專利名稱：含脂細菌莢膜多糖轉化為無脂多糖的方法
技術領域：
本發明由包括來自革蘭氏陰性細菌的特定型莢膜多糖的細菌培養基中制備無脂的莢膜多糖，沒有內毒素，不會遭到莢膜多糖的基本損失。該方法將具有共價結合的甘油二酯部分的莢膜多糖轉化為無脂多糖。在本發明的優選方案中，脂多糖、LPS或內毒素也由莢膜多糖中除去，而共價脂已由莢膜多糖解離。
本發明的方案中，方法用于制備無脂多核糖基核糖醇磷酸酯，這里稱為PRP，它是由致病的細菌流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)b型，也稱為Hib，的培養基中產生的莢膜多糖。所產生的PRP是適于作為制備疫苗的組成，該疫苗用于誘導防止因Hib引起的疾病發展的免疫應答。由本發明，可以預見到，其它的具有類似共價脂的致病細菌，如大腸桿菌(E.coli)或腦膜炎雙球菌(Neis-seriameningitidis)中的莢膜多糖，使用本文公開的報導，也可以按同樣高產率進行生產。
致病性細菌，Hib，對許多疾病可應答，其中最重要的是細菌性腦膜炎和全身細菌性疾病，它主要發生在5歲以下的兒童中。目前，針對Hib的疫苗已由FDA許可使用于人類，參閱1991 physicians Desk Reference，pp 1476-1478(Merck & Co.Inc′s PedvaxHIB
)pp1174-1176(lederle′s Hib TITER)。
描述于美國專利US4695624和US4882317的方法提供了一種生產抗Hib的疫苗。在該方法中所用的PRP是由培養的流感嗜血桿菌b型中得來的，并由培養基分離部分多糖。然后將分離的PRP與由腦膜炎雙球菌b的外膜蛋白絡合物相結合，它作為PRP的免疫加強載體，而本身對幼兒是缺乏產生免疫性的。
現在涉及美國專利US4695624，將800升b型流感嗜血桿菌發酵物濃縮(16欄24行)到377克濕膏體物。通過在有氧化鈣的不同濃度的乙醇中的選擇沉淀回收PRP。得到68克干產品(17欄第1行)，下文稱為苯酚前粉末。進一步的工作包括苯酚提取和乙醇沉淀，產生39克干產品(17欄，49行)然后最終以34.7克干產品結束(18欄14行)。這種材料下文稱為苯酚后粉末。該苯酚后粉末可以結合或進行再純化以除去內毒素。
內毒素是在以細菌衍生的免疫原接種時，哺乳動物內溫度提高的主要原因。通過除去脂A的脂多糖，可以消除這種所謂的致熱應答。下文認為與免疫原的內毒素、熱原或LPS是同義的。為了達到這目的，上面所得苯酚后PRP產品可以進一步純化，以致進行調節對熱原的標準。在本發明研制以前，通過選擇性乙醇分餾在苯酚后粉末中損失所存在的PRP約70%而達到目的。這包括通過加入足夠濃度的乙醇以剛好開始沉淀，即在美國專利US5039610和U.S.S.N.595722中略述的所謂濁點而由苯酚后PRP中沉淀LPS。將乙醇加到濁點，這時在濁度方面達到約二倍的增加。再加入0.5～2%乙醇，至此得到一種廢產品的沉淀，下文稱為低切(low-cut)，而無脂PRP留在溶液中。低切含有約70%PRP和基本全部LPS。
企圖克服因除去內毒素的選擇乙醇分餾所導致的PRP損失，美國專利US5019502方法的發明者研制了一種方法以除去LPS而基本不損失PRP。該方法包括將溶解的苯酚后粉末通過一增水性吸附步驟，或者按批量模式或按柱色層模式，而且最好使用一種結合內毒素而不結合多糖的非離子型樹脂。
使用一種高度多孔的苯乙烯和二乙烯苯共聚體的樹脂，例如HP20，果真可以基本上定量地除去全部內毒素而提供幾乎定量產額的PRP。這種材料在下文稱為HP20-后PRP。但是，由Hib產生的PRP的主要部分是呈共價脂肪-PRP。
由流感嗜血桿菌b型產生的PRP可能是脂肪-PRP，首先由Kuo等人[J.Bacteriol，163，769-773(1985)]所認識，其中流感嗜血桿菌b型是在加有放射性棕櫚酸和/或放射性核糖的液體培養基中生長的。由培養基上清液純化的多核糖基核糖醇磷酸脂含有放射性核糖和棕櫚酸兩種，它們在生物合成期間摻入PRP。表明磷脂酶A2(PLA2)處理可由PRP除去某些放射性棕櫚酯，因而，破壞非共價結合的方法是不成功的。沒有給出脂肪-PRP的結構，但是所列數據與早期文獻中所報導的數據相一致，該文獻提出了腦膜炎球菌A、B、C和大腸桿菌K92多糖的結構[Gotschlich等人，J.Biol.chem.256.8915-8921(1981)]。在本發明中，以特定的磷脂酶研究，揭示了脂肪-PRP的結構，它與下面詳述所列出的一致。
與分子的非常大的多糖部分的占優勢的陰離子性質相反，由于因共價類脂而在脂肪-PRP上具有較少的憎水性質，脂肪-PRP并不結合到US5019502發明中所用的憎水性樹脂上。這樣，由該方法得到的最終產品含有脂肪-PRP的主要部分以及無脂的PRP。除去這種脂肪-PRP，或者通過選擇性乙醇分餾，它將損失約70%PRP，或者通過使用本文公開的方法，從而基本上按無脂PRP回收全部PRP。
因此，本發明的目的是提供一種方法，用于回收無脂莢膜多糖致使產生一種結合的產品，該產品與僅使用通過選擇醇分餾所制得的無脂多糖部分所制備的結合物不可區別。本發明的另一目的是提供一種高產額PRP生產的方法，它包括將脂肪-PRP轉化為無脂肪PRP，而不是棄去脂肪-PRP。另一目的是提供一種能重復PRP產量和一致性的生產方法，該PRP得自流感嗜血桿菌b型培養物，以保證用這樣制得的PRP所生產的結合疫苗的一致性。本發明的其它優點和目的由以下完整的描述中可以更加明顯。
用于由包括來自革蘭氏陰性細菌的特定型莢膜多糖的細菌制備莢膜多糖的一種方法，它包括將具有共價接合到類脂的莢膜多糖轉化成無脂的莢膜多糖并除去內毒素污染。在一具體方案中，通過處理粗制的或純化的由流感嗜血桿菌b型培養基所得的PRP制劑而將脂肪-PRP轉化為無脂肪PRP，通過用磷脂酶D，在含有約50%體積的有機酶活化劑、約0.3%去污劑和約5mM二價金屬陽離子的緩沖液中，在約35℃和約中性PH值下離解PRP的共價脂約30分鐘到約4小時，然后除去酶、殘留的脂以及脂多糖。


圖1，提出脂肪-PRP的結構。
圖2，使用選擇性醇分餾法所制備的PRP，與使用將脂肪PRP酶促轉化為PRP，接著除酶和除LPS所制備的PRP的比較。
圖3，用于將脂肪-PRP轉化為無脂PRP和除內毒素的最佳方法。
本發明是一種方法，用于由細菌莢膜多糖離解共價結合的脂并除去脂和內毒素污染。可以使用化學或酶促方法以除去脂。具有共價結合脂的多糖的選擇性乙醇分餾導致莢膜多糖餾份作為稱為“低切”廢產品而損失。通過有效地去除共價結合的脂，本方法避免了選擇性醇分餾所遇到的莢膜多糖的損失，而提供了一種多糖產品，它可用于制備一種游離的或結合的多糖疫苗，以防止衍生多糖的病原體的感染。共價脂可以通過用例如羥胺處理而除去。由莢膜多糖離解共價脂的優選方法是酶促法。本發明的優選方案中，達到了高產額制備多核糖基核糖醇磷酸酯PRP(改進的PRP方法)。
本發明方法可以參考圖1來理解。列出了脂肪-PRP的一種所推薦的結構，它取決于用限定特征的磷酯酶的研究。無脂PRP的結構與圖1所示的一樣，除了沒有甘油二酯部分酯化到PRP重復單元的磷酸酯上以外。此外，在脂肪-PRP中存在的甘油已通過DionexHPLC證實，存在的葡糖也已證實。
已知磷脂酶A2(PLA2)是在所指出的二甘油酯Sn-2位置上離解。當PRP與商購的PLA2(Sigma，Boehringer)制劑反應，釋放的脂肪酸由氣體色譜分析監測，注意到棕櫚油酸降低[16∶1 cis9]但不是棕櫚酸(16∶1)或肉豆蔻酸[14∶0]，其全部是在脂肪-PRP中檢測到的。
商購的磷脂酶B(Sigma)可以除去某些部分的棕櫚酸和棕櫚油酸，但不能用這種酶除去葡糖和甘油。此外，磷脂酶C(Sigma)的活性似乎阻斷，因而在圖1中葡糖的位置是確定的。商購磷脂酶D(Sigma，Genencor，Boehringer)除去全部脂肪酸，以及甘油和葡糖。然而，這些酶中沒有一個最初可單獨使用，并且在本方法選定以前沒有一個酶可由PRP除去100%脂肪酸。本發明提供了一種最佳方法，只使用PLD，而達到完全除去脂。此外，也能使用PLD和PLA2或PLB的混合物而有利于除去共價脂。在本發明的一個具體方案中，在室溫下結合使用磷脂酶A2和磷脂酶D可由脂肪-PRP上完全除去共價脂，然后將無脂PRP產品與免疫原的蛋白相對合，表明在提高強抗-PRP免疫應答中是有效的。
要求降低磷脂酶的必要量，因為這些酶是昂貴的，而且因為減少酶量便于由產品中除酶。使用700U磷脂酶A(得自豬)和20U磷脂酶D[得自暗褐色鏈霉菌(Streptomyceschromofuscus)]和30%丁基醚以及0.1%有效酶刺激物的DOC一起，可以達到由酚苯后粉末PRP中完全去除脂肪酸。文獻中已描述過，磷脂酶和類似的酶對反應添加劑如去污劑和有機溶劑是十分敏感的。特別是，Kates表明，質粒磷脂酶C因加入乙醚-甲醇混合物而大受刺激，認為它們可協同地相互作用以使基質和酶相在加強的酶活性區并生[Can.J.Biochemandphysio，35，127，(1957)]我們估計，類似的機理可以控制磷脂酶活性，因而研究了醚-甲醇混合物在酶實施上的效果。
丁基醚/甲醇混合物證明是一種很有效的磷脂酶反應的活化劑。包括將苯酚后PRP粉末友有5比1(v/v)的丁基醚和甲醇混合物時與PLA2和PLD反應，接著用HP20樹脂處理以降低內毒素的一種方案導致由PRP完全除去脂。再者，酶的必需量，對PLA降低到3.5倍(由700U到200U)，對磷脂D降低1倍(由20U降為10U)。在酶反應后使用HP20處理的另一優點是憎水樹脂吸附反應混合物中的一些酶，這樣減輕下面酶清除的負擔。
由于要求制備一種人類施用的疫苗，希望使用盡可能少的酶要完全除去酶或盡可能地完全，并使用一種由不可能由哺乳動物病毒污染的源產生的酶。不希望使用豬PLA2，因為有可能增加不希望的免疫應答危險性，并且可能在哺乳動物衍生的產品中有目前不可檢測的病毒。在上述同樣反應條件下測定了由紫色鏈霉菌(Streptomy-ces violaceoruber)分離的PLA2。使用由鏈霉菌制得的磷脂酶結合物可成功地去除脂。進行了其它實驗以測定對100mgPRP所必要的最少酶量是對鏈霉菌PLA2是100～200U之間，而對PLD是2～10U之間。
應注意到，稱為磷脂酶A2、D或B所存在的酶有許多不同的源。蛇毒是PLA2的富源，而PLD可以由卷心菜、花生和鏈霉菌中分離。特定源的選擇是極大地決定于上述關系和商購酶制劑的比活性。另外，其它脂酶可能呈現足夠的二代類磷脂酶(secondary phospholi-pase-like)活性使得它可用于我們的應用中。用于本目的的這些其它脂酶，在本發明中是顯然的。
或使用磷脂酶的結合物或只使用磷脂酶D的酶促方法，苯酚后由粉末PRP中分裂脂已表明是良好的重現性并能適應流感嗜血桿菌的苯酚和乙基汞硫代水楊酸鈉失活的培養基之間的脂含量的變化。另外，當酶促反應后進行HP20處理，則熱原大大降低，由苯酚后PRP起始粉末的60EU/mcg降為酶促反應后的約10EU/mcg并在HP20處理后降到0.0125EU/mcg。這似乎是一個優良的方案，保證脂的完全去除，大大降低LPS和高的PRP回收。當然，其它的方案也是可能的，例如在PRP分離方法前的脂酶摻雜，例如在發酵液體培養基中或在在滅菌后即時摻雜。其中各種步驟進行次序的變換當然也落在本發明內。
本發明的優選方案中，在最佳反應下達到由脂肪-PRP中酶促除去全部脂，它包括將PRP與得自暗褐色鏈酶菌的單獨磷脂酶D，在其對PRP約0.3%(重量)的磷脂酶D的比例下進行反應。這種酶通過Im-amura和Horiuti[J.Biochem85，79-95(1979)]方法純化到均一性，并通過GenencorInternational商購，但如上所指出，也可使用其它的PLD源。
對PLD的最佳條件，包括加入Triton X-100，它似乎是一種比脫氧膽酸鹽(DOC)更有效的酶活化劑。另外酶的活性對C2+a量也是敏感的。為增加酶活性，加入4.5mM Triton X-100和C2+a(5mM)，雖然其它二價金屬陽離子，如鎂，也可以使用。在反應混合物中加入鈣，提出了有必要使用非磷酸鹽的緩沖劑，如PH7.4的10mM Tris.加到反應混合物的有機溶劑量增加到50%v/v，以甲基-叔丁基醚代替丁基醚，它降低了安全關系。使用這些改變的酶反應條件并接著進行HP20處理，可以達到由苯酚前粉末PRP中完全除去脂，在2克上重復反應，每個是二個不同批的苯酚前粉末PRP，表明重現性和在苯酚前粉末PRP上PLD處理的有效性。通過Sepharose CL4B色譜法測定分子大小來檢測無脂產品。產品的kd約為0.4～0.5，這對PRP免疫原性是合格的。當然在反應中也可以使用其它緩沖條件或類似的去污劑，這對本領域的技術人員是可以理解的。
改進的PRP方法表明在嗜血桿菌b結合疫苗(腦膜炎球菌蛋白結合物MeningococcalProteinConjugate)制備裝置中是三重的。按連續系列使用6個苯酚-失活流感嗜血桿菌的發酵批。發酵批要測試其培養基純度、流感嗜血桿菌的失活以及PRP抗原含量，結果是全部滿意。制備三個PRP制造批并以后用作制備三個大規模嗜血桿菌b配合疫苗(腦膜炎球菌蛋白結合物)的原料。每個都由二個發酵培養基開始三批PRP的產品回收率，約以3.5倍高于使用選擇乙醇分餾的產率。
用改進方法制備的三批PRP，以后用于制備嗜血桿菌b配合疫苗(HaemophilusbConjugateVaccine)(腦膜炎球菌蛋白結合物)。進行測試所得的嗜血桿菌b多糖材料，嗜血桿菌b(PRP-OMPC)結合材料，以及嗜血桿菌b結合疫苗(腦膜炎球菌蛋白結合物)最后容器表明，這些材料合部與由選擇性醇分餾方法制得的類似物料不可區別。
低切PRP是由選擇性乙醇分餾得到的廢沉淀(含有LPS，脂肪-PRP和損失的PRP)，這是在美國專利US5039610中公開的PRP生產方法的最后一步。使用用于苯酚前粉末的同樣改進反應條件，接著用HP20處理，基本上由低切粉末完全除去脂，它是有效的并具有大于70%PRP的產額。
反應混合物含有活化磷脂酶的有機溶劑，而且其量最好為反應物體積的約30%～60%之間。有機活化劑優選的是一種醚，如二乙醚或甲基-叔丁基醚。醚有利于與第二種有機溶劑如己烷、乙醇或甲醇相混合，其比例為醚對第二種有機溶劑的比例約為20∶1～5∶1之間，而優選的是醚對第二有機溶劑之比約為9∶1。在最優選的方案中將9份比二乙醚更少揮發的甲基-叔丁醚與約1份乙醇相混，因而處理更安全，將這種有機混合物加到PLD反應中使最終有機濃度約為50%。有機溶劑的條件是要有助于使脂基質和酶呈極大的接觸。
此外，有機酶活化劑的條件，要求提供一種去污劑如脫氧膽酸鹽或Tritonx-100，或一種類似的去污劑，以有助于打碎脂類的聚集體，并加強酶-基質相互反應。去污劑濃度可以是約0.1～0.4%之間。加入約0.3%Tritonx-100，發現是十分滿意的。
對于脂肪-莢膜多糖，要提供足量磷脂酶D以在適合的時間期內達到共價脂的完全水解。對于PRP、PLD的量為約0.01～10%，優選的為約0.1～0.4%是合適的。當然，加入較少量的酶需要更長的反應時間，而加入更多量的酶將縮短反應時間。
在反應中要保持全部反應相的攪拌以保證相互接觸，其中約0.1～0.4%(重量)PLD，約0.1～約10mM二價金屬陽離子，如CaCl2，在適宜于上述試劑的緩沖液中，如Tris，PH約7.0～8.0之間，溫度約20℃～45℃之間，優選為30～40℃之間，可以在約30分鐘-4小時的反應時間內由脂肪-PRP上完全除去共價脂肪酸。
發現上述反應條件十分適合于無共價脂的PRP制備，以十分不同純度的PRP制劑開始。因而，苯酚前粉末、苯酚后粉末以及HP20后產品都可以在這些條件下處理，并注意到無共價脂的PRP的一致性生產。
在給定制劑中將脂肪-PRP再轉化為無脂PRP，在PRP制劑中現在所存在磷脂酶可以通過蛋白酶的苯酚提取而除去。為保證完全除去，苯酚萃取最好至少重復一次到約4次提取。這種處理不僅除去加入的酶，也除去任何殘留的蛋白污染而不干擾下一步的結合或在疫苗受體中的不提供不歡迎的免疫應答。
酶促處理PRP而生產無共價脂肪酸的PRP，它也由LPS離解了某些脂肪酸。因而酶促處理的結果使內毒素降低約三倍。但是這降低的水平往往不足以滿足致熱性的特點，需要另一步以驟以消除殘余的LPS。現有技術中已知的任何許多方法，包括選擇性乙醇分餾，憎水吸附或其它方法，在美國專利US5019502提供的說明書中都進行了研討，這些都可用于進一步除去內毒素。在本發明使用的樹脂包括但不限于BorateAvidgel(Amicon)，AmberliteXAD和Amberch-rome(Rohm&Haas)，OctylCellulese(PhoenixChem)，SilicaC8(Baker)，SP和HP系列樹脂(如SP207、HP20、HP50)(MitsubishiChem)。在這些樹脂中，優選的是HP20或HP50，因為它們具有降低脂多糖、易于使用、可達性、價低以及其避免結合到多糖的傾向。優選的是在使用前用無熱原的水洗滌樹脂。更優選的是在使用酸前用酸溶液、堿溶液或一種極性溶劑(如乙醇或甲醇)洗滌樹脂，然后用無熱原水洗滌，最后用含有3%檸檬酸鈉和0.5%脫氧膽酸鈉預平衡。同樣，多糖最好溶于含有約3%檸檬酸鈉和約0.5%脫氧膽酸鈉的緩沖液中，然后用按上述制備的憎水樹脂進行處理。加入約25mMTrisPH8.0也是有助于阻止PH值波動。
含有共價脂的莢膜多糖可以在除內毒素之前或之后轉化為游離多糖。在本發明的方案中，將自含有多核糖基核糖醇磷酯酯、脂多糖和各種脂和蛋白的流感嗜血糖菌b的發酵液體培養基中制得的粉末溶于10mM Tris、5mM、CaCl2、4.5mM Triton X-100、PH7.4的溶液中并加入9∶1的叔丁基醚∶乙醇的混合物至50%濃度。加入相對于PRP的約0.3%(重量)的由暗褐色鏈霉菌制得的磷脂酶D，在恒定攪拌下35℃，進行離解脂約3小時。反應產物用苯酚提取4次以除去蛋白污染物包括加入的酶，而得到苯酚后樣品。
然后將苯酚后樣品在堿性PH下溶于去污劑/螯合劑的混合物中。加入用同樣緩沖液預處理過的HP20樹脂珠并在一軌道振蕩器中與PRP溶液在室溫下混合數小時。通過過濾由溶液中除去樹脂珠，并滲析過濾(diafilter)濾液以除去去污劑和螯合劑。回收滯留物并加入氯化鈣。PRP用95%乙醇由溶液中沉淀。離心沉淀，并將沉淀用乙醇和丙酮研制。真空干燥所得產品。
使用憎水樹脂珠的方法導致內毒素沾污量低并沒有明顯損失PRP。由這處理內毒素降低量一般在原料和最終粉末間為100～2100倍，它取決于最初內毒素的含量。PRP的產額一般至少75%，而有時高于原料的90%。
描述于“GuidelineonvalidationoftheLALtestasanend-productendotoxintestforhumanandanimalparenteraldrags.biologicalproductsandmedicaldevices”(美國USDepartmeatofHealthandhumenServices1987年12月)的LimulusAmeobocytelysate(LAL)試驗用于測定內毒素含量。
在本發明的優選方案中，通過在酶促處理后，使用上述HP20或其它合適的多孔苯乙烯和二乙烯基二苯共聚體或類似的憎水介質進行憎水吸附LPS而得到無內毒素和無脂的PRP。
按照任何許多已知方法，制得革蘭氏陽性細菌的莢膜多糖，包括列于美國專利US4695624中對流感嗜血桿菌b型的那些，以及腦膜炎雙球菌(腦膜炎球菌meningoeoccal)基團A、B、C、X、Y、W135和29E多糖的陰離子莢膜多糖，以及大腸桿菌K1，K12、K13、K29、K92和K100多糖類。但特別優選的多糖是選自含有Hib多糖基團的那些莢膜多糖，例如，描述于Rosenberg等人的J.Biol.Chem.236PP2845-2849(1961)和Zamenhof等人的J.biol.chem.203PP695-704(1953)中的那些。在本發明的一個方案中，一種由流感嗜血桿菌b型得的莢膜多糖是多核糖基核糖醇磷酸酯，它按照描述于美國專利US4695624的方法，通過病原體發酵而分離。通過加入1%乙基汞硫代水楊酸鈉或加入約0.5%苯酚殺死病原體。離心除去細胞碎片，并通過超過濾濃縮粗制多糖而提供本文所稱的粗制PRP。如果按照上述酶促方法在粗制PRP上進行酶促處理而將脂肪-PRP轉化為無共價脂的PRP，則可以優化游離PRP的產額，并且在發酵介質或在任何其后的步驟中直接加入脂酶，則將是有利的。
例如，酶促處理可以延遲到通過任何以下處理的部分純化后，或者在部分任何以下處理后，或在以下處理作相當變化以后通過除去不溶于48%乙醇(v/v)的污染而生產苯酚前粉末，加入乙醇到61%以回收多糖，再溶解于約1M CaCl2并除去不溶于23%(v/v)乙醇的另一些污染物，接著在37%乙醇中回收PRP，最后在無水乙醇中研制或通過將苯酚前粉末溶于0.448M乙酸鈉緩沖液中并用0.448M乙酸鈉、PH6.9緩沖的72%苯酚提取約4次，接著通過滲析過濾以由水相中移去苯酚，接著通過加入CaCl2到約0.05M和加入乙醇到約67%而以沉淀狀回收PRP，接著再溶解于0.05M CaCl2中除不溶于20%乙醇的污染物，并以37%乙醇不溶沉淀回收苯酚后PRP并在無水乙醇中研制，或者通過按上述用磷脂酶處理，除去蛋白和內毒素而可由“低-切”回收PRP;或者通過任何合適方法，優選通過按上述和在美國專利US5019502、US5039610和USSN595722中所述方法用HP20樹脂處理而生產無內毒素PRP之后。
按照本發明方法制備的多糖，通過目前的分析方法，與通過選擇性醇分餾法除去內毒素和含脂莢膜多糖所產生的多糖，在化學上是不可區別的。在下面表1中，比較了由PLD處理而生產的PRP物理化學特性與由選擇性醇分餾法所生產的PRP的特性表1PLD處理的PRP醇處理的PRP%通過GC的FA<0.012wt%<0.012WT%KD0.50.5內毒素EU/μg0.01EU/mg0.6EU/mg在PRR生產方法中進行了認真研究以優化每一步驟。這些研究結果提出了示于圖3的方案。
A優化酶反應條件進行了一系列的實驗，以畫出在由低切粉末除脂上，酶活性敏感性隨甲基-叔丁基醚含量、Triton量、溫度、基質濃度、酶量以及反應時間的變化，以確定在操作條件上的適宜限量。在每個情況下，所推薦的條件是在或近于脂肪酸降低的最大量。
B優化HP20處理進行了研究以在HP20LPS去除步驟期間保持較好的PH值控制以降低主要PRP的潛在水解。這些研究包括用2體積的DOC/檸檬酸鈉溶液預平衡樹脂，在與新鮮緩沖溶接觸時期PH漂移后，使用Tris-緩沖的DOC/檸檬酸鈉溶液并繼續監測PH值。沒有預平衡或檸檬酸鈉/DOC溶液緩沖，在3小時的批量吸附期間，PH值漂移可高達9.2-9.5。在預平衡的情況下，PH向上漂移限制到8.8。通過預平衡樹脂，并也用2.5mMTrisPH8.0的溶液緩沖，則PH漂移甚至更小，并可在整個批量吸附中保持很好控制PH在＜8.5。也測試了HP20處理PRP的其它條件。GC脂肪酸分析以及LAL數據提出了最佳去除內毒素是在5-10mgPRP/mL而不是以前所用的2.5mgPRP/ml。結果也表明了含有0.5%DOC、3%檸檬酸鹽和50mMTris、PH8.0是最佳的。因此，全部以后的HP20處理都用樹脂預平衡，使用50mMTris、0.5%DOC、3%檸檬酸鹽PH8的溶液、在PRP濃度為5-10mg/ml的條件下進行。
C滲析過濾步驟的評定HP20處理后，PRP產品是在一種含有Tris、DOC和檸檬酸鹽的溶液中產品需要通過滲析過濾而變成一干凈的水溶液。二個Pellic-on單元，一個有再生的纖維素而另一個有一聚堿膜，它們與一聚砜空心纖維濾筒一起測試HP20-處理過的PRP溶液的滲析過濾。再生的纖維膜表明比任一聚砜膜具有更大的DOC抑止速度;但在Pellicon聚砜膜大大地顯示更大的流量。令人關注的流量和DOC抑制數據提出了一種Prostack單元比目前所用的空心纖維膜工藝更為有效。在比較了膜面積、工藝時間和所需成本，認為具有聚砜膜的Prostack單元，將提供最好的實施。
由上面的研究優化了一種改進的PRP生產方法，包括酶反應、4次苯酚提取、HP20處理、滲析過濾以及醇沉淀，而且分析了每個步驟以限定其這行界限。改進的方法綜合于圖3。
按照本方法制備的多糖是用于制備含有游離或結合的細菌莢膜多糖的疫苗。結合的多糖，特別是PRP-OMPC結合物，可用于幼兒以防止疾病，因此游離的PRP可以不誘導足夠的免疫應答。使用按本發明制備的多糖制備結合物可以通過按照美國專利US4695624的報導進行完成，列入該文作為參考，并在此提出其實施例本發明的公開在參考以下實施例下可進一步理解，不能認為實施例是限制本公開的范圍。
實施例1制備流感嗜血桿菌b型莢膜多糖發酵A步接種物和種子發育將一管裝冷凍干燥的流感嗜血桿菌b型(由Ross768培養，由StateUniversityofNewYork得到)懸浮在1ml滅菌的嗜血桿菌接種基(參閱下面)中并將這懸浮物展開在19個巧克力瓊脂盤(cbocola-teAgarplates)(BBL)上。在37℃在燭狀罐中保溫20小時后，在每個盤上的生長物再懸浮在1-2ml嗜血桿菌接種基并收集在一起。
嗜血桿菌接種基☆大豆胨10g/lNaCl5g/lNaH2PO43.1g/lNa2HPO413.7g/lK2HPO42.5g/l蒸餾水到體積☆溶液的PH值調節到7.2±0.1(通常值為PH7.23)的目的值，而且溶液通過高壓滅菌器在121℃滅菌25分鐘。
B步2升無蓋Erlenmeyer燒瓶由“A步”(上面)得到的1/3部分的再懸浮細菌用于接種到3個2升燒瓶中，每個燒瓶中含有約1.0升的完全嗜血桿菌種和生產基(參閱下面)。然后將燒瓶在37℃在200rpm的旋轉振蕩器上保溫5小時，在培養期終止時，特征的OD660值為0.37。
完全的嗜血桿菌種及生產基NaH2PO43.1g/lNa2HPO413.7g/l大豆胨10.0g/l酵母提取物的滲析過濾液(1)10.0ml/lK2HPO42.5g/lNaCl5.0g/l葡糖(2)5.0g/l
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(3)2.0mg/l氯化血紅素(4)5.0mg/l鹽和大豆胨是溶于少量熱的無熱原的水中并用另外的熱的無熱原水加到最終體積。然后將發酵器或燒瓶在121℃滅菌約25分鐘，冷卻后，在要接種前，將酵母提取物滲析過濾液(1)、葡糖(2)、NAD(3)和氯化血紅素(4)無菌地加到燒瓶或發酵器中。
(1)酵母提取物滲析過濾液將100克啤酒酵母提取物(Amber)溶于1升蒸餾水中并在有H10×50濾筒的AmiconDC-30空心纖維中進行超過濾，以除去分子量50000的分子。收集濾液并通過0.22m膜作為滅菌產物。
(2)葡萄糖制備成無菌的25%的玻璃-蒸餾水溶液。
(3)含有20mg/mlNAD的儲備液，通過經一微孔濾器(0.22m)過濾而滅菌并在接種前才無菌地加入。
(4)氯化血紅素3X儲備液通過在10ml0.1MNaOH中溶解200mg并且蒸餾的無菌的水調節體積到100ml而制備。溶液在121℃滅菌20分鐘，并在接種前無菌地加到最終基質中。
C步70升種子發酵器3升“B步”的產品用于接種含有41.4升完全嗜血桿菌種和生產基質(按上述制備)以及17mlUCONB625防沫劑的70升發酵器中。PH值開始在7.4。
在37℃100rpm攪拌下保持發酵并用光密度(O.D)和PH測定監測，直到達到特征的O.DO.39為止(約5.5小時后)。
D步800升生產發酵器約40升“C步”產品用于接種一個含有570升生產基質(按上述制備)定標到必要的體積和72mlUCONLB625防沫劑的800升發酵器。
在37℃100rpm攪拌下保持發酵，約每2小時核對O.D和PH值，直到O.D在2小時期間是相同為止，在這時，中止發酵(12小時后特征的最后O.D.是0.54)收集和失活約600升批料通過收庥到一含有12升1%乙基汞硫代水楊酸鈉的“死罐”而失活。
澄清在4℃8小時失活后，批料在4英寸球形Sharples離心機中離心，流速調節到保持產品清徹(在1.3～3.0升/分之間變化)。離心(15000rpm)后，所得的上清液用于回收產品。
通過超過濾分離和濃縮合并兩生產發酵物的上清液并在一有10個(斷流50000道爾頓)空心纖維濾筒(275英尺2膜面積)的Romicon超離心單元中，在2-8℃時濃縮，在約4.5小時后，1200升已濃縮到32.5升。棄去濾液。
48%和61%的乙醇沉淀在32.5升Romicon滯留物中，在1小時期間，在4℃并攪拌下滴加30升95%乙醇直到乙醇的最終體積濃度為48%。混合物在4℃再攪拌2小時，以確保完全沉淀，通過一單元的4英寸Sharples離心機，按15000rpm下收集上清液(流速＝0.27升/分)。棄去不溶沉淀，在1小時期間加入20.8升95%乙醇，使清徹流體的乙醇濃度為61%。再攪拌混合物3小時以確保完全沉淀。
回收第二次沉淀通過在4英寸Sharples離心機中，在15000rpm下離心(流速＝0.62升/分)而收集所得的48%乙醇溶解-61%乙醇不溶的沉淀，并棄去61%乙醇上清液。粗產品產額是0.377kg濕膏體，稱為粗制PRP。
氯化鈣提取將377g 61%乙醇不溶物，在-Daymox分散容器中，在2～8℃下，與6.5升冷的玻璃-蒸餾水相混合，在這混合物中，加入65升冷的2M CaCl2″H2O，在4℃下萃取混合物(最終濃度＝1.0M CaCl2)15分鐘。然后用2升1M CaCl2″H2O洗出容器，得到15升的最終體積。
23%乙醇沉淀由上面得到的15升CaCl2提取物，在攪拌下在4℃時30分鐘期間按滴加入4.48升95%乙醇，使乙醇濃度為23%，在再攪拌17小時后，通過-K2超離心機在4℃25000rpm下(流速-165ml/分)將混合物離心6.5小時。上清液通過筒子紗布而傾倒以除去類脂的浮游物并棄去不溶沉淀。
37%乙醇沉淀并收集粗制膏狀產品通過在攪拌下，在30分鐘期間滴加4.33升95%乙醇而將23%乙醇-溶解的上清液體提高到37%乙醇。然后將混合物攪拌放置1小時，然后不攪拌放置14小時以保證完全沉淀。然后將所得混合物在一4英寸Sharples單元中在15000rpm(流速＝0.24升/分)下離心以收集沉淀的粗制多糖(下文稱為苯酚前粉末)。
研制將由離心得到的沉淀轉入含有1升無水酒精的1加侖WaringBlender，并在最高速度混合30秒鐘。在30秒鐘開和30秒鐘關時繼續混合直到得到一種硬的白色粉末，在有聚四氟乙烯濾盤的Buchner漏斗上收集粉末，并用2個1升無水乙醇和2個2升丙酮依次就地洗滌。然后在4℃真空中干燥物料24小時，得到68g(干重)的產品。
苯酚提取由研制步驟得到的68克干物在12升0.488M乙酸鈉，PH6.9中用一個Daymax分散容器再懸浮。用4.88升新配制的苯酚水溶液立即萃取乙酸鈉溶液，苯酚溶液配制如下將900ml 0.488M乙酸鈉，PH6.9溶液在一20升壓力瓶中加到一5磅瓶裝苯酚(Mallinckrodt晶體)中并混合直到實現完全的溶解。每一次苯酚提取液都在K2Ultracentr-ifuge(Electronucleonies)中，在30000rpm下離心2個半小時，以破壞乳化。水不溶液按同一方式再用3.2升新配制的苯酚水溶液提取3次。苯酚相棄去。
滲折過濾將由上面苯酚提取的水相(17.6升)用300升冷的玻璃蒸餾水稀釋并在4℃時在-AmiconDC-30超濾裝置上使用3個H10P10濾筒進行滲析過濾。沖洗Amicon單元并將沖洗液加到滯留物中使最后體積為17.5升。棄去滲析濾液。
67%乙醇沉淀將0.438升2.0M CaCl2加到由上一步得到的滲析液17.5升中(最終的CaCl2濃度為0.05M)，并在1小時期間，以滴加法將35.88升95%乙醇加入迅速攪拌的溶液中，使溶液成為67%乙醇。攪拌4小時后，在4℃再放置12小時，用虹吸吸去清徹的上清液，并在4英寸Sharples離心機(15000rpm)中在4℃下離心45分鐘而收集沉淀。所得的多糖沉淀在1加侖的Waring混合器中，用30秒鐘開30秒鐘關的方法與2升無水乙醇研制，收集在帶有一聚四氟乙烯濾盤的Buchner漏斗上，并用4次1升無水水乙醇就地洗滌，接著用2次1升丙酮洗滌。樣品在真空中4℃下在一配衡盤中干燥20小時。得到39克干燥粉末(稱為苯酚后粉末)。
實施例2由苯酚殺死的流感嗜血桿菌b型中制備粗制PRP按實施例1同樣的發酵方法進行，除了用加入0.5%殺死病原體代替用1%乙基汞硫代水楊酸鈉失活，并在苯酚中培養細胞1小時，接著轉入一死罐至少1小時。然后按實施例1每步進行以得到苯酚前粉末。
實施例3制備“低切”并由此回收無脂PRP按照實例1生產苯酚后粉末，通過選擇性醇分餾法除去內毒素以得到無內毒素的PRP制劑和一種含有PRP部分的內毒素，稱為低-切。通過將苯酚后粉末以2.5g/l濃度溶解在0.05M CaCl2以提供一種對內毒素和PRP和二價抗衡離子。然后加醇到26%(v/v)。在溫度平衡到2-4℃范圍的恒值后，遞增地加入醇直到PRP開始沉淀(濁點)，通過濁度儀監測開始的濁度。
加入乙醇(95%)達到濁點，然后再加入1.9%。沉淀稱為“低切”。加入乙醇后，溶液立即離心以除去低切沉淀。按本發明的方法再處理由沉淀得到的脂肪-PRP，以得到下面所述的無脂PRP。在上清液中加入醇使達到38%(v/v)。通過澄清和/或離心收集所要求的沉淀并干燥到最終的粉末。在這一步的在濁度上1.2-2.0%時回收經常是25～40%苯酚后粉末。發現殘留的PRP是在低切中。
在完成選擇性醇分餾步驟后所得的低-切材料含有沉淀的脂多糖和多核糖基核糖醇磷酸鹽，通過將20g/l低切溶液在750ml緩沖液(10mM Tris，5mMCaCl2，4.5mM Triton X-100，PH7.4和等體積的9∶1甲基叔丁醚∶乙醇的混合物)中加入3000U磷脂酶D進行反應而進一步處理。反應進行2.5小時，接著以每2.6分水相產品用1分苯酚(72%在乙酸鈉中的溶液)進行苯酚提取物質4次。
通過用0.5%脫氧膽酸鈉和3%檸檬酸鈉在PH8混合而由PLD處理過的低切中除去內毒素。按每克多糖加入30克HP20樹脂(樹脂在用前用無熱原水洗滌)。將松散的樹脂珠與溶液在一軌道振蕩器上在4℃混合3小時。混合后，在不銹鋼過濾漏斗中由溶液中除去細珠。然后將濾液在-Pellicon聚砜10，000分子量斷流膜(1英尺2表面積)中，用10體積的無熱原水進行滲析過濾，保持多糖的估計濃度為≤2.5mg/ml，以除去污劑和螯合劑。回收滯留物并加入2M氯化鈣以使最終氯化鈣濃度達到0.05M。用過量95%乙醇由溶液中沉淀多糖。沉淀在13000xg下離心30分鐘，用無水乙醇和丙酮研制沉淀，然后真空干燥。最終的粉末轉到一樣品容器中并在-70℃冷凍。
用樹脂處理的物料，表明有以下內毒素量、多糖量以及脂肪-PRP量(用GC分析脂肪酸)的降低
表2LAL測試值,EU/mcg始料240終粉末0.12多糖始料15g最終粉末10.2g脂肪酸(%)始料0.4最終粉末0.009該方法始終得到的產品回收率為約68%，這是最終產品對原料的比例，并在其物理化學性質方面與選擇性醇分餾法所得的PRP產品是不可區別的。
實施例4苯酚前PRP粉末的脫脂A、磷脂酶反應將苯酚前PRP粉末(20g，按實施例2或實施例3制備)溶于1.33升的10mM Tris.5mM CaCl2.4.5mM Triton X-100.PH7.4中。在溶解的PRP中加入1.33升9∶1的甲基叔丁醚∶乙醇的混合物。加入磷脂酶D(Genencor，總3000單元，比活度70μ/ml，15單元/100mg PRP)。在240rpm攪拌反應物并在35℃進行3小時。
反應后，有機和水相在25-35℃分離30分鐘，保留下面的水相。有機相用0.266升水再提取并澄清30分鐘，然后與第一次提取液合并而得到總水相體積1.560升。
苯酚(1.5公斤，用590ml0.448M乙酸鈉平衡，PH6.9)溶于暗中。水相按每2.6份水相苯酚后樣品與1份苯酚之比提取四次。
B、HP20處理HP20(MitsubishiKasei，300g)在1300ml50mMTris，30%檸檬酸鈉，PH8.0(HP20平衡緩沖液)中預平衡。在1060ml的苯酸后樣品中加入1060ml的100mMTris，1%DOC，6%檸檬酸鈉，PH8.0而得到總體積為2120ml。然后將這樣品與預平衡過的HP20樹脂在4℃搖動混合2小時。將樹脂過濾進入柱，然后用200mlHP20平衡緩沖洗。然后將全部流過的HP20濃縮到1l，并對10升冷的無熱原水進行滲析過濾。
C、產品回收在1升樣品中，加入25ml 2M CaCl2，通過在4℃離心30分鐘而收集沉淀，然后用20ml 100%乙醇研制沉淀。過濾掉乙醇，用丙酮干燥PRP粉末而得到共9.6g去脂PRP，具有以下的特性表3LAL(EU/mg)PRP脂肪酸始料240020g1.9%終料0.489.6g0.005%實施例5制備磷脂酶A2和磷脂酶D處理過的PRP與腦膜炎雙球菌B的OMPC的結合以及該結合物的免疫性A、酶促處理將HP20處理的苯酚后粉末(3g)溶于600ml磷酸鹽緩沖液，PH7.1，0.1%脫氧膽酸鹽，33%醚中，其濃度為5mg/mlPRP。加入磷脂酶A(豬的，70μ/mlPRP，比活度600U/mg)和磷脂酶D(暗褐色鏈霉菌，0.2μ/mg PRP，比活度70μ/mg)(兩者都得自Boehringer mannheim，Inc)并將反應在攪拌下，25℃時，進行3小時。用600ml己烷提取反應產物，接著在20℃離心30分鐘。棄去有機相，而將水相濃縮到300ml并對3000ml水進行滲析過濾。樣品稀釋到600ml，使其最終濃度為5mM CaCl2，加入乙醇到40%而沉淀PRP，得到2.6gPRP用作配合。
B、PLA2/PLD處理PRP的衍生物將用PLA2和PLD按上述方法處理過的后-HP20PRP(1.9克)溶于57ml無菌水中。將二水草酸(0.31g)溶于15.5ml無菌水中并慢慢加入溶解的PRP。用40%四正丁基氫氧化銨(5ml)調節PH到PH5，接著加入1%四正丁基氫氧化銨(2ml)，并用草酸溶液滴定使PH到6.98。然后過濾溶液，沖洗濾器，得到178ml PRP-Bu4N的總制劑體積。
在該溶液中加入67ml DMF并在一旋轉式汽化器將體積降到68ml。再加入DMF(67ml)三次，每次使體積到67ml羰基二咪唑(0.22g)溶于DMF并在N2氣氛下慢慢加到PRP溶液中，使之老化35分鐘。將1，4-丁二胺二氯化氫(BuA2)(15.96)溶于456ml無菌水中，加入50%NaOH 5ml，將PH調節到10.39。然后將BuA2慢慢加到PRP-CDZ中并保持在約12℃。
約5分鐘后，加入68%磷酸(50ml)，滴加5ml68%磷酸調節PH到7.02。在這時體積為530ml。
在Amicon超過濾系統，用-10000MW斷流器將樣品濃縮到95ml。然后將樣品對1520ml磷酸鹽緩沖液PH7進行滲析過濾。用3×25ml磷酸鹽緩沖液洗滌超濾系統，將緩沖洗液與PRP-BuA2滯留物合并，將總體積為102ml的硼酸鈉(3.95% 31.8ml)加到PRP-BuA2中。
用2ml25NNaOH調節PH到9.2。然后慢慢加入溴乙酰氯(1.71ml)同時用2.5N NaOH保持PH在9.2。用68%磷酸(0.5ml)調節PH到7.0。在Amicon超過濾系統中將PRP-BuA2-BrAc濃縮到95ml，接著對1520mlPH7的磷酸鹽緩沖液進行滲析過濾，體積通過滲析過濾調節到38ml。用磷酸鹽緩沖液洗滌系統并將洗液合并而得到79.5ml的PRP-BuA2-BrAc。
C、制備OMPC-SH由腦膜炎雙球菌b型得到的OMPC(1.16g)溶于116ml無菌水中，然后對600ml硼酸鹽緩沖液進行滲析過濾，得到終體積為159ml。將EDTA(0.8g)，二硫蘇糖醇(DTT)(0.12g)溶于無菌的硼酸鹽緩沖液中，然后加到溶解的蛋白質中。將N-乙酰基高半胱氨酸硫代內脂(1.03g)溶于無菌水中并加到蛋白、EDTA、DTT混合物中，使之反應22小時。
然后將硫醇化的蛋白濃縮到116ml后，對1440mlPh8的磷酸鹽緩沖液進行滲析過濾，接著濃縮到127ml的終體積。在這時蛋白樣品中含有6.75mg/ml蛋白，而在Ellman樣品中每毫克蛋白有0.3微摩爾SH。
D、衍生的PRP和OMPC-SH的結合用2.5N NaOH調節PRP-BuA2-BrAc溶液的PH到7.9。將在上面B節制備的全部硫醇化的OMPC加到72ml PH調節過的PRP-BuA2-BrAc中，在N2氣氛下進行結合19小時。
結合物濃縮到170ml，接著對1700mlpH7的磷酸鹽緩沖液進行滲析過濾，再對1640mlPH8的磷酸鹽緩沖液進行滲析過濾，產生終體積231ml的結合物。
在結合物上沒有反應的溴乙酰基基團通過加入N-乙酰基半胱胺(0.95g在pH8的磷酸鹽緩沖液中)而封閉，反應進行18小時。然后將封閉的結合物濃縮到170ml，并對2550mlTED緩沖液進行滲析過濾，使結合物老化過夜，對第二個2550mlTED進行滲析過濾，最后回收樣品體積285ml。
在平行實驗中，通過選擇性醇分餾產生的2.31gPRP按上述結合而產生330ml結合物。二個結合物的物理化學性質的平行分析通過顆粒排阻色譜法、熱原、PRP/蛋白、或免疫性分析都是不可區別的。
E、結合物在幼年羅猴中的免疫性酶處理的無脂PRP結合疫苗，按照Vella和Ellis(PediatricRes，29，10(1981))和Vella等人[PediatricsSupplement85，668(1990)]的測試方法在幼年羅猴中試驗，表明是完全產生免疫性的。無脂的結合物表明與通過選擇性醇分餾所制備的PRP制成的對照樣品比較有類似的免疫性。在42小時后在兩種水溶液制劑(15mcg)和氫氧化鋁(1mcg)制劑中(表4和表5)。如表5所示含水酶處理的無脂疫苗對3個動物的GMT(幾何平均滴度)為10.9mcg/ml。
表4“無脂”Hib結合物在幼羅猴中液體氫氧化鋁吸附制劑的免疫性Hib結合物劑量抗-PRP、mcg/ml(GMT)mcg0天28天42天酶處理的無脂PRP1<0.127.4(3/3)79.1(3/3)由選擇性醇分餾得1<0.110.9(3/3)74.0(3/3)的PRP
表5“無脂”Hib結合物和“HP20-處理”的結合物在幼羅猴中的免疫性水性制劑Hib結合物劑量抗-PRPcmg/ml(GMT)mcg0天28天42天酶處理的無脂PRP15<0.10.4(0/3)10.9(3/3)選擇性醇分餾的PRP15<0.10.9(1/3)6.5(2/3)()達到≥1.0mcg抗-PRP/ml(RIA)應答者的數目實施例6由“低切”回收無脂PRP將低切(15g)溶于750ml緩沖液(10mM Tris、5mM CaCl2、4.5mM Triton X-100、PH7.4)。加入磷脂酶(20U Toyo Joso/100mg PRP，按70U/mg，3000單位)。加入甲基-叔丁基醚∶乙醇(9∶1)(750ml)混合物并以240rpm攪拌。使反應在35℃進行2.5小時，再加入2964單位PLD，使反應物在室溫下分相20分鐘。保留水液PRP相。有機相用150ml水提取并將156ml或更低的相加到第一水相中。
950ml水相PRP用以乙酸鈉平衡過的苯酚提取4次，其按苯酚∶水之比＝1∶2.6。
然后將提取PRP的苯酚用450g檸檬酸鹽/DOC(0.5%DOC，3%檸檬酸鹽，5mMTris，PH8.0)預平衡的HP20樹脂在室溫處理2小時。過濾掉細珠而保留水相。將292ml緩沖液洗滌細珠的洗液與大量水相合并，然后進行滲斷析過濾(Pellicon 1英尺2，10000的W斷流膜)。然后將PRP濃縮到1升并以加入乙醇至40%而沉淀。離心收集沉淀，在95%乙醇中研制并在丙酮中干燥。
在本實施例制得的PRP，通過測試過的全部參數，發現類似于選擇性乙醇分餾的PRP。
實施例7流感嗜血桿菌b型的苯酚-失活含有約每毫升109微生物的流感嗜血桿菌培養物，在發酵循環結束時，通過在發酵培養物中加入苯酚至約0.5%(W/V)的最終濃度，在確定苯酚濃度后，將培養物轉移到攪拌的“死”罐，將培養物在37℃接觸苯酚最少1小時。雖然下述的實驗室試驗表明，在有0.5%苯酚時，在7分鐘時間后培養物的失活達到8對數級，生產規模的失活期要延伸到1小時以達到更高的安全水平。
培養物的失活研究(實驗室規模)將流感嗜血桿菌在37℃的振蕩培養器中培養直到穩定態。含有約每毫升109細胞的所得培養物的等分部分在37℃與0.2、0.3、0.4、0.5和0.6%(W/v)的苯酚接觸。在10分鐘的接觸時間內，0.2%和0.3%濃度的苯酚在培養物失活上有較小的效果。但是，在0.4和0.5%苯酚時，得到顯著速率的失活。在0.5%苯酚7分鐘后，在平板試驗中已沒有存活的細胞檢出，表明在有苯酚時靈敏度達到約10CFU/ml極限。在0.4和0.5%苯酚濃度時失活動力學發現是二個階段的。在0.6%苯酚，失活作用是如此之快，在接觸苯酚30秒鐘后已沒有存活的細胞檢測出。
生產規模的失活研究含有每ml約109微生物的反應器，使其苯酚濃度達到約0.5%，并測定CFU/ml作為接觸時間的函數。由于取樣是機械的，只能做到二個測量間隔為1分鐘。對于苯酚的全分布有6分鐘攪拌時間的反應器，觀察到在最先的3分鐘期間有7對數級降低。5分鐘后在平板試驗中沒有存活的細胞檢出，在有苯酚時表現靈敏度達到約10CFU/ml極限。
實施例8除去磷脂酶D改進的PRP方法的目的是有效地由最終PRP粉末中消除PLD。留在PRP的殘余酶量通過下述許多方法進行測定。這些方法包括對最終制劑中酶活性和PLD物直接測定，中間樣品中PLD的分析，在流程每一步的PLD回收峰研究。此外，進行了試驗以提高用于免疫測試的PLD的抗體。每一個這種方法描述于下。
在終PRP粉末中PLD的直接測定通過SDS-PAGE用Coomassie染色法(用銀PLD制劑不能很好染色)直接測定最終PRP粉末中的PLD，表明PLD的殘留量低于檢測限度(＜250ngPLD/道)。在凝膠上裝載到最大，殘留的PLD量相當于＜5ng/mgPRP或＜0.0005%。該檢出限度是相當于＜1ng/劑。
對最終PRP粉末也測定了殘留PLD的酶促活性，沒有檢測出活性。酶促分析的檢測限度是6ng PLD/ml(6×10-4uPLD/ml)，相當于＜64pg活性PLD/mg PRP。也進行了其它研究，表明PLD與苯酚接觸就使酶失活。
在中間樣品中直接分析PLD通過SDS-PAGE用Coomassie染色法對中間生產的樣品直接分析其殘留的PLD，在第一次苯酚提取后，在PRP中的PLD量是低于檢測限度，相當于PLD量＜5ngPLD/mgPRP。通過直接測定表明第一次苯酚提取降低PLD量幾乎約3對數級(從反應混合物的～2.4mcgPLD/mgPRP到第一次苯酚提取中的少于5ngPLD/mgPRP)。通過另外三次苯酚提取，HP20處理和醇沉淀的進一步處理提供了PLD的再清除，對直接測定來說其含量太低。
PLD強化和回收研究由于在中間樣品中殘留PLD含量太低，不能直接測量，在實驗室進行了PLD強化回收的延伸系列的研究，以檢測每一分離步驟中可以除去的PLD量，三個不同分離步驟在除酶方面其效果類似。
首先，研究了苯酚提取對PLD去除的效果。將20mgPRP/ml中8mg/mlPLD的濃溶液進行4次苯酚提取，每一個水相都通過SDS-PAGE監測PLD。在一次苯酚提取后，通過SDS-PAGE用Coomassie染色分析法PLD含量低于250ngPLD/道的檢出限度，這說明了下降800倍或3個對數級的清除。在另一實驗中，一批PLD是用螢光素-5-異硫代氰酸鹽(FITC)螢光標記。使用FITC-標記的PLD，將酶的分配系數，作為其在苯酚中的濃度函數，用螢光分光光度計測量。這技術對PLD檢測量的靈敏度增加10倍。這方法再一次證實，單次苯酚萃取是有效地降低酶含量至少二個對數級。
為測定HP20處理在PLD除去上的效果，測量了5mgPRP/ml中PLD的吸附等溫線。等溫線的陡峭斜率說明了樹脂對PLD有強的親和力，說明在HP20處理的特定條件下，至少有2個對數級清除PLD。在四個苯酚提取后的這一步的殘余酶量，已經非常低，但這些數據表明，通過HP20樹脂的選擇吸附，任何殘余酶量都可進一步去除。
最后，在小規模的強化實驗中，在醇沉淀時90%酶留在上清液。因此，最后一步提供了另外10倍清除的能力。
這些研究證實了大量酶(＞99.99%)在通過4次苯酚提取中已除去。因為在有PRP存在時，在水和苯酚相之間酶的分配系數經測定是102，四次苯酚提取，在理論上可提供108倍的去除;但是，103倍的清除的估計對這步驟是保守的確定。基于等溫線測量，對HP20吸附估計有102倍的清除。對醇分餾提供10倍的PLD降低。對改進PRP方法來說選定酶的總去除的保守估計為106倍，理論上真正的清除可高達1011倍。
下面表中綜合了由這些清除研究的發現。最后一欄提供了對每個測定方法殘余PLD/劑的計算。注意，全部計算都基于下面的前提，即300mcgPRP進入結合反應而得到15mcg劑量。這對測定每劑殘余酶量的估計提供了一保守的方法。
基于幾種測定方法的酶清除量的測量測定方法酶PLD/劑清除疫苗(NG)PLD不除去 0 103對直接測量的LOD*3對數級 <1測定去除量,保守的 6對數級 <10-3理論計算的去除量 11對數級 <10-8
＊檢測限度實施例9改進方法和醇分餾法的PRP比較分析由改進方法制備的全部各批PRP都進行了大量分析測試以測定其化學和物理性質，與選擇性醇分餾法制備的PRP制劑是可以比較的。這些分析結果描述于下A、NMR分析由改進PRP方法制備的三次制造一致的批量PRP和由選擇性醇分餾方法制備的一代表批量，它們的質子-NMR分析表明，這些樣品基本上是相當的。這些樣品的光譜表明應由δH＝3.72到5.2區內有同樣的譜線。
B、碳水組成分析在PRP制劑中測定組成糖的一致性和相對量，確定了PRP樣品的組成的完整性。這是通過PRP樣品的酸水解及以后通過用脈沖安培檢測高PH陰離子交換色譜法定量碳水組成(核糖醇和核糖)而完成的。分析了三個改良方法PRP的示范批量和二個代表性的選擇性醇分餾方法PRP批量。這些樣品的比較分析基于核糖醇對核糖的峰面積比，表明五批都基本相同。另外在全部5個制劑中比較了痕量組成的峰。這些組成的量相對于核糖醇或核糖都小于1摩爾%。
C、脂肪酸分析進行了選擇性醇分餾生產的PRP和改進方法PRP產品的比較脂肪酸分析。通過毛細管氣體色譜分析法分析脂肪酸甲基酯，以前的生產方法PRP樣品含有不同小量的脂肪酸，而改進方法PRP樣品含有≤0.002%(w/w)脂肪酸。
D、分子粒度的分析Sepharose4B分析PRP制劑的分子大小通常是通過用折射率檢測的Sepharose4B柱色譜方法來測定，它提供了PRP制劑的相對分子大小的量度，以相對流出體積(Kd)表示。代表性樣品的Kd示于下面。基于這些分析，在5個PRP制劑中分子大小沒有明顯區別。
基于Sepharose4B分析測量分子大小樣品Kd改進PRP:
樣品10.46樣品20.48樣品30.45選擇性醇分餾PRP:
樣品10.46樣品20.51HPSEC-通用校準分析除了Sepharose4B分析外，通過高效粒度排阻色譜，使用線上特定粘度和折射率檢測測定了每個上面PRP制劑的分子大小和多分散性。這分析是在乙酸銨的移動相中使用了一個TSKG4000PWXL柱對每一個PRP制劑計算相對分子量(Mp)和多分散性指數(PI)。由分析三個改進方法PRP的示范批量和二個選擇性醇分餾方法PRP的代表批量所得的色譜綜合于下。由總數29個選擇性醇分餾生產PRP批量的分析得到平均結果也示于表中。
通過改進和選擇性醇分餾制備的PRP的相對分子量(Mp)和多分散性的測定樣品MpPI改進的PRP樣品12020001.80樣品21830001.65樣品32130001.56三批的平均值199,000±150001.67±0.12選擇性醇分餾的PRP樣品11650001.54樣品21480001.4229批的平均值150000±210001.39±0.12這些分析的結果提出了合理的證據，由改進方法制備的PRP制劑比由選擇性醇分餾方法制備的PRP制劑是略大些并更多分散性。
除了上述分析，相當于每個上面改進方法PRP制劑的衍生PRP以及衍生的選擇性醇分餾方法PRP的代表性樣品也都分析了分子大小。衍生的PRP制劑(溴乙酰基丁二胺形式)的分子大小和多分散性是通過Sepharose4B色譜分析和通過HPSEC-通用校準進行測定的。其分析結果示下下面。
改進-和選擇性醇分餾方法衍生的PRP的分子大小和多分散性的測量樣品KdMpPI衍生的改進PRP樣品a0.641050001.37樣品b0.611230001.48樣品c0.601270001.42平均值0.62118000±120001.43±0.06衍生的選擇性醇分餾PRP樣品a0.651040001.32樣品b0.591120001.29樣品c0.601190001.33平均值0.61112000±80001.31±0.02這些結果表明，PRP的大小在衍生作用時是降低的，而且衍生的改進方法PRP和衍生的選擇性醇分餾方法PRP所得的分子大小是基本相當的。
E、相對抗原性分析PRP抗原含量一般是用速度濁度計分析法測定。給定樣品的抗原濃度與多糖濃度比較得到樣品相對抗原性的量度。對改進方法PRP的三個示范批量和對二個代表性選擇醇分餾方法PRP批量的這種分析結果都列于下面。對這五個樣品，相對抗原性在實驗誤差內是相當的。
改進的-和選擇性醇分餾方法PRP的相對抗原性比較樣品相對抗原性(%)改進方法PRP樣品193樣品295樣品3101選擇性醇分餾PRP樣品196樣品2105實施例10動物免疫性測試結果A、在幼羅猴中的免疫性幼羅猴已作用臨床前的免疫性模型，它與流感嗜血桿菌結合物疫苗在幼兒中的免疫性有關。嗜血桿菌b結合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白結合物)已在這一類中廣泛測試并發現具有高的免疫產生力(Vella等人，Pediatrics，85，668，1990;VellaandEllis，PediatricResearch29，10，1991)。每年只能得到少量猴子來試用，這樣對每種疫苗測試使用了3-6猴/組。是一種遠系繁殖，我們發現，通過單個幼猴，在應答嗜血桿菌b結合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白配合物)中抗-PRP量的變化高達約100倍。類似于在單個幼兒免疫應答中的變化程度。由于這些組規模(groupsize)和遠系繁殖的理由，幼羅猴對這些疫苗的免疫性是定性的模型而不是定量的模型。我們認為正應答是在＞1mcg抗-PRP/ml的2倍劑量后，一個劑量不能用PRP、PRP-D或HbOC疫苗達到。我們用嗜血桿菌b配合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白配合物)一致地達到這劑量。
幼羅猴對由改進PRP方法的PRP制備的嗜血桿菌b配合疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白配合物)的抗-PRP應答可與原來研究和制備的穩定批量以及與由選擇性醇分餾方法制備的生產批量進行比較。試驗中包括的是一種用按改進方法在實驗室制的PRP由研究制備的結合物，以及四個由三批改進PRP制成的結合物批量。總之，全部24個猴已用由改進PRP方法的PRP制備的嗜血桿菌b配合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白配合物)進行免疫，全部24猴達到＞1mcg抗-PRP/ml的2劑量后。這些數據表明，在這產生免疫性的定性模型中，用由改進方法和由選擇性醇分餾方法的PRP制備的嗜血桿菌b結合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白結合物)的免疫當量。
B、鼠的產生免疫性的數據用由改進方法的PRP制備的嗜血桿菌b結合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白結合物)的效力測試也在BALB/C鼠中進行。是一種遺傳的近親繁殖的品種。并可基本上無限制地取得，在這些鼠的效力試驗是對這疫苗的免疫性的定量模型。在這模型中，將5倍稀釋的系列疫苗注入每組8只鼠，對每一疫苗批量共40只鼠。對每群40只鼠計算了使50%鼠(ED50)血清轉化為抗-PRP血清陽性的有效劑量(ED50越低，效力愈高)。用改進PRP方法的PRP制備的4個不同批量的嗜血桿菌b結合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白結合物)的ED50值與已表明在幼兒中有免疫性的嗜血桿菌b結合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白結合物)的參考對照是在同一范圍內。這些數據表明在定量模型中在免疫性上是可比較的。
實施例11用于改進PRP方法的流感嗜血桿菌發醇批量的培養純度、流感嗜血桿菌的失活以及PRP抗原含量的測試結果全部都是滿意的。
用改進方法制備的三批PRP是以后用于制備嗜血桿菌b結合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白結合物)。將衍生的流感嗜血桿菌b多糖批量進行完全控制測試，而且全部測試結果表明，由改進方法PRP的這些材料與由選擇性醇分餾方法的同樣材料是不可區分的。
最后容器材料的測試材料確定，由改進方法的PRP制備的嗜血桿菌b結合物疫苗(腦膜炎雙球菌蛋白結合物)與由醇分餾PRP所制備的產品是具有同樣質量的。
權利要求
1.一種由粗制或純化的包括由細菌衍生的無脂或有脂兩者的莢膜多糖的制劑中制備無脂和無內毒素的莢膜多糖而基本上不損失莢膜多糖的方法，該方法包括由脂莢膜多糖分裂脂，除去無脂和內毒素的污染并回收無脂莢膜多糖，而基本上將全部脂莢膜多糖轉化成多脂莢膜多糖。
2.權利要求1的方法，其中脂是通過磷脂酶而從脂莢膜多糖中離解。
3.權利要求2的方法，其中莢膜多糖是由流感嗜血桿菌b型，腦膜炎雙球菌(腦膜炎球菌)群A、B、C、X、Y、W135或29E或大腸桿菌K1、K12、K13、K89、K92或K100的培養物中衍生的。
4.權利要求3的方法，其中莢膜多糖是包括由流感嗜血桿菌b型培養物衍生的PRP和脂-PRP。
5.權利要求4的方法，包括在有作為酶活化劑的含醚有機相存在下，用單獨的磷脂酶D或磷脂酶D與磷酯酶A2或磷酯酶B組合物處理包括PRP和脂肪-PRP的混合物。
6.權利要求5的方法，其中有機相包括選自乙醚，丁醚、甲基叔丁醚的第一組成醚，和選自甲醇、乙醇或己烷的第二組成的混合物，其中所述第一組成和所述第二組成存在的比例為約20∶1和5∶1之間。
7.權利要求6的方法，其中磷脂酶是由非哺乳動物有機體中衍生的。
8.權利要求7的方法，其中包括用單獨磷脂酶D處理含有PRP和脂肪-PRP的混合物。
9.權利要求8的方法，它包括將含有PRP和脂肪-PRP的混合物與按重量計約0.01和10%之間的磷脂酶D進行反應。
10.一種制備無脂和無內毒素的多核糖基核糖醇磷酸鹽(PRP)而基本不損失PRP的方法，它包括將以由流感嗜血桿菌b型培養物得到的粗制或純化的多糖制劑存在的脂肪-PRP按0.3%(重量)磷脂酶D對PRP的比例與磷脂酶D反應，在反應混合物中含有濃度為反應體積的30%-60%之間的醚有機溶劑混合物，其中有機物是一種選自二乙醚、丁醚或甲基叔丁基醚的醚與一種選自己烷、乙醇或甲醇的第二有機物相混，反應是在有選自脫氧膽酸鹽或Triton X-100的去污劑存在下，其濃度為約0.1%～0.4%之間，并加入約0.1～10mMCaCl2，在適宜上述試劑的緩沖溶液中，PH值在約7.0～8.0之間溫度在約20℃～45℃之間，進行約30分鐘～約4小時之間。
11.權利要求10的方法，其中的醚∶有機溶劑混合物是甲基叔丁基醚∶乙醇的混合物，其比例為約9∶1，混合物的濃度是反應體積的約50%。
12.權利要求11的方法，它還包括PRP的苯酚提取以除去包括所加入的磷脂酶D的蛋白的污染，并在磷脂酶D處理前或處理后，將PRP通過一不吸附PRP或脂肪-PRP的憎水吸附步驟以除去脂和內毒素。
13.一種制備無脂PRP而基本上不損失PRP的方法，它包括的步驟有a)在合適的培養基中培養流感嗜血桿菌b型;b)用乙基汞硫代水楊酸鈉或苯酚殺死流感嗜血桿菌b型;c)澄清殺死流感嗜血桿菌b型的培養基;d)濃縮澄清的培養基到得到可加工的體積;e)通過加入乙醇使最終濃度為約48%乙醇而沉淀在培養基中的污染物以得到含PRP的上清液和要棄去的污染物沉淀;f)通過加入乙醇使最終濃度為約61%而沉淀PRP以得到粗制PRP沉淀;g)在PRP沉淀中加入水以溶解，接著加入氯化鈣使最終濃度為1.0M;h)加入乙醇使最終濃度為23%，以得到污染物的不溶沉淀和含PRP的上清液;i)加入乙醇使最終濃度為37%以沉淀PRP;j)用無水乙醇研制PRP沉淀并干燥而得到一種PRP苯酚前粉末;k)苯酚提取一種PRP粉末的溶解制劑;l)通過加入CaCl2至0.05M和乙醇至約67%而沉淀PRP，在無水乙醇中研制以得到苯酚后粉末。m)通過增水吸附，由苯酚后粉末的溶解制劑中除去內毒素;n)將在粗制PRP、苯酚前粉末或苯酚后粉末中的PRP，在進行以后步驟之前與磷脂酶反應。
14.權利要求13的方法，其中磷脂酶是磷脂酶D，它的加入量為PRP的約0.3%(重量)，而粗制PRP，苯酚前粉末或苯酚后粉末是溶于10mM Tris、5mM CaCl2、45%甲基叔丁醚、5%乙醇、0.3% Triton X-100，并在約35℃反應30分鐘到約4小時。
全文摘要
一種將含脂細菌莢膜多糖，如脂肪多核糖基核糖醇磷酸鹽、脂肪-PRP，轉化為無脂，無內毒素的多糖，如多核糖基核糖醇磷酸鹽PRP的方法，通過將由細菌，如流感嗜血桿菌b型的培養基中得到的含多糖粉末溶解，由多糖中離解共價結合的脂肪酸并除去脂類和內毒素。
文檔編號C08B37/00GK1071699SQ9211046
公開日1993年5月5日 申請日期1992年8月15日 優先權日1991年8月16日
發明者A·L·李, W·E·曼杰, M·S·林斯特拉, R·D·西特林 申請人:麥克公司