBINB33(L.Willmitzer贈送)，通過瓊脂糖凝膠電泳純化。通過寡核苷酸5’AATTCAAGCTTG3’(SEQIDNO9)和5’AATTCAAGCTTG3’(SEQIDNO10)退火產生一個編碼HindIII位點的接頭，將該接頭克隆到EcoRI酶切的pBINB33載體中。該步驟產生載體pBINB33-EHE。為了分離含有patatinB33啟動子的片段，用HindIII和SalI消化載體pBINB33-EHE。將得到的片段克隆到HindlIII/SalI消化的pPGB121s-B中，得到質粒pPGB121s-B-B33.實施例2進行植物轉化的含有定位到非原生質體的多糖修飾酶的特異DNA構建體DNA構建體pGED-GAL用HindIII和XbaI消化切除載體pC1G1(S.Kauppinen贈送)，中編碼棘孢曲霉半乳聚糖酶的1.3kb的cDNA，純化并克隆到pGEDMCS的相應位點，構建表達盒GBSS啟動子、內源性半乳聚糖酶、胭脂堿合成終止子。該DNA構建體被稱為pGED-GAL。pGED-ARA的構建用HindIII和XbaI消化切除載體pC1A4(S.Kauppinen贈送)，中編碼棘孢曲霉阿拉伯聚糖酶的1.2kb的cDNA，純化并克隆到pGEDMCS的相應位點，產生質粒pGED-ARA。DNA構建體pADAP-ARA用HindIII/SalI消化，從pGED-ARA中分離出編碼棘孢曲霉阿拉伯聚糖酶的1.2kb的片段，將其克隆進預剪切的pADAP，這一步產生載體pADAP-ARA。DNA構建體pADAP-GAL用HindIII/SalI消化，從pGED-ARA中分離出編碼棘孢曲霉半乳聚糖酶的1.3kb的片段，將其克隆進預剪切的pADAP，這一步產生DNA構建體pADAP-GAL。DNA構建體pPGB121s-B-B33-ARA用KpnI和SmaI消化，從pGED-ARA中分離出編碼棘孢曲霉阿拉伯聚糖酶的1.2kb的片段，然后將其克隆進預剪切的pPGB121s-B-B33中，這一步產生DNA構建體pPGB121s-B-B33-ARA.。DNA構建體pPGB121s-B-B33-GAL用KpnI和SmaI消化，從pGED-ARA中分離出編碼棘孢曲霉半乳聚糖酶的1.2kb的片段，然后將其克隆進預剪切的pPGB121s-B-B33中，形成表達盒PatatinB33啟動子、內源性半乳聚糖酶、胭脂堿合成終止子。這一步產生DNA構建體pPGB121s-B-B33-GAL。DNA構建體pPGB121s-new-RHGB用限制性酶SalI消化植物轉化載體pPGB121s-new，用Klenow酶消平末端，加熱使這兩種酶失活后，進一步用限制酶XbaI消化。用限制酶BamHI消化含有編碼棘孢曲霉鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶cDNA的載體pYES2/RHGB，用Klenow酶消平末端，加熱使這兩種酶失活后，進一步用限制XbaI酶消化。瓊脂糖凝膠電泳純化被處理的載體和插入的cDNA，并進行連接，形成DNA構建體pPGB121s-new-RHGB。實施例3設計將基因產物定位到細胞間隙的構建體DNA構建體pADAP1ARA-KDEL以載體pGED/ARA為模板，用引物ACAGCTCAACAAGTGGTAAC(GBSSpro引物，SEQIDNO11)和GACTTCTCGAGTGGCTGG-CCTGTTGTGAAGGATGAACTTTAGTCTAGAAATGCTC(ARA-KDEL引物2，斜體表示編碼KDELER停滯信號的核苷酸，粗體表示構建的終止密碼子，SEQIDNO12)擴增編碼阿拉伯聚糖酶的cDNA，根據制造商(Invitrogen)的方法將得到的產物克隆到載體pCR2.1-TOPO中。這一步產生不同的方向含有ARA-KDEL產物的載體pCR2.1-TOPO/ARA-KDEL1和2的混合物。為了減少在PCR過程中由于錯誤導入而產生的表達問題的可能性，將大部分的ARA-KDEL編碼區和來源于酵母表達載體pC1A4中的原始ARAcDNA的編碼區進行交換。用SalI和XbaI剪切載體pCR2.1-TOPO/ARA-KDEL1和2，將產生的KDEL編碼片段克隆進SalI/XbaI-酶切的pC1A4。于是產生載體pYES2.0/ARA-KDEL。用HindIII和XbaI酶切載體pYES2.0/ARA-KDEL，將得到的ARA-KDEL片段克隆到HindlIll/Xbal消化的pADAP中，產生載體pADAP/ARA-KDEL。DNA構建體pPGB121s-B-B33-ARA-KDEL用KpnI和SmaI從pADAP/ARA-KDEL中切除ARA-KDEL融合體，通過瓊脂糖凝膠電泳純化片段。將得到的片段克隆到KpnII/SmaI消化的pPGB121s-B-B33中，得到載體pPGB121s-B-B33/ARA-KDEL.DNA構建體pPGB121s-B-B33-ARA-KDEL用KpnI和SmaI從pADAP/ARA-KDEL中切除ARA-KDEL融合體，通過瓊脂糖凝膠電泳純化片段。將得到的片段克隆到KpnIl/Smal消化的pPGB121s-B-B33中，得到載體pPGB121s-B-B33/ARA-KDEL.DNA構建體pADAP/ST-ARA糖基轉移酶α-2，6-唾液酸轉換酶(ST)是II型膜蛋白，定位在高爾基體上。已經證明，該蛋白的頭44個氨基酸指導融合標記蛋白，溶菌酶(Munro1991)在高爾基體的滯留。另外，通過融合ST的52個N-末端氨基酸可以實現GFP的高爾基體定位作用(Boevink等.1998)。最后，通過如下方法產生帶有52個ST的N-末端氨基酸和內源性阿拉伯聚糖酶的成熟形式融合的構建體。用PCR擴增相關的ST區域，引物為(STSOEFWD，下劃線表示ST特異序列)5’GACGAAGCTTATGATTCATACCAACTTG3’(SEQIDNO13)和(STSOEREV，下劃線表示ST特異序列)5’GGAGCCGGGGTTGGCGTA-GGCCACTTTCTCCTGGCTC3’(SEQIDNO14)。SorenMgelsvang贈送的質粒pST-MYC作為模板。然后擴增阿拉伯聚糖酶的成熟部分，引物為(ARASOEFWD，粗體表示阿拉伯聚糖酶特異序列)5’GAGCCAGGAGAAAGTGGCCTACGCCAACCCCGGCTCC3’(SEQIDNO15)和(ARASOEREV，粗體表示阿拉伯聚糖酶特異序列)5’CAGTCTAGACTACACAACAGGCCAGCC3’(SEQIDNO16)。通過瓊脂糖凝膠電泳純化這兩種產物，接著通過序列重疊延伸PCR融合(Higuchi1988)，使ST的52個N-末端氨基酸和阿拉伯聚糖酶的成熟部分(302個氨基酸)融合。用瓊脂糖凝膠電泳純化融合產物，HindIII和XbaI消化后克隆到HindIII/XbaI消化的pADAP中。產生的質粒命名為pADAP/ST-ARA。實施例4設計含有兩種基因的構建體DNA構建體pGED/double/1和pGED/double/2用HindIII和EcoRl切割載體pPGB121s-B。將產生的含有GBSS-Tnos表達盒的片段用Taq酶將其末端填平，按制造商(Invitrogen)所述的步驟將得到的產物克隆到載體pCR2.1-TOPO中。這一步產生載體CR2.1-TOPO/GBSS-nosterm1和pCR2.1TOPO/GBSS-nosterm2。用EcoRI消化每個載體，產生的片段用瓊脂糖凝膠電泳純化。將該片段克隆到已經用EcoRI消化的/并按制造商(BoehringerMannheim)的描述用堿性磷酸酶脫磷酸載體pGED中。這一步產生載體pGED/double/1和pGED/double/2，這兩個載體含有兩個GBSS啟動子，其后接有含有SalI，HindIII，XbaI，XhoI，BamHI(MCS1)和SalI，AgeI，KpnI，AvriI，SmaI，XmaI和BamHI(MCS2)的多克隆位點。含有編碼修飾酶和輔助酶的DNA構建體pPGB121s-new-RHGBRHA1將載體pBI221(Clontech)用限制酶EcoRI消化，脫磷酸，苯酚/氯仿抽提，再用乙醇沉淀。磷酸化的寡核苷酸P-AATTAAGCTT(SEQIDNO17)自身退火，并連接到EcoRI消化的pB1221載體中，產生載體pB1221-2HindIII。將載體pBI221-2HindIII用限制酶SacI消化，用T4DNA聚合酶使末端鈍化，加熱使這兩種酶失活后用限制酶BamHI進一步消化。凝膠電泳純化被處理的載體(pB1221-2HindIII*B*Sb)。含有編碼棘孢曲霉鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶的cDNA克隆的載體pGEM-7Z/RHA1被限制酶XbaI消化，用Klenow酶使末端鈍化，加熱使這兩種酶失活后用限制酶BamHI進一步消化。凝膠電泳純化該處理過的插入cDNA，并連接到凝膠純化的載體部分pB1221-2HindIII*B*Sb中，產生載體pB1221-2HindIII-RHA1。用HindIII限制酶消化載體pB1221-2HindIII-RHA1，通過凝膠電泳純化含有鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶35S啟動子、胭脂堿合成終止子的表達盒。將DNA構建體pPGB121s-new-RHGB用限制酶HindIII消化，脫磷酸，凝膠電泳純化，連接到純化的HindIII片段中，該片段含有表達盒35S啟動子、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶、胭脂堿合成中止子，產生DNA構建體pPGB121s-new-RHGB-RHA1。DNA構建體pGED/apoGal/empty/1和pGED/apoGal/empty/2用HindIII/XbaI消化pGED/GAL構建體，通過瓊脂糖凝膠電泳分離產生的GAL編碼片段。用HindIII和XbaI消化載體pGED/double/1和pGED/double/2，凝膠電泳純化后克隆GAL編碼片段，這一步分別產生兩種設計的載體pGED/apoGAL/empty/1和pGED/apoGAL/empty/2。于是，這兩種載體在第一個GBSS/Nos終止子表達盒中的GBSS啟動子和Nos終止子間就含有了非原生質體定向半乳聚糖酶。設計‘自處理’型雙DNA構建體從上述任何一個構建的載體中分離編碼棘孢曲霉內源性半乳聚糖酶的1.3kb的cDNA片段，將其克隆到pGED/double/1或2的GBSS/Nos終止子表達盒中的GBSS啟動子和Nos終止子之間，產生非原生質體表達盒GBSS啟動子-內源性半乳聚糖酶-Nos終止子。該載體被命名為pGED/apoGAL/1和2，是用于設計所有的雙鏈DNA構建體的起始載體。第二個GBSS啟動子-Nos終止子表達盒用來構建將細胞壁修飾酶傳遞到細胞質、內質網(ER)或植物液泡中的表達盒。該酶優選的是采集后發生作用，并從細胞壁漿汁中釋放有益產物的酶。在下文的實施例12中舉例說明將非限制性地以內源性半乳聚糖酶作為改造酶，以內源性PG作為剪切酶。如下簡述制備載體構建體，該構建體能引導內源性PG，并將其定位到不同亞細胞位點。細胞質定位.為了細胞質定位，優選來源于植物、細菌或真菌的在中性pH環境下具有高穩定性的內源性PGs。通過除去內源性PGcDNA編碼內源性PG信號肽的序列，使內源性PG不能轉移通過內質網，從而達到定位在細胞質的目的。如果從蛋白質序列中不知道成熟蛋白質的N-末端序列，根據經驗利用計算機程序優化地來確定信號肽的剪切位點達到目的。然后將編碼成熟內源性PG蛋白的cDNA克隆到構建體pGED/apoGal/empty/1和pGED/apoGal/empty/2第二個GBSS/Nos終止子表達盒的GBSS啟動子盒Nos終止子之間。ER滯留.為了達到ER滯留，優選來源于植物、細菌或真菌的在微酸性和中性pH環境下具有高穩定性的內源性PGs。將編碼四肽KDEL的序列連接到編碼內源性PG的cDNA的編碼區末端，產生在其C-末端含有KDEL的表達蛋白，從而達到定位于ER的目的。然后將編碼融合蛋白的cDNA克隆到載體pGED/apoGal/empty/1和pGED/apoGal/empty/2第二個GBSS/Nos終止子表達盒的GBSS啟動子盒Nos終止子之間。液泡定位.為了實現液泡定位，優選來源于植物、細菌或真菌的在酸性環境下具有高穩定性的內源性PG。定位液泡可以通過如下方式完成附加一個編碼信號序列的核酸序列以確保將雜合體轉移到ER，在其下游再連接一個液泡信號序列，如包含氨基酸NPIRL的序列(例如N-末端多肽(NTPP))。選擇地，NPIRL序列或其類似序列可以融合到所述蛋白質的C-末端，而確保轉移到ER的信號序列融合到預定位液泡蛋白質的N-末端部分(Koide等.1997)。在N末端含有NTPP的蛋白中的一個例子是甘薯sporamin，已經證實當將蛋白質與該sporaminN末端部分融合時，sporamin的N末端能引導正常情況下液泡中不存在的該蛋白到達液泡。因此，可以將編碼sporaminN末端部分的核酸序列直接融合到編碼水解果膠主鏈的酶(如信號肽被刪除)的核酸序列上，從而指導果膠酶的液泡定位。然后將編碼融合蛋白質的cDNA克隆到第二個GBSS/Nos終止子表達盒的GBSS啟動子盒Nos終止子之間，該載體被命名為pGED/apoGALvacPG/1。下面的實施例10和11分別描述了利用單一基因構建體將內源性阿拉伯聚糖酶定位到ER和液泡中。實施例5改造馬鈴薯中鼠李糖聚半乳糖醛酸的半乳聚糖側鏈在塊莖特異的GBSS啟動子的控制下表達一種真菌(棘孢曲霉)內源性半乳聚糖酶(Christgau等，1995)的馬鈴薯植株已經產生，見實施例2。與野生型植株相比較，除了低轉化效率，外獲得的植株表型沒有什么改變。這種低效率可能表明啟動子在體外培養過程中具有活性及在發育的早期階段具有高活性的內源性半乳聚糖酶在轉化細胞中變得無活性。在野生型馬鈴薯植株的塊莖抽提物中內源性半乳糖酶的活性幾乎檢測不到，而在T11.1和T13.1中其活性水平分別是104和214umol等量半乳糖/分鐘/g塊莖鮮重(表2)。挑選T11.1和T13.1進行分析，是因為最初就用FIIR光譜挑選了它們的細胞壁表型。在低濃度的鹽緩沖液中定量抽提轉基因植物中的具有活性的內源半乳聚糖酶，表明該酶與細胞壁是不緊密結合。用Western印跡法分析轉基因和野生型植株的抽提物。所有具有內源性半乳聚糖酶活性的抽提物都含有一種與分離的重組內源性半乳聚糖酶相似的分子量為38kDa的蛋白質。在細胞壁的分離和抽提過程中，必須采取幾點措施以避免果膠材料被導入的內源性半乳聚糖酶和內源性果膠酶降解。用含有脫氧膽酸鈉的緩沖液使蛋白質變性和溶解，其中的蛋白質被幾種冰凍抽提緩沖液稀釋，緩沖液中的pH值不利于植物果膠酶以及特別是導入的內源性半乳聚糖酶產生最佳活性。在制備細胞壁的過程中也不能檢測到細胞壁抽提物中的內源性半乳聚糖酶活性。用傅立葉轉化紅外顯微光譜儀進行轉化體的初步篩選。探測性主成分分析(PCA)法能夠清楚地將兩種轉化體T11.1和T13.1與野生型區分開來。圖1顯示了用第三和第五主成分(PC)數值比較T13.1和野生型的結果。于是，篩選這些轉化子作進一步的分析。轉化子中的細胞壁材料的產量比野生型的低，只是一些殘余的淀粉(表2)。與野生型比較(表3)，兩個轉化子的細胞壁制劑中的單糖組分的半乳糖含量明顯降低到～30％。在對一些單糖進行檢測時發現標準差很大。但是，這種可變性與轉化的表型沒有關系，而制備的細胞壁中的殘余淀粉幾乎不變。半乳糖殘基存在于不同的細胞壁多糖(半纖維素、阿拉伯半乳聚糖蛋白和RGI)中，但是僅僅只有RGI已知含有β-1，4-連接的半乳聚糖，所以我們后面進行的細胞壁材料分析主要集中在這種聚合物上。通過用真菌EPG和PME聯合處理，從細胞壁中特異地抽提出RGI。用這種EPG/PME處理方法從轉化的塊莖的細胞壁中釋放的UA幾乎是野生型的兩倍(表3)，該EPG/PME可溶性果膠通過大小排阻層析進行分析，以根據分大小分離的消化片段。用EPG/PME從野生型細胞壁中抽提出來的RGI含有兩種主要組分，如UA含量和折射率檢測所示(圖2)組分A(分子量＞500kDa)和組分C(分子量0.2-8kDa)。來自T11.1和T13.1的EPG/PME抽提物具有與野生型不同的組成(圖2)，其含有較少的組分A、較多的組分C和野生型抽提物中不存在的～120kDa量外片段(組分B)。其中的星號表示不含果膠材料的樣品緩沖鹽的存在而導致的大波峰。如同糖分析的檢測結果(表3)，野生型塊莖的組分A含有高比例的UA、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖，而不含其他任何單糖，表現高分子量的HGA和RGI聚合物。然而，盡管野生型塊莖的組分A含有64mol％半乳糖殘基，轉基因塊莖僅含有15-20mol％，這表明了半乳聚糖的含量大大降低。轉基因塊莖中的阿拉伯糖基含量稍微增加，UA含量大大提高。有趣的是，在轉基因成分A中檢測不到巖藻糖殘基，但該殘基在野生型組分A中存在，雖然百分含量很低(巖藻糖殘基可以被馬鈴薯RGI的半乳聚糖側鏈取代)。轉基因塊莖中的單糖組分A和B是相似的(表3)。來自野生型和轉化子塊莖細胞壁的組分C主要含有HGA片段，但也檢測到一些小分子量的RGI片段。來源于轉基因塊莖的該RGI片段和組分A和B中的那些片段一樣，與野生型塊莖(3.8mol％)相比半乳糖基的含量(1.4-1.5mol％)也很低。但是，相當大量的葡萄糖基可能代表了細胞壁材料在細胞壁制備過程中被經α淀粉酶處理而釋放出來的寡聚糖污染。用EPG/PME處理酶學細胞壁并不能完全使細胞壁脫果膠。因此，接著還要在4℃和室溫下用碳酸鈉進行另外抽提(表3)。用碳酸鹽去酯化只能溶解很少量的果膠，與EPG/PME抽提不同，野生型和轉基因細胞壁制劑的產量是相似的。碳酸鹽的大小排阻層析產生兩種含UA的組分(數據沒有顯示)一種在排出體積中(分子量＞500kDa)，另一種的保留時間與GalA相當，這表明存在單糖或小的寡聚糖。由于樣品中存在高濃度的鹽，所以不能分析后一組分中的單糖組成。對含有大的聚合物的抽提液進行單糖分析顯示阿拉伯糖、半乳糖、UA和鼠李糖，可表示為RGI的比例很高(表3)。大量的葡萄糖殘基和木糖殘基可能來源于被碳酸鹽抽提液溶解的木葡聚糖。轉基因細胞壁的碳酸鹽抽提物也顯示相對于野生型半乳糖基含量降低(18-19％對52％)。另外，碳酸鹽抽提液中存在的RGI中的阿拉伯糖基含量是不變的，而只是T13.1細胞壁制劑中的UA含量升高，但T11.1沒有升高。在用酶和碳酸鹽緩沖液抽提處理后，細胞壁中可以殘留果膠。比較相繼用EPG/PME和碳酸鹽處理的前后細胞壁的單糖組成以量化果膠溶解的效率(表3)。果膠抽提后在細胞壁中不能檢測到鼠李糖，盡管只用中等靈敏度檢測鼠李糖，這表明存在于未抽提的細胞壁中的RGI通過相繼的抽提被完全除去。但是，野生型和轉化的塊莖的被抽提的細胞壁仍然含有相同量的半乳糖，這些半乳糖很可能不是來源于RGI，而是來源于其他的細胞壁組分，如木葡聚糖，已經知道該糖含有β-1，2-連接的半乳糖殘基且該糖不會被內源性半乳聚糖酶水解。木葡聚糖只有通過濃堿或木葡聚糖酶處理抽提，因此可以預見其存在于用本研究方法處理的細胞壁中。有趣的是，在野生型的殘余細胞壁中，UA的含量比轉化子的殘余細胞壁中的UA含量要高3倍，這表明提高了轉化子中的果膠的可抽提性。為了測定1，4-β-D-半乳聚糖是否已經被內源性半乳聚糖酶特異地水解，用識別1，4-β-D-半乳聚糖四聚體的單克隆抗體LM5免疫金標記野生型和T13.1的成熟塊莖組織(圖3)。圖3顯示了用單克隆抗體LM5金標記，銀增強，并用反射聚焦掃描顯微鏡(A，B)和透射電子顯微鏡(C，D)觀察的野生型馬鈴薯塊莖(A，C)和表達內源性半乳聚糖酶的馬鈴薯塊莖(B，D)的截面。野生型的實質細胞的細胞壁被強烈標記(A中的白色，C中的黑色顆粒)。但是在T13.1的塊莖中，標記的密度大大降低，且標記的位置僅僅在靠近質膜(D中的箭頭)的一些細胞的角落(B中的箭頭)。星號代表淀粉粒曾經占過的空間，ML表示這些填滿的角落中膨脹的中央薄片，比例A和B是100mm，C和D是2mm。為了測定由于除去鼠李糖聚半乳糖醛酸(RG)分子的半乳糖而引起的結構上的改變，用Hakomori(1964)的方法測定來自T13.1和野生型對照的分離RG的連鍵形式，下面表1結果表明在末端半乳糖殘基得到期望的增加的同時，幾種形式的內在半乳糖殘基大大減少，其中內在β-1，4-半乳糖殘基降低到野生型水平的九分之一，且有許多低含量的連鍵在轉化體中降低到檢測水平以下。從這些結果中，我們可以得出結論從轉基因細胞壁中分離出的所有RGI聚合物中的半乳糖含量大大降低，這表明分泌酶在細胞壁中具有活性，水解了RGI側鏈中的大部分半乳聚糖。免疫定位顯示幾乎完全除去了半乳糖聚酶的底物，使毛發狀區的半乳聚糖足夠短以至抗體LM5和半乳聚糖酶都不能和他們結合。連鍵分析進一步證實了這些結果，并且證明不僅僅組成發生了改變，而且形成了新的鼠李糖聚半乳糖醛酸結構。電子顯微圖片顯示在細胞壁朝質膜方向(細胞壁的最新合成部分)的那一面有少量的長的半乳聚糖，這表明新合成的半乳聚糖的沉積與半乳聚糖的去除發生競爭，雖然其去除過程占優勢。這是第一次證實對植物細胞壁多糖的單糖分布和連鍵形式的修飾，結果見表1表1.在野生型和轉基因型馬鈴薯的細胞壁中糖苷鍵的含量(mol％)at表示末端殘基bAraf表示阿抗伯糖基的呋喃糖形式c表示大多數的4-Glc被淀粉污染結論所有從轉基因細胞壁分離的RGI聚合物中的半乳糖含量大大降低，表明分泌酶在細胞壁中具有活性，水解了RGI側鏈中的大部分半乳聚糖。免疫定位顯示幾乎完全除去了半乳聚糖酶的底物，使多毛去的半乳糖足夠短以至抗體LM5和半乳聚糖酶都不能和他們結合。電子顯微圖片顯示在細胞壁朝質膜方向(細胞壁的最新合成部分)的那一面有少量的長的半乳聚糖，這表明新合成的半乳聚糖的沉積與半乳聚糖的去除發生競爭，雖然其去除過程占優勢。這是第一次證實對植物細胞壁多糖的單糖分布和連鍵形式的修飾。表2.內源型半乳聚糖酶活性和細胞壁產量aa數據(±SD)是三次獨立實驗的平均值b是通過m-羥基聯苯法測定c對抽提在材料和方法中作了具體描述表3.從轉基因和WT馬鈴薯塊莖中獲得的材料的糖組成a數據(±SD)是三次獨立試驗的平均值b沒有檢測c組分B在WT植物的EPG/PME抽提物中不存在(見圖2)實施例6由patatin啟動子驅動的半乳聚糖酶基本上同實施例5所述一樣，用pPGB121s-B-B33-GAL生產轉基因馬鈴薯植株，以使半乳聚糖酶由patatin啟動子而不是由GBSS啟動子驅動。對基因表達進行分析表明表達被有效地限制在塊莖中，在其他地器官中，與GBSS啟動子相比需要更高濃度的蔗糖誘導。在塊莖中的表達與用GBSS啟動子所發生的表達沒有很大的區別。可以用LM5抗體對塊莖進行免疫學分析，以證實塊莖中的細胞壁表型并不依賴于驅動半乳糖酶基因表達的啟動子。實施例7轉化的馬鈴薯表達定位到非原生質體的鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶用根癌土壤桿菌(見pPGB121s-new-RHGB和材料和方法部分的使用步驟)轉化250個外植體。產生21個獨立轉基因系，其中的18用于本分析。一般來說，這些轉基因植物是正常的，只有一些(18％)表型發生了改變。與對照相比較，這些植株比較小且葉較小。這些葉較濃密、粗糙而且卷曲。而且，這些植株相對于其他的轉基因植株和對照顏色較深。所有的具有改變表型的植株在產生塊莖之前都死掉了。在另外的試驗中(用其他的基因轉化)也發現了相似的表型，這表明是轉化程序自身(如多倍化)的影響，不是特定的基因或構建體產生的影響。外表正常的植株生產出改變了表型的塊莖。對DNA、RNA和蛋白質水平進行初級分析后，繁殖目的系以產生更多的分析材料。將所有成功轉化的轉基因系(基于卡那霉素抗性)進行Southern印跡分析，在18個植株的15個中，檢測到鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶(rhg-lyase)，在其他的所有植株中，該基因存在一個或兩個拷貝。僅僅對那些真正產生了塊莖的植株進行轉化基因的表達分析。因此，僅僅從11個不同系中分離的RNA被用來進行Northern印跡分析。用馬鈴薯核糖體DNA片段作為探針進行的RNA凝膠印跡雜交表明在每個株系中RNA的量相等。用鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶作為探針雜交塊莖RNA表明大多數植株(11個中的9個)的基因發生轉錄。這9個中作進一步的區分，其中的4個可以構建成高表達物，而其他的5個表現出較低的表達水平。有兩個在Southern印跡分析中不表現出任何雜交反應，出現一個陰性結果。我們沒發現轉化基因拷貝(一個或兩個)的數量與RNA表達水平間的關系。將能夠檢測到其轉化基因發生表達的所有株系用于進一步的分析。表達RG裂解酶的轉基因馬鈴薯植株的酶學性質表明9個RG裂解酶轉化子中的3個表現出高的裂解活性(將底物完全降解為寡聚物)，而其他的有中度的(9個中的1個)、低的(2)或非常低的(3)活性。另外，發現mRNA含量和酶活性正相關。發現RGL轉化子塊莖中的糖組成在作為鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶時和對照植株是十分相似的。下面的表4提供了來源于高和低表達轉化子和野生型馬鈴薯的塊莖的整個細胞壁的分析數據。其中鼠李糖含量下降了1.5-1％，顯示毛發狀區含量的下降。表4.來自cvKarnico野生型和兩種RG-裂解酶表達轉化的總細胞壁中分離的細胞壁單糖組成，w/w％(上面)和mol％(下面)開始以上結果可能是令人驚訝的，特別是考慮到塊莖改變的表型時。該結果可作如下解釋在天然果膠中毛發狀區被認為是互相連接的同型聚半乳糖醛酸序列(Shols&Voragen1996)，鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶攻擊這些互相連接的序列，但不能完全降解鼠李糖聚半乳糖醛酸，因此，相對比較少的毛發狀區部分被作為寡聚糖避開源性鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶作用。鼠李糖(可代表鼠李糖聚半乳糖醛酸)是細胞壁中的一種含量相對較少的糖，半乳糖醛酸在細胞壁中較豐富，但大部分是同型聚半乳糖醛酸的殘基。該新的細胞壁表型確實是一種結構性表型而不是組成型表型，可以用實施例5的細胞壁特定抗原決定基的免疫定位來描述。含有半乳聚糖和阿拉伯聚糖的鼠李糖聚半乳糖醛酸側鏈，依賴與其連接的鼠李糖殘基。值得注意的是表示毛發狀區主要結構變化的這兩種糖大大減少，從而導致很少中性糖側鏈取代基。通過聚焦顯微方法，用阿拉伯聚糖和半乳聚糖抗體免疫定位證實組成分析。進一步地，這些測試表明，含有paranchymal淀粉的細胞很少被這兩種抗原決定基標記，而轉化體中的皮質細胞在細胞的對半乳聚糖和阿拉伯聚糖標記在角落處增強。實施例8將酶活性定位到高爾基體根據實施例6所描述的策略表達阿拉伯聚糖酶并將其定位到非原生質體中，以產生可利用半乳聚糖酶的煙草和馬鈴薯植株。煙草植株不顯現任何可見表型，而大部分馬鈴薯轉化子有部分的分生組織功能障礙。利用GBSS啟動子控制阿拉伯聚糖酶，幾乎所有的葉腋芽產生非功能性分生組織。因此，這證實了利用本發明能產生一種非支鏈的植物結構，并能控制植物的生長。酶活性的高爾基體定位應該被視為分泌到非原生質體(不是作為‘自處理植物材料’貯藏酶的一種細胞內位點)的一種選擇。利用技術的力量能夠直接干擾多糖在高爾基體中的生物合成過程。這些技術為構建的選擇提供了一個很大的范圍，不考慮植物的可變性。已經表明來源于兔的糖基轉移酶α-2，6-唾液酸轉移酶(ST)能被定位到植物細胞的高爾基體結構中，可以單獨(Wee等，1998)，也可以以截短的形式與溶菌酶(Munro，1991)或綠色熒光蛋白(GFP)(Boevink等，1998)融合。因此，測定這種蛋白對多種異源蛋白在高爾基體中滯留的促進能力。ST是II型膜蛋白(即含有定位胞質的氨基末端)，包括在被轉移到ER的過程中被翻譯后剪切的信號序列，一個短的氨基末端細胞質區域，一個指導高爾基體定位的未剪切的疏水性信號錨定子和一個大的催化lumenal區域(Weinstein等，1987)。相應地，這種內部信號錨定子足夠滯留任何與ST的N末端融合于這部分的異源蛋白質。這已經Boevink等(1998)和Munro(1991)被的工作證實，他們分別將ST的N末端部分的52個和44個氨基酸融合到小雞溶菌酶(Munro1991)和GFP(Boevink等，1998)中。于是，兔唾液酸轉移酶滿足了將蛋白質結合到高爾基體膜上(與以可溶形式存在高爾基體中的蛋白質相反)一般需要。可溶性的蛋白質通過高爾基體，周期性地定位子質膜上，從而直接與細胞壁接觸。最后，利用重組PCR(Higuchi1988)將兔唾液酸轉移酶融合到棘孢曲霉阿拉伯聚糖酶地成熟部分，將產生的融合體導入到表達載體pADAP和pPGB121s-B-B33中，由此分別產生兩個含有ST-ARA融合體并在GBSS和patatin啟動子控制之下的構建體。利用電穿孔技術將該構鍵體轉化到土壤桿菌中，該細菌宿主用來轉化Nicotianatabacum(L.)cv.Xanthi和Solanumtuberosum(L.)cv.Posmo.利用差速離心來檢測微粒體中酶定位的主要部分，利用常規細胞器分離法來檢測高爾基體的定位(Ray等，1969，Gibeau和Carpita1990)。分析含有ST-ARA融合體并在GBSS啟動子控制之下的植株。利用阿拉伯聚糖酶平板法測定塊莖抽提物中的活性酶的表達。用Western印跡來檢測酶活性與微粒體部分的相關性，接著進行細胞器分離，可以測定與高爾基體囊泡相連的主要的阿拉伯聚糖酶，然而在可溶的非原生質體和細胞質部分及質膜中沒有檢測到酶蛋白。在內質網中的酶蛋白可以檢測到，但水平較低，這代表了轉移到高爾基體的新產生的阿拉伯聚糖酶。不能排除內質網被少量高爾基體囊泡交叉污染。這個試驗的重要性在于證實了阿拉伯聚糖酶從可溶形式被轉化成成膜結合酶，其主要目標是高爾基體。如同實施例5一樣，分析來自這些塊莖的細胞壁的EPG/PME抽提毛發狀區單糖組成。結果見表5表5從表達定位到高爾基體的內源性阿拉伯聚糖酶的野生型和轉化子中抽提得到的毛發狀區中的糖Mol％總的來說，定位到高爾基體的阿拉伯聚糖酶的表達導致毛發狀區結合的阿拉伯糖下降了50％，用聚焦顯微技術觀察阿拉伯聚糖特異性抗體標記的圖銨證實了該組分數據。這是第一個利用任何方法定位干擾復合多糖在高爾基體中的生物合成的例子。實施例9含有輔助酶的雙構建體根據體外的研究已知，假如將鼠李糖聚半乳糖醛酸酶與鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶組合使用，前者的作用要大得多。因此，構建雙構建體以在馬鈴薯塊莖中表達這兩種酶，見實施例4中的pPGB121s-new-RHGB-RHA1。轉化馬鈴薯植株，得到21個單獨的轉基因系，沒有發現任何重要的表型改變。但是我們確實希望這兩種酶的組合比只存在rhg-裂解酶的轉化子能帶來更大的影響。當裂解酶單獨活躍時，預計表型是相似的。實施例10使多糖修飾酶在ER中滯留由于在ER中滯留與此處定義的‘自處理植物材料’的相關性，下文以在ER中的滯留為例說明。在本發明的優選實施方案中，剪切多糖主鏈的酶，典型的如水解酶或裂解酶被滯留在ER中。在植物材料勻漿中，使酶與細胞壁接觸，回收上清部分中的可溶性成分。在這兒用阿拉伯聚糖酶作為例子來說明ER滯留，其他的相關酶在下列表12中列出。WO94/20611的SEQIDNO1表示的阿拉伯聚糖酶被發現對馬鈴薯具有毒性，至少當其被分泌到非原生質體中時具有毒性(Libiakova等.，1999)。在本實驗中用煙草來證實內質網中活性形式的多糖修飾酶的積累。如同材料和方法中所述，基因是煙草cv.Xanthi中內源性阿拉伯聚糖酶的KDEL標記的變體，被基于pADAP的含有阿拉伯聚糖酶-KDELcDNA的構建體轉化。用平板法測定轉化植株的葉抽提物中的酶積累(見材料和方法)，所有成功的轉化植株均產生活性的阿拉伯聚糖酶。該方法是半定量檢測，但在15分鐘內(不同的轉化株有一些變化)能檢測(在含有樣品的孔周圍的藍暈超過1mm)到的天然葉抽提物中的酶活性很明顯。通過差速離心可以證實有可檢測量的酶存在于微粒體部分，表明在ER發生滯留。用Husted等(1995)的方法分離煙草葉中的非原生質液體。在非原生質液體中可能不存在具有檢測量的阿拉伯聚糖酶活性，這就證明了酶沒有被錯誤地分泌到非原生質體空間。實施例11將酶定位到液泡與在ER中的滯留一樣，液泡定位的例子將在上下文中的“自處理植物材料”中看到。在實施例3中已經給出了一種能定位到細胞內間隙的單基因構建體。在液泡的酸性環境下能穩定存在的酶可以貯藏在該細胞器中。兩種常用的方法是將產物會在該處發生積累的基因的5’序列與目的基因相連或選擇地用在進入液泡時將被切掉的N末端延長區(部分或全部)加工目的基因。馬鈴薯液泡patatin蛋白(146個氨基酸)(Sonnewald等.，1991)和甘薯sporamin蛋白(111個氨基酸)(Turk等.，1997)的N末端部分是實現這個目的的適合候選物。在甘薯sporamin中，液泡定位信息位于初級結構的N末端部分。剪切掉確保蛋白轉移到ER中的N末端信號序列后，前體形式就被有效地定位到液泡中，在液泡中前體肽被剪切(Koide等，1997)。和馬鈴薯patatin不同，sporamin中決定液泡定位信號的性質很清楚，而已知馬鈴薯patatin中定位決定子的準確位置是位于N-末端，但不清楚切位點。因此，sporamin被用來將異源蛋白定位到植物液泡。轉移到液泡中之后，融合蛋白的主要sporamin部分被切除，于是產生高度真實的異源蛋白。用相似的方法處理patatin，產生一種永久性的N末端延伸，其能引起異源蛋白的錯誤折疊和失活。最后，克隆指導液泡的馬鈴薯patatinCDR和甘薯的sporamin編碼區的111個氨基酸，并進行測序。產生含有sporamin/patatin的N末端和合適的內源性多聚半乳糖醛酸酶形成的融合體的構建體，見下面的實施例。用Western印跡分析檢驗處理過的液泡入口(可使用)。同ER滯留內源性阿拉伯聚糖酶的類似，檢測轉化子，表明在液泡中積累了活性內源性PG。實施例12含有表達半乳聚糖酶+內源性多聚半乳糖醛酸酶的雙構建體的自處理塊莖制備一種雙構建體，該雙結構體含有預定要分泌到非原生質體中去的半乳聚糖酶和被定位到內部貯藏器官的真菌或植物內源性PG，見實施例4中的“設計“自處理”DNA構建體”。半乳聚糖酶應該作為一種使任何酶催化目標果膠體內剪切的支架。在這個實施例中，植物和真菌內源性多聚半乳糖醛酸酶被作為例子來說明“自處理植物材料”。但是，必須承認植物或微生物來源的裂解酶在本文中有同樣的作用。因為他們的穩定性(如在酸性液包境條件下)，并考慮到他們對同型聚半乳糖醛酸修飾(特別使乙酰化)的敏感性和催化的最佳pH，選擇真菌內源性多聚半乳糖醛酸酶。來源于棘孢曲霉的、登記號為AF074213的、WO94/14952和WO94/14952的多聚半乳糖醛酸酶I、II和III包括許多目的生化屬性，但也可以用其他的多聚半乳糖醛酸酶。比較高等植物內源PG蛋白序列顯示有兩種截然不同的內源PG。一種在信號肽和成熟蛋白之間含有一個前體肽，而另一種不具有這種前體肽。該前體肽的功能仍然沒有被證實。含有不具有前體肽的非分泌的內源PG(修飾的內源性PGA，B，和C)的雙構建體的定位可以同已舉例說明的內源性阿拉伯聚糖酶在ER(實施例10)和液泡(B和C)(實施例11)中的定位一樣來完成。但是，在這種情況下，要考慮到基因產物在細胞質中的積累(A)。Wegener等(1996)描述了一種Erwiniacarotovora果膠酯裂解酶在轉基因馬鈴薯的葉和塊莖的細胞質中怎樣進行積累的，且沒有可檢測的表型變化。已經在轉基因植物的細胞質中成功積累了表達的耐熱性細菌纖維素酶。Ziegelhoffer和其合作者從轉基因紫花苜蓿、馬鈴薯和煙草的Thermomonosporafusca中生產出E2和E3纖維素酶，雖然量非常少(Ziegelhoffer等，1999)。沒有檢測到纖維素酶的表達而產生的表型影響。然而，如同上文所述，KDEL在內質網中保留了一種轉運的蛋白，該信號肽負責實際轉運。因此，為了使所述酶在細胞質積累，信號肽必須在植物宿主細胞表達之前被除去。假如沒有通過蛋白質測序來鑒定信號肽的剪切位點，可以測定其可能的剪切位點。例如利用神經網SignalP(Nielsen等，1997).通過利用所述酶成熟部分的特異性引物進行PCR，在DNA水平物理除去信號肽。這個方法確保了起始密碼子和酶(該酶預定在細胞質積累)成熟部分的最佳翻譯序列的導入。沒有前體肽的代表性植物內源性PG包括，但不限于來源于Glycinemax的AF128266PG1和來源于蕃茄的U70480TAPG2。對于每個間隙來說，通過兩種修飾的內源性PG將含有前體肽的非分泌的內源PG(修飾的內源性PGD-1)定位到細胞質、ER或液泡中。在前文中描述的三個修飾的(D，F和H)系列在成熟蛋白的前留有前體肽序列，另外三個修飾的系列(E，G和1)的前體肽被除去，共產生6個不同的構建體(D-1)，這些構建體包括了三種不同定位，含有或不含有前體肽。含有前體肽的植物內源性PG的例子是來自油料種子rape的X9500RDPG1和來自kiw果實的P35336。根據實施例6的分析，可以證實由于半乳聚糖酶表達而產生的細胞壁表型是實施例5和6所期望的結果。另外，通過Northern和Western印跡分析和多聚半乳糖醛酸活性分析證實功能性內源多聚半乳糖醛酸酶的表達和積累。參考文獻Baron-Epel，O.，Gharyal，P.K.&Schindler，M.(1988)PectinsasmediatorsofwallporosityinsoybeancellsPlanta175389-395.Blumenkrantz，N.&Asboe-Hansen，G.(1973)Anal.Biochem.54484-489.Boevink，P.，Oparka，K.，SantaCruz，S.，Martin，B.，Betteridge，A.，andHawes，C.(1998).Stacksontrackstheplantgolgiapparatustrafficsonanactin/ERnetwork.PlantJ.15441-447Boevink，P.，Oparka，K.，SantaCruz，S.，Bet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的條件下，在此條件下該在體內以無活性形式被表達的酶被激活。28.權利要求27的方法，其中在核酸構建體轉化到植物細胞中后，使細胞壁多糖修飾酶在原生質體或非高爾基體結構中表達的核酸序列是使細胞壁多糖修飾酶在植物生長過程中定位到細胞間隙的序列，這些細胞間隙選自液泡、內質網、細胞質和質體。29.權利要求28的方法，其中在原生質體或非高爾基體間隙中表達的多糖修飾酶是由轉化到植物細胞中的核酸構建體中的序列編碼的。30.權利要求28的方法，其中在原生質體或非高爾基體結構中表達的多糖修飾酶是由導入了核酸構建體的細胞基因組中存在的內源序列編碼的。31.權利要求27-30任一項中的方法，其中細胞壁多糖修飾酶選自內源性多聚半乳糖醛酸酶、內源果膠裂解酶、果膠酯裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、內源葡聚糖酶、內源木聚糖酶和其同工酶或ortholog。32.權利要求27-31任一項中的方法，其中細胞壁多糖修飾酶的表達是由植物啟動子指導。33.權利要求27-32任一項中的方法，其中，至少一種復合細胞壁多糖能在采集后被植物材料自身存在的一種酶處理，該植物材料選自果膠和半纖維多肽。34.權利要求33的方法，其中果膠的采集后處理是鼠李糖聚半乳糖醛酸區和同型聚半乳糖醛酸區之間的區域。35.權利要求27-34任一項中的方法，其中植物細胞進一步被核酸序列轉化，該核酸序列產生能在體內修飾至少一種復合細胞壁多糖結構的酶，該植物細胞壁多糖包括采集后能被植物材料自身存在的酶處理的細胞壁多糖。36.權利要求35的方法，其中能產生能在體內修飾至少一種復合細胞壁多糖結構的酶的核酸序列是編碼細胞壁多糖修飾酶的序列。37.權利要求36的方法，其中能產生能在體內修飾至少一種復合細胞壁多糖結構的酶表達的核酸序列是編碼一種產物的序列，該產物影響編碼細胞壁多糖修飾酶內源性序列的表達。38.權利要求36或37的方法，其中細胞壁多糖修飾酶被定位到非原生質體。39.權利要求35-38任一項中的方法，其中能在體內能修飾至少一種復合細胞壁多糖結構酶選自內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸酶水解酶、內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸酶裂解酶、內源性半乳聚糖酶、內源阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶，如β-半乳糖苷酶，木糖苷酶和外源性半乳糖醛酸酶及其ortholog或同工酶。40.生產細胞壁多糖材料的方法，相對于野生型形態，該細胞壁多糖材料具有修飾的結構和組分，該方法包括以下步驟(i)利用權利要求28-39任一項的方法提供轉基因植物，(ii)培養和采集所述的植株，從中分離至少有一種復合細胞壁多糖部分，其可在采集后可被植物材料自身存在的酶進行酶處理，(iii)將所述部分放置在一定的條件下，在該條件下在原生質體和非高爾基體結構中表達的細胞壁多糖修飾酶，與細胞壁多糖底物接觸，或者在體內條件下表達的無活性細胞壁多糖修飾酶被激活，從而獲得修飾的細胞壁多糖，和(iv)分離修飾的細胞壁多糖材料。41.權利要求40的方法，其中獲得的材料中修飾過的細胞壁多糖被修飾成含有，至少一種單糖的改變比例不小于10％或至少一種糖苷鍵的改變比例不小于10％的單糖分布。42.權利要求40或41的方法，其中植株部分是馬鈴薯植株部分，在采集后，該部分中至少有一種復合細胞壁多糖被植物材料自身存在的酶處理。43.權利要求39-42任一項中的方法，其中采集后修飾的細胞壁多糖是果膠。44.用權利要求39-43任一項的方法獲得的植物細胞壁多糖材料，相對于野生型狀態，該材料含有修飾過的結構和組分。45.用權利要求1-18任一項的方法獲得的轉基因植物或其后代或其部分。46.從權利要求45的轉基因植物或其后代或其部分中獲得含有植物細胞壁多糖的材料。47.權利要求46中的含有植物細胞壁多糖的材料，相對于含有相應的野生型細胞壁多糖的材料來說，其至少有一種被改變了的功能性性質。48.權利要求47的含有植物細胞壁多糖的材料，其被改變的功能性性質選自藥學活性、水結合能力、可加工性、膠凝性、粘稠性和可消化性。49.權利要求45中的轉基因植物或其后代或其部分或權利要求46-48任一項中的含有植物細胞壁多糖的材料在制造下列產品中的用途食品、飼料產品、藥物或醫學產品和化妝品。50.含有權利要求46-48任一項中的含有植物細胞壁多糖的材料的藥物或醫學產品，包括選自下列的產品藥物組合物、移植材料、醫學器械、傷口敷料和外科粘結劑。51.用權利要求19-39中的任一項的方法獲得的轉基因植物或其后代或其部分。52.從權利要求51的轉基因植物或其后代或其部分中獲得的含有植物細胞壁多糖的材料。53.權利要求52中的含有植物細胞壁多糖的材料，相對于含有相應的野生型細胞壁多糖的材料來說，其至少有一種被改變了的功能性性質。54.權利要求53的含有植物細胞壁多糖的材料，被改變的功能性性質選自藥學活性水結合能力、可加工性、膠凝性、粘稠性和可消化性。55.權利要求51中的轉基因植物或其后代或其部分或權利要求52-54中任一項的含有植物細胞壁多糖的材料在制造下列產品中的用途食品、飼料產品、藥物或醫學產品和化妝品。56.權利要求52-54任一項中的含有植物細胞壁多糖的材料的藥物或醫學產品，包括選自下列的產品藥物組合物/移植材料、醫學器械、傷口敷料和外科粘結劑。57.生產含有復合植物細胞壁多糖的材料的方法，其中的多糖相對于野生型形態的細胞壁多糖來說具有一個修飾的結構和/或修飾的組分，該方法包括如下步驟(i)用權利要求1-18和19-39任一項中的方法提供可培養的轉基因植物或其可培養后代，(ii)在合適的植物培養條件下培養所述的轉基因植物或其后代，以得到含有至少一種具有修飾結構和/或修飾組分的復合細胞壁多糖的植物材料，和(iii)從培養的植物中分離含有修飾過的細胞壁多糖的材料。58.權利要求57的方法，其中培養的植物或后代是馬鈴薯植株。59.權利要求57或58的方法，其中從培養的植物中分離的材料含有細胞壁多糖，該多糖相對于野生型植物來說被修飾成具有其中至少有一種單糖被改變的比例不小于10％或至少一種糖苷鍵被改變的比例不低于10％單糖分布。全文摘要本發明提供了制備轉基因植物及其部分的方法，相對于野生型狀態來說，該轉基因植物及其部分中的復合細胞壁多糖結構被修飾，其中的修飾至少包括整個糖苷鍵的連接方式和單糖分布中的一種，該方法包括用能使復合細胞壁多糖修飾酶的產量改變的核酸序列來轉化植物細胞，所述的修飾酶包括內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶、內源性鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、內源性半乳聚糖酶(endo－galactanases)、內源性阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶，如β－半乳糖苷酶、木糖苷酶和外源性半乳糖醛酸酶。修飾可以在體內發生，也可以在采集后發生。在后一種情況下，生長的植物中的修飾酶與其底物分開，例如將酶定位到高爾基體、內質網、液泡或以失活的形式存在于植物中。采集后，將酶與其底物接觸，或者將其激活，從而對細胞壁多糖的進行所需的采后處理。轉基因植物材料的功能也得到了提高，并將其用于食品和飼料制造，以及作為藥學或醫學活性物質。文檔編號A61P17/02GK1418254SQ01807501公開日2003年5月14日申請日期2001年2月12日優先權日2000年2月10日發明者P·尤爾弗斯科夫,H·舒爾斯,R·維瑟,B·伯克哈特,S·O·瑟蘭森,R·歐曼,J-P·溫肯,M·斯克約特,C·D·沃拉跟,G·貝爾德曼申請人:生物學有限公司