一種細菌多糖修飾的重組融合蛋白的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種多糖修飾蛋白的制備方法及其應用；特別設及一種細菌多糖修飾 的重組融合蛋白的制備方法及其應用，屬于生物醫藥領域。
【背景技術】
[0002] 病原菌的0多糖（OP巧、芙膜多糖（CP巧等往往是其重要的保護性抗原，如大腸桿 菌的0157型0PS，霍亂弧菌的Ol型、0139型0PS，肺炎鏈球菌的4型、6B型、9V型、14型、 18C型、19F型、23F型CPS等，金黃色葡萄球菌的CP5型和CP8型CPS，等等。許多針對多糖 的抗體為病原菌的中和抗體，因此多糖疫苗的研發一直是細菌疫苗研發的重點之一。
[0003] 肺炎多糖疫苗、腦膜炎多糖疫苗、流感嗜血桿菌多糖疫苗、傷寒Vi多糖疫苗等一 批多糖疫苗已經上市多年。但多糖疫苗的免疫記憶和免疫原性較弱，特別是在2歲W下兒 童和老年人體內尤為突出。現在運類疫苗的研發重點已轉向多糖-蛋白結合疫苗，其中7 價肺炎多糖-蛋白結合疫苗、4價腦膜炎結合疫苗、b型流感嗜血桿菌結合疫苗已經上市， 一批多糖-蛋白結合疫苗正處于不同的研發階段。但是，多糖-蛋白結合疫苗采用化學法 制備，包括W下步驟：①大規模培養病原菌（或其疫苗株），從中提取多糖；②制備并提純白 喉、破傷風等毒素蛋白，滅活后作為載體蛋白；③通過化學方法交聯多糖和載體蛋白；④再 次純化交聯的多糖-蛋白結合物制備疫苗。該過程存在W下問題：①大規模培養病原菌弱 毒的疫苗株提取多糖存在一定安全風險，有時需要負壓廠房，而對烈性病原體，往往只有在 獲得病原菌的減毒株后，才能通過大規模培養提取多糖；②通過化學方法提取的多糖為混 合物，純度較低，質控困難，易引起副反應；③多糖與載體蛋白交聯為隨機過程，產物均一性 差，純化和質量控制困難；④生產過程步驟多，得率低，成本高。
[0004] 近些年來，隨著測序技術和生物信息學的發展，在多種細菌中發現了天然的蛋白 質糖基化修飾系統，如空腸彎曲弧菌的N-糖基化修飾系統、奈瑟球菌和綠脈桿菌的0-糖基 化修飾系統，運些糖基化修飾系統中，多糖的合成途徑與細菌的脂多糖和芙膜多糖的合成 途徑十分相似，多糖結構取決于糖基合成基因簇，而其寡糖轉移酶對其轉移的多糖專一性 較低。其中空腸彎曲弧菌N-糖基化修飾系統中的寡糖轉移酶PglB對多糖底物的要求為多 糖還原末端第一位糖基的C2位必須有乙酷氨基，且第二位糖基不能W 0 (1-4)糖巧鍵與其 連接。而腦膜炎奈瑟球菌0-糖基化修飾系統中的寡糖轉移酶PglL對多糖底物無類似的要 求，PglL能將還原末端第一位糖基C2位無乙酷氨基的多糖轉移至蛋白的糖基化位點上，因 此具有更廣泛的應用前景。但目前關于PglL對蛋白底物特異性的研究較少，目前其已知的 底物僅為奈瑟球菌菌毛蛋白PilE,運限制了其用于多糖修飾蛋白疫苗的制備。

【發明內容】
陽0化]本發明的目的是提供一種細菌多糖修飾的重組融合蛋白的制備方法及其應用。
[0006] 本發明提供一種細菌多糖修飾的重組融合蛋白的制備方法，是將重組融合蛋白和 腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL在0-抗原連接酶基因缺陷的細菌中共表達，腦膜炎奈 瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL將細菌自身的多糖或外源多糖連接到重組融合蛋白上，得到細 菌多糖修飾的重組融合蛋白；
[0007] 所述重組融合蛋白含有N端信號膚、具有腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的 糖基化位點的膚段和載體蛋白序列；
[0008] 所述載體蛋白為細菌毒素蛋白的無毒突變體或細菌毒素蛋白的部分片段；
[0009] 所述具有腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的糖基化位點的膚段位于所述載體 蛋白序列的N端或C端；
[0010] 所述腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的氨基酸序列如SEQ ID No. 26所示，或 其具有類似功能的突變體；
[0011] 所述細菌多糖修飾的重組融合蛋白為細菌自身的多糖修飾的重組融合蛋白或外 源多糖修飾的重組融合蛋白； 陽01引所述0-抗原連接酶基因缺陷使得0抗原多糖不能連接到類脂A-核屯屬糖上，從 而不能形成脂多糖。
[0013] 上述方法中，所述信號膚可 W是化 1B、DsbA、ST II、OmpA、I%oA、LamB、SpA、Enx 等 信號膚，本發明采用的是化bA信號膚，其氨基酸序列如SEQ ID No. 32中自N端起第I位至 第19位所示；
[0014] 所述腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的糖基化位點為腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋 白Pi化的自N端起第63位的絲氨酸；
[0015] 所述具有腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的糖基化位點的膚段為含有腦膜炎 奈瑟球菌菌毛蛋白Pi化的自N端起第63位絲氨酸的腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白Pi化的膚 段，具體為至少含有腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白Pi化的自N端起第55至第66位氨基酸的任 意膚段，更具體為如下任一所示：
[0016] (1) SEQ ID No. 32中自N端起第128位至第156位氨基酸所示的膚段或其串聯重 復序列；
[0017] (2)SEQ ID No. 34中自N端起第128位至第154位氨基酸所示的膚段或其串聯重 復序列；
[0018] (3) SEQ ID No. 36中自N端起第128位至第152位氨基酸所示的膚段或其串聯重 復序列；
[0019] (4) SEQ ID No. 38中自N端起第128位至第150位氨基酸所示的膚段或其串聯重 復序列；
[0020] (5) SEQ ID No. 40中自N端起第128位至第149位氨基酸所示的膚段或其串聯重 復序列；
[0021] (6)SEQ ID No. 48中自N端起第22位至第40位氨基酸所示的膚段或其串聯重復 序列；
[0022] (7) SEQ ID No. 50中自N端起第22位至第36位氨基酸所示的膚段或其串聯重復 序列；
[0023] (8) SEQ ID No. 52中自N端起第22位至第33位氨基酸所示的膚段或其串聯重復 序列。
[0024] 上述任一所述的方法中，所述細菌毒素蛋白的無毒突變體為綠脈桿菌外毒素蛋白 A無毒突變體；
[00巧]所述細菌毒素蛋白的部分片段為霍亂毒素B亞單位或破傷風毒素C蛋白； 陽0%] 所述綠脈桿菌外毒素 A無毒突變體的氨基酸序列如SEQ ID No. 46中自N端起第 20位至第631位所示；
[0027] 所述霍亂毒素 B亞單位的氨基酸序列如SEQ ID No. 32中自N端起第20位至第 122位所示；
[0028] 所述破傷風毒素 C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 60中自N端起第20位至第 455位所示。
[0029] 上述任一所述的方法中，所述重組融合蛋白的氨基酸序列為如下任一所示：
[0030] (1)沈Q ID No. 32所示的氨基酸序列；
[0031] (2)沈Q ID No. 34所示的氨基酸序列；
[0032] (3)沈Q ID No. 36所示的氨基酸序列；
[0033] (4)沈Q ID No. 38所示的氨基酸序列；
[0034] (5)沈Q ID No. 40所示的氨基酸序列；
[0035] (6)沈Q ID No. 46所示的氨基酸序列；
[0036] (7)沈Q ID No. 48所示的氨基酸序列；
[0037] (8)沈Q ID No. 50所示的氨基酸序列；
[0038] (9)沈Q ID No. 52所示的氨基酸序列；
[0039] (10)沈Q ID No. 56所示的氨基酸序列； W40] (11)沈Q ID No. 58所示的氨基酸序列；
[0041] (12)沈Q ID No. 60所示的氨基酸序列。
[0042] 上述任一所述的方法中，所述重組融合蛋白是通過重組表達載體導入所述細菌中 的，所述重組表達載體是將所述重組融合蛋白的編碼基因插入PMMB66邸的多克隆位點間 得到的；
[0043] 所述重組融合蛋白的編碼基因如下：
[0044] (1)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 32所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 31 所示；
[0045] (2)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 34所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 33 所示；
[0046] (3)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 36所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 35 所示；
[0047] (4)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 38所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 37 所示；
[0048] (5)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 40所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 39 所示；
[0049] (6)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 46所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 45 所示；
[0050] (7)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 48所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 47 所示；
[0051] (8)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 50所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 49 所示；
[0052] (9)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 52所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 51 所示；
[0053] (10)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 56所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 55 所示；
[0054] (11)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 58所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 57 所示； 陽化5] (12)所述重組融合蛋白為SEQ ID No. 60所示的氨基酸序列時，其編碼基因如SEQ ID No. 59 所示；
[0056] 所述多克隆位點為EcoR I和化nd III位點；
[0057] 所述腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL是通過重組表達載體導入所述細菌 中的，所述重組表達載體是將所述腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的表達盒插入 pET28a(+)的多克隆位點間得到的；
[0058] 所述腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的表達盒如SEQ ID No. 30所示；
[0059] 所述多克隆位點為Bgl II位點。
[0060] 上述任一所述的方法中，所述外源多糖是通過含有多糖合成基因簇的重組表達載 體導入所述細菌的；
[0061] 所述多糖合成基因簇如SEQ ID No. 79所示；
[0062] 所述含有多糖合成基因簇的重組表達載體按照如下方法制備：Asc I與Not I雙 酶切沈Q ID No. 79所示的DNA分子，得到基因片段；Asc I與Not I雙酶切沈Q ID No. 82 所示的DNA分子，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，即得。
[0063] 上述任一所述的方法中，所述0-抗原連接酶基因缺陷的細菌為0-抗原連接酶基 因缺陷的福氏志賀氏菌、0-抗原連接酶基因缺陷的甲型副傷寒沙口氏菌或0-抗原連接酶 基因缺陷的大腸桿菌；
[0064] 所述0-抗原連接酶基因缺陷的大腸桿菌具體為大腸桿菌K12系列菌株； 陽0化]上述任一所述的方法中，所述細菌為福氏志賀氏菌時，所述將重組融合蛋白和腦 膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL在0-抗原連接酶基因缺陷的細菌中共表達的方法為將 含有所述重組融合蛋白的表達載體和所述腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的表達載體 導入0-抗原連接酶基因缺陷的福氏志賀氏菌中進行誘導表達；
[0066] 所述福氏志賀氏菌為毒力大質粒缺失的福氏志賀氏菌；
[0067] 所述毒力大質粒缺失的的福氏志賀氏菌的制備方法具體為：將地Dinc導入所述 福氏志賀氏菌中，利用不相容原理進行所述毒力大質粒的缺失，再利用地Dinc的溫度敏感 特性將pKDinc去除； W側所述0-抗原連接酶基因為waal基因；
[0069] 所述細菌多糖修飾的重組融合蛋白為腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL將福氏 志賀氏菌自身的0-多糖連接到重組融合蛋白上，得到細菌多糖修飾的重組融合蛋白。
[0070] 上述任一所述的方法中，所述細菌為甲型副傷寒沙口氏菌時，所述將重組融合蛋 白和腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL在0-抗原連接酶基因缺陷的細菌中共表達的方 法為將含有所述重組融合蛋白的表達載體和所述腦膜炎奈瑟球菌O-寡糖轉移酶PglL的表 達載體導入0-抗原連接酶基因缺陷的甲型副傷寒沙口氏菌中進行誘導表達； W71] 所述0-抗原連接酶基因為WaaL基因；
[0072] 所述細菌多糖修飾的重組融合蛋白為腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL將甲型 副傷寒沙口氏菌自身的0-多糖連接到重組融合蛋白上，得到細菌多糖修飾的重組融合蛋 白。
[0073] 上述任一所述的方法中，所述細菌為大腸桿菌K12系列菌株時，所述將重組融合 蛋白和腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL在0-抗原連接酶基因缺陷的細菌中共表達的 方法為將含有所述重組融合蛋白的表達載體、所述腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL的 表達載體、含有多糖合成基因簇片段的表達載體導入0-抗原連接酶基因缺陷的大腸桿菌 K12系列菌株中進行誘導表達； W74] 所述0-抗原連接酶基因為WaaL基因；
[00巧]所述大腸桿菌K12系列菌株0抗原合成途徑中的關鍵糖基轉移酶鼠李糖轉移酶基 因Wb化天然插入失活，不能合成自身0抗原；
[0076] 所述細菌多糖修飾的重組融合蛋白為腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL將外源 多糖連接到重組融合蛋白上，得到細菌多糖修飾的重組融合蛋白；
[0077] 所述外源多糖是通過將含有多糖合成基因簇片段的表達載體導入所述大腸桿菌 K12系列菌株進行表達得到的；
[0078] 所述多糖合成基因簇如SEQ ID No. 79所示；
[0079] 所述含有多糖合成基因簇片段的表達載體按照如下方法制備：Asc I與Not I雙 酶切沈Q ID No. 79所示的DNA分子，得到基因片段；Asc I與Not I雙酶切沈Q ID No. 82 所示的DNA分子，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，即得。
[0080] 上述任一所述的方法中，所述表達之后還有細菌裂解、離屯、收集上清、除鹽和/或 分離純化的步驟；
[0081] 所述分離純化為離子交換層析和/或分子篩層析。
[0082] 由上述任一所述的方法制備得到的細菌多糖修飾的重組融合蛋白也屬于本發明 的保護范圍；
[0083] 或，
[0084] 一種由上述任一所述的方法制備得到的細菌多糖修飾的重組融合蛋白制備的疫 苗也屬于本發明的保護范圍；
[00化]所述疫苗能引起動物體內產生抗0抗原多糖的特異性抗體；
[0086] 所述疫苗具體含有氨氧化侶佐劑。
[0087] 上述任一所述的方法制備得到的細菌多糖修飾的重組融合蛋白在制備能引起動 物體內產生抗0抗原多糖的的特異性抗體的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍； W蝴或，
[0089] 上述任一所述的方法制備得到的細菌多糖修飾的重組融合蛋白在制備預防和或 治療細菌引起的疾病的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍；
[0090] 所述產品具體為疫苗；
[0091] 所述細菌具體為福氏志賀氏菌、甲型副傷寒沙口氏菌或大腸桿菌；
[0092] 所述疫苗具體含有氨氧化侶佐劑。
[0093] 本發明在0-抗原連接酶基因缺陷的宿主菌中，共表達腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉 移酶PglL基因、重組融合蛋白基因，或在0-抗原連接酶基因和0抗原合成基因雙缺陷的宿 主菌中，共表達腦膜炎奈瑟球菌0-寡糖轉移酶PglL基因、重組融合蛋白基因和外源細菌多 糖合成基因簇，獲得了細菌多糖修飾的重組融合蛋白。
[0094] 與現有的化學交聯制備多糖蛋白相比，采用本發明的方法制備的細菌多糖修飾的 重組融合蛋白具有多糖結合位點均一、質量易控等優點，并且通過工程菌培養直接制備得 到細菌多糖修飾的重組融合蛋白，不需要多糖制備、載體蛋白制備、化學交聯等多個步驟， 具有生產高效，成本低、生物安全性好等優點。采用本發明的方法制備的細菌多糖修飾的重 組融合蛋白免疫小鼠，可獲得抗細菌多糖的特異性抗體，將運種細菌多糖修飾的重組融合 蛋白用于細菌多糖蛋白結合疫苗的制備，可W避免病原菌培養的諸多問題，提高疫苗的均 一性W及生產效率，降低疫苗制備的成本。
[0095] 本發明對多糖修飾蛋白疫苗的制備具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0096] 圖 1 為 S. flexneri 2a 301 A pCP 的 PCR 鑒定。
[0097] 圖 2 為 S. f Iexneri 2a 301 A pCP A waal 的 PCR 鑒定。
[0098] 圖3為S. fIexneri 2a 301 ApCPAwaaI的脂多糖合成缺陷銀染驗證。
[0099] 圖4為腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白Pi化的S級結構。
[0100] 圖5為重組CTB融合蛋白糖基化情況的WB檢測。
[0101] 圖6為重組EPA融合蛋白糖基化情況的WB檢測。 陽10引 圖7為糖蛋白rCTB4573-0PSsf3Di純化結果的SDS-PAGE和WB檢測。 陽10引圖8為糖蛋白巧PA4573-0PSsf3Di純化結果的SDS-PAGE和WB檢測。 陽104] 圖9為糖蛋白的免疫原性評價。
[01化]圖10為多糖基化位點的重組融合蛋白糖基化修飾的WB檢測。
[0106] 圖11為糖蛋白rTTC4573-〇PSsf3〇i的肥檢測。
[0107] 圖 12 為 S. paratyphi CMCC50973 A WaaL 的 PCR 鑒定。 陽1〇8] 圖13為S. paratyphi CMCC50973 AwaaL的脂多糖合成缺陷銀染驗證。 陽109] 圖14為糖蛋白巧PA4573-0PSspty日。973的WB檢測。
[0110]圖 IS 為糖蛋白 rCTB4573-OPSspty5〇973的肥檢測。 陽1 川 圖 16 為 E. COli W3110 AwaaL 的 PCR 鑒定。
[0112] 圖 17 為糖蛋白 rCTB4573-〇PSEc〇i日7的 WB 檢測。
【具體實施方式】
[0113] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0114] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0115] P邸inc 重組質粒在文獻"Global Analysis of a Plasmid-Qirred Siigella flexneri Strain:New Instghts into