新穎的生物標志物的制作方法
【專利說明】新穎的生物標志物
[0001]發明領域 本發明涉及用于預測感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者是否將響應干擾素（IFN)療法的 生物標志物。本發明還涉及使用所述生物標志物預測患者是否將響應IFN療法的方法和試 劑盒。
[0002] 發明背景 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病。HBV主要感染在肝中稱為肝細胞的細 胞，且當宿主免疫應答試圖清除病毒感染時，導致肝損傷。
[0003] 盡管可利用有效的接種和暴露后預防，但是乙型肝炎病毒(HBV)感染依然在全世 界流行，并且其是導致顯著的發病率和死亡率的嚴重的全球性健康問題。如今，超過20億的 活著的人在他們生命中的某些時候已感染過HBV。世界人口的3/4居住在高水平感染的地 區。每年有超過400萬HBV的急性臨床病例。
[0004] 盡管大多數患者從急性感染中康復，但是全世界大約3.5億人(世界人口的5%)遭 受慢性HBV感染。這是經過多年已取得很多進展以理解該疾病的臨床病程及全世界已批準 多種療法的領域。當前療法的有效性不是100%，而存在許多正在進行的對于新穎療法的研 究。
[0005] 慢性HBV感染是世界上第十大主要的死亡原因，每年導致100萬至120萬人的死亡。 大約15%-40%的慢性感染的患者將發展為肝硬化、肝衰竭或肝細胞癌(HCChHCC發生率已在 全世界增加，并且其目前是第五大最頻發的癌癥，每年導致300，000至500，000例診斷病例。
[0006] 存在8種HBV的病毒基因型(A-H)，且這些在地理分布上不相同（見表1)。多種基因 型可能與疾病的嚴重性相關聯，但是還未建立基因型和HCC的風險之間的關系。
[0007] 表1: HBV基因型和地理分布 來源：乙型肝炎病毒感染的自然歷史和臨床結果(Natural History and Clinical Consequences of Hepatitis B Virus Infection). C. Pan 和 J. Zhang, Int. J. Med. Sci·， 2005， 2: 36-40。
[0008] 存在多種可利用的HBV治療，例如干擾素（IFN)療法。英國國家健康與護理優化研 究所（UK National Institute for Health and Care Excellence ) (NICE)在他們的臨 床指南草案中推薦在慢性HBV感染中，應當將聚乙二醇化-干擾素 a_2a療法作為第一線治 療來提供。但是，那些接受治療的患者僅約30%將實際上響應IFN療法，這導致患者遭受不必 要的副作用之苦并對醫療保健系統施加了財政負擔。因此，存在對于預測患者是否將響應 IFN療法的有效且效率高的方法的需要。
[0009] 發明概述 根據本發明的第一方面，提供了使用CD220作為生物標志物以預測感染乙型肝炎病毒 (HBV)的患者是否將響應干擾素（IFN)療法。
[0010]根據本發明的另一方面，提供了預測感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者是否將響應 干擾素療法的方法，包括： (a) 從患者獲得試驗生物樣本； (b) 定量本文定義的各生物標志物的量； (c) 將試驗生物樣本中的各生物標志物的量與存在于從干擾素療法的一個或更多個應 答者獲得的一個或更多個參考樣本和/或從干擾素療法的一個或更多個非應答者獲得的一 個或更多個參考樣本中的量相比較，以使得 (i) 與來自應答者的參考樣本(一個或更多個)相比較，試驗生物樣本中的各生物標志 物的等同水平;或 (ii) 與來自非應答者的參考樣本(一個或更多個)相比較，試驗生物樣本中的各生物 標志物的水平差異， 指示患者是否將響應干擾素療法。
[0011] 本發明的另一方面提供配體，例如天然存在的化合物或化學合成的化合物，其能 夠特異性結合本發明的生物標志物。根據本發明的配體可包含能夠特異性結合該生物標志 物的肽、抗體或其片段、或適配體或寡核苷酸。抗體可為能夠特異性結合該生物標志物的單 克隆抗體或其片段。根據本發明的配體可用可檢測的標志物標記，例如發光標志物、熒光標 志物或放射性標志物;替代地或另外，根據本發明的配體可用親和標記物標記，如生物素、 抗生物素蛋白、鏈霉親和素或HiS (如6-HiS)標記物。
[0012] 通過本發明還提供如本文描述的一種或更多種配體的用途，所述配體可為天然存 在的或化學合成的，且合適地為肽、抗體或其片段、適配體或寡核苷酸、或能夠識別該生物 標志物的任何其它天然化學個體或人工化學個體，或本發明的生物傳感器的用途、或本發 明的陣列的用途、或本發明用以檢測和/或定量該生物標志物的試劑盒的用途。在這些用途 中，檢測和/或定量可在生物樣本上進行，所述生物樣本例如選自全血、血清、血漿、組織液、 腦脊液(CSF)、滑液、卵泡液、精液、羊水、奶、尿、胸膜液、腹水、支氣管肺泡灌洗液、唾液、痰、 眼淚、汗、淋巴液、抽出物(aspirate )、骨髓穿刺液和粘液、或從其中的提取物或純化物、或 它們的稀釋物。
[0013] 提供試劑盒用于實施本發明的方法。此類試劑盒將合適地包含用于本發明的生物 標志物的檢測和/或定量的根據本發明的配體、和/或生物傳感器、和/或如本文描述的陣 列，任選地與試劑盒的使用說明書在一起。
[0014]因此，根據本發明的另一方面，提供了試劑盒，其包含能夠檢測和/或定量如本文 定義的各生物標志物的試劑和/或生物傳感器，用于預測感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者是 否將響應干擾素療法。
[0015] 附圖簡述 圖1:在HBV e+患者中，IFN應答者相對非應答者中的所選生物標志物的表達。
[0016] 圖2:訓練集(50%的樣本）。對于50%初始訓練數據集的應答者和非應答者的sCD表 達的散點圖。
[0017] 圖3:訓練集(完全數據集）。對于包括訓練階段和預測階段的100%完全數據集的 應答者和非應答者的sCD表達的散點圖。
[0018] 發明詳述 根據本發明的第一方面，提供了將CD220作為生物標志物以預測感染乙型肝炎病毒 (HBV)的患者是否將響應干擾素（IFN)療法的用途。
[0019] 在一個實施方式中，所述用途另外包括將⑶295作為又一生物標志物。
[0020] 在另一實施方式中，所述用途另外包括將⑶62LXD152、⑶W329和/或⑶80作為另 外的生物標志物。在又一實施方式中，所述用途另外包括將⑶66a和⑶217b/r作為另外的生 物標志物。
[0021] 根據本發明的替代的方面，提供了將CD295作為生物標志物以預測感染乙型肝炎 病毒(HBV)的患者是否將響應干擾素（IFN)療法的用途。
[0022]根據本發明的另一方面，提供了將⑶220和⑶295作為一組特異性生物標志物以預 測感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者是否將響應干擾素（IFN)療法的用途。
[0023] 術語"生物標志物"指方法、事件或狀況的區別性生物指示劑或生物學上獲得的指 示劑。具體而言，本發明的生物標志物用于鑒別最有可能響應具體治療性治療的患者。生物 標志物也可用于診斷方法中，如臨床篩選和預后評估，及用于監測治療的結果、藥物篩選和 開發。生物標志物及其用途對于新藥治療的鑒定和對于用于藥物治療的新靶的發現是有價 值的。在一個實施方式中，如本文定義的生物標志物在體外使用。
[0024] 本文提及"CD"或"分化群"指存在于白細胞和其它組織類型上的細胞表面蛋白。在 本發明的上下文中，術語"CD"指由給定的單克隆抗體或特異性地'簇聚'至考慮中的抗原/ 分子的單克隆抗體組或多克隆抗體組或多克隆抗體識別的細胞表面白細胞分子。
[0025]應當注意的是⑶220也可稱作"胰島素受體"。⑶295也可稱作"瘦蛋白受體"。
[0026]若患者在使用IFN治療之后具有持續的應答，則認為他們"響應"了IFN療法。干擾 素意欲通過以下兩種機理來治療感染HBV的患者:第一，IFN抑制病毒DNA的合成，因而具有 直接的抗病毒效應;和第二，IFN通過刺激天然殺傷細胞和輔助性T細胞來指導患者對于受 感染的肝細胞的免疫應答（見Asselah等人的Clinics in Liver Disease, 11 (2007) 839-849)。因此，IFN療法引起HBV復制的減少(通過血清中的HBV DNA的減少來指示）。
[0027]具體而言，對于療法的應答可定義為血清中不可檢測的HBV DNA(例如小于105拷 貝/mL)、伴隨或不伴隨抗-HBe檢測的HBV "e"抗原（HBeAg)的持續損失(HBeAg血清轉變）、 ALT(丙氨酸轉氨酶)的正常化和肝壞死性炎癥或肝纖維化的減少。
[0028] 使用本文定義的生物標志物將能夠鑒定哪個患者將成功地響應干擾素療法。這將 節省在非應答患者中進行無用的IFN療法的成本和用于處理IFN副作用的相關成本。
[0029] 對于患者的優勢將源自個性化的治療方法、更好的臨床結果和更好的依從性。對 于醫務人員，它將是用以更好地使治療適應個體患者需求和用以幫助長期監測的非常有用 的工具。對于醫療保健系統本身，將存在顯著的節省，因為昂貴的IFN治療將為最有可能具 有持續應答的患者儲備。
[0030] 在一個實施方式中，生物標志物是可溶性⑶（s⑶）。
[0031] 很多(若非全部)CD分子產生可溶形式，其通過可變剪接、蛋白酶剪切、解離或其它 機理從分子表面釋放。因此，在本發明的上下文中，術語sCD(即可溶性CD分子）與術語分泌 性CD或可溶性CD或脫落性(shed) CD (sCD)同義，并指典型地被發現在細胞表面表達的白 細胞分子的釋放形式，且其中至少一部分的該分子被如本文描述的給定單克隆抗體或單克 隆抗體組或多克隆抗體識別。但是，應當注意的是，用于識別該CD分子的抗體可能不是天然 存在的單克隆抗體或多克隆抗體。其可能是工程改造的、由從具有完整識別的抗體分子獲 得的表達片段組成的人工構建物，或其可能是非蛋白分子識別劑或蛋白識別劑，其不是抗 體，或是抗體混合物，例如通過將抗體結合部位引入不同的支架中制備的。
[0032] 有利地，如在W0 03/075016中所定義的，s⑶的可溶形式通過各種機理生成，所述 機理包括但不限于選自以下的那些中的任何一種:可變剪接、蛋白酶剪切和解離。
[0033]已顯示sCD在血液中的模式看來似乎與具體的疾病存在相關聯。這導致這樣的觀 點：sCD抗原生物標志物的模式可用作用于疾病診斷和監測的通用化系統的基礎。很多CD抗