寇氏隱甲藻胞外多糖的制備方法以及該胞外多糖的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵，特別是指一種寇氏隱甲藻胞外多糖的制備方法W及該胞 外多糖的應用。
【背景技術】
[0002] 寇氏隱甲藻（化ypthecodiniumcohnii)屬于等鞭甲藻，經常寄宿于水生大型藻類 和衰弱的海藻中，廣泛分布于紅樹林、海洋等等區域。雖然不同區域分離的寇氏隱甲藻基因 有所差別，但均具有良好的產二十二碳六締酸值HA)能力。寇氏隱甲藻（化ypthecodinium cohnii)是最早用于工業化發酵生產DHA的來源藻種，具有生產周期短、易于大規模培養、 不飽和脂肪酸組成單一、外源污染易控制和不受原料來源限制等優點，已被列入我國的新 資源食品目錄。目前微藻DHA的年產量近5000噸，發酵生產過程中所產生的廢液超過10 萬噸，尚未開發利用。申請人發現隱甲藻在發酵過程中能產生大量的胞外多糖，截止目前， 隱甲藻胞外多糖的純化制備技術和作為抗氧化物質的應用均無研究提及。
[0003] 海洋微藻多糖具有廣泛的生物活性。目前研究應用較深入的藻類多糖主要集中在 大型海藻多糖，如海藻膠、褐藻多糖硫酸醋、海帶多糖、紫菜多糖等。海洋微藻相比于大型藻 具有生長速度快、光合效率高、適應性強、生長條件易于控制、遺傳性狀易于改良等特點，因 此，海洋微藻多糖具有更巨大的應用潛力。研究較多的主要有螺旋藻多糖、小球藻多糖、鹽 藻多糖、紫球藻多糖、扁藻多糖等，均證明具有抗氧化、提高免疫力、抗炎等生物活性，而寇 氏隱甲藻多糖相關的活性（包括抗氧化性）目前仍無研究提及。
[0004] 2003年起實施的《保健食品檢驗與評審技術規范》中規定抗氧化是保健食品的申 報功能之一，抗氧化物質的主要目的是澤滅人體中過多的自由基。人體在代謝過程中都會 產生大量的自由基。自由基具有至少一個未成對電子，性質活潑，具有強的氧化性。人體中 過量的自由基是人類健康巨大的潛在威脅。人體通常通過抗氧化酶和自身產生的抗氧化物 質清除體內自由基。而當機體處于衰老或環境壓力等條件下，體內自由基水平急劇增高，人 體自身清除能力不足時將導致一系列疾病，如衰老、腫瘤、屯、血管疾病、阿茲海默癥等神經 退行性疾病等。因此，外源抗氧化物質的攝入對體內自由基的有效清除非常重要。
[0005] 自由基種類非常多，對人體健康影響最大的自由基主要為超氧自由基、徑基自由 基和氧自由基及其引起的自由基鏈式反應產生的脂自由基等其他自由基。海洋微藻經常暴 露在具有氧化壓力和多種自由基的環境中，因此其自身會積累大量的抗氧化物質保護它們 免受自由基損傷。申請人通過檢索，未發現隱甲藻胞外多糖應用于抗氧化方面的研究和專 利。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種寇氏隱甲藻胞外多糖的制備方法。
[0007] 本發明的目的之二是提供該寇氏隱甲藻胞外多糖在制備抗氧化劑中的應用。
[0008] 本發明的目的之Ξ是提供該寇氏隱甲藻胞外多糖在制備具有抗氧化功能的保健 食品中的應用。
[0009] 本發明的整體技術構思是：
[0010] 寇氏隱甲藻胞外多糖的制備方法，包括如下工藝步驟：
[0011] A、培養寇氏隱甲藻：將寇氏隱甲藻菌種接種于含有碳源、氮源、營養因子的無菌培 養基中培養制成培養液；
[0012] B、獲得胞外多糖濃縮溶液：將培養液離屯、，并將上清液過濾獲得濃縮的胞外多糖 溶液。
[0013] 采用上述方法所制備的胞外多糖在制備抗氧化劑中的應用。
[0014] 本發明的具體技術構思還有：
[0015] 所述的步驟B是將上清液采用截留分子量為10000-20000的超濾系統過濾，去除 上清液中離子，并獲得濃縮的胞外多糖溶液。
[0016] 優選的技術方案是，還包括一步驟C，該步驟是從步驟B中獲得的濃縮的胞外多糖 溶液中提取胞外多糖。其中優選的技術方案是，所述的步驟C是按照體積比為無水乙醇：步 驟B中獲得的濃縮的胞外多糖溶液=2-4:1的比例，向步驟B中獲得的濃縮的胞外多糖溶 液中加入無水乙醇，靜置沉淀后獲得胞外多糖。
[0017] 更為優選的技術方案是，還包括一步驟D，該步驟是將步驟C中胞外多糖溶解至去 離子水中，冷凍干燥制備純化的寇氏隱甲藻胞外多糖。
[0018] 本發明中所述的寇氏隱甲藻菌種選用寇氏隱甲藻化ypthecodinium cohnii ATCC 30556ο
[0019] 所述的無菌培養基組成的優選技術方案是，無菌培養基采用如下組分組成：葡萄 糖 20-100g/l，酵母提取物 0. 5-3g/L，蛋白腺 0. 5-3g/L，海鹽 10-40g/L，抑值=5. 5-8. 0,余 量為無菌水。
[0020] 所述的培養條件如下：按照接種量的質量百分比為5-15%的比例接種，培養溫度 為20-30°C，搖床轉速為100-220rmp/min，培養周期為48-lOOh。
[0021] 本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于：
[0022] 1、本發明所制備的寇氏隱甲藻胞外多糖具有較好的超氧自由基、徑基自由基、氧 自由基清除能力W及細胞抗氧化活力，可W通過澤滅多種活性自由基，達到消除人體中自 由基和氧化壓力造成的機體氧化損傷的目的，闡明寇氏隱甲藻胞外多糖是良好的天然抗氧 化劑。
[0023] 2、相比寇氏隱甲藻粗多糖（培養液中直接加入3倍乙醇沉淀后所得胞外多糖，下 同），本發明所得的純化的寇氏隱甲藻胞外多糖具有更強的超氧自由基、徑基自由基清除能 力W及細胞抗氧化活力。
[0024] 3、利用本發明的方法所利用的寇氏隱甲藻屬于國家規定的新資源食品范疇，寇氏 隱甲藻胞外多糖具有《保健食品通用標準》（GB16740-2014)中對于保健食品應有與功能作 用相對應的功效成分，且符合《保健食品檢驗與評審技術規范》中對于保健食品應有抗氧化 功能的要求，能夠有效運用于制備抗氧化劑及具有抗氧化功能的保健食品。
【附圖說明】
[00巧]圖1是本發明制備的寇氏隱甲藻粗多糖和純化的寇氏隱甲藻胞外多糖超氧自由 基清除能力對比示意圖。
[00%]圖1中實屯、線為寇氏隱甲藻粗多糖的超氧自由基清除率曲線，空屯、線為本發 明中所制備的純化的寇氏隱甲藻胞外多糖超氧自由基清除率曲線，由圖1可見，寇氏隱 甲藻胞外多糖濃度從0. 25mgAiL提高至2mg/l，粗多糖的超氧自由基清除活性范圍為 16. 73% -50. 40%，純化的寇氏隱甲藻胞外多糖的清除活性范圍為28. 06% -68. 11%。經計 算，純化的寇氏隱甲藻胞外多糖的超氧自由基半數抑制濃度為0. 63mg/mL。因此，純化的寇 氏隱甲藻胞外多糖具有更好的超氧自由基清除能力。
[0027] 圖2是本發明制備的寇氏隱甲藻粗多糖和純化的寇氏隱甲藻胞外多糖的徑基自 由基清除能力對比示意圖。
[002引圖2中實屯、線為寇氏隱甲藻粗多糖的徑基自由基清除率曲線，空屯、線為本發明中 所制備的純化的寇氏隱甲藻胞外多糖徑基自由基清除率曲線，由圖2可見，寇氏隱甲藻粗 多糖清除徑基自由基的能力較弱，在多糖濃度為0. 25mg/mL時，清除活性只有17. 61 %，當 濃度提高至2mg/mL，徑基自由基清除活性也僅有31. 40%。純化的寇氏隱甲藻胞外多糖徑 基自由基清除活性顯著提升。隨著多糖濃度的提高化25mg/mL至2mg/mL)，徑基自由基的 清除活性顯著提高，從42. 47%提高至75. 73%。經計算，純化的寇氏隱甲藻胞外多糖的徑 基自由基半數抑制濃度為0. 50mg/mL。
【具體實施方式】
[0029] W下結合附圖對本發明的實施例做進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發 明的保護范圍W權利要求記載的內容為準，任何依據說明書作出的等效技術手段替換，均 不脫離本發明的保護范圍。
[0030] 實施例
[0031] 寇氏隱甲藻胞外多糖的制備方法，包括如下工藝步驟：
[0032] A、培養寇氏隱甲藻：將寇氏隱甲藻菌種接種于含有碳源、氮源、營養因子的無菌培 養基中培養制成培養液；
[0033] B、獲得胞外多糖濃縮溶液：將培養液離屯、，并將上清液過濾獲得濃縮的胞外多糖 溶液；
[0034] C、獲得胞外多糖：按照體積比為無水乙醇：步驟B中獲得的濃縮的胞外多糖溶液 =2-4:1的比例，向步驟B中獲得的濃縮的胞外多糖溶液中加入無水乙醇，靜置沉淀后獲得 胞外多糖；
[0035] D、獲得純化的寇氏隱甲藻胞外多糖：將步驟C中的胞外多糖溶解至去離子水中， 冷凍干燥獲得純化的寇氏隱甲藻胞外多糖。
[0036] 采用上述方法所制備的胞外多糖在制備具有抗氧化功能的保健食品中的應用。
[0037] 步驟A中的無菌培養基采用如下組分組成：葡萄糖20-100g/l，酵母提取物 0. 5-3g/l，蛋白腺0. 5-3g/l，海鹽10-40g/l，抑值=5. 5-8. 0,余量為無菌水，配置后高壓滅 困。
[0038] 所述的培養條件如下：按照接種量的質量百分比為5-15%的比例接種，培養溫度 為20-30°C，搖床轉速為100-220rmp/min，培養周期為48-lOOh。
[0039] 所述的步驟B是將上清液采用截留分子量為10000-20000的超濾系統過濾，去除 上清液中離子，并獲得濃縮的胞外多糖溶液。
[0040] 本實施例中的寇氏隱甲藻菌種選用寇氏隱甲藻化ypthecodinium cohnii ATCC 30556ο
[0041] 為驗證本實施例中寇氏隱甲藻胞外多糖的抗氧化能力，申請人進行了如下實驗：
[0042] 一、對所得的寇氏隱甲藻胞外多糖進行超氧自由基清除實驗
[0043] 方法：超氧自由基是一種對機體損害較大的氧自由基，鄰苯Ξ酪能刺激溶液產生 大量的超氧離子，運些離子在紫外325nm下具有吸光值，當抗氧化性多糖存在時會清除超 氧離子，導致吸光值下降。量取0. 5mL憐酸緩沖液巧OmM,pH= 8. 34)和0. 4mL樣品（3g/ L)或?；Γ〇1οχ(50μΜ)混勻，于25°C下靜置20mi