專利名稱：一種微環游離表達載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微環游離表達載體，同時還涉及該表達載體的構建方法和應用， 屬于基因工程技術領域。
背景技術：
基因治療是以改變人的遺傳物質(DNA或RNA)為基礎的生物醫學治療技術，它是 通過一定方式將人正常基因或有治療作用的DNA序列導入人體靶細胞去糾正基因的缺陷 或者發揮治療作用。基因治療技術是隨著DNA重組技術的成熟而逐漸發展起來的，是當代 醫學和生物學的一個新的研究領域。自從20世紀90年代初首次成功進行基因治療的臨床 試驗以來，迄今已完成了數千例基因治療臨床試驗。作為一種分子藥物治療形式，基因治療 為許多遺傳性和獲得性疾病提供一種新的治療方式。從早期單基因遺傳病的治療，目前已 擴展到對人類健康威脅嚴重的多基因疾病，包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、代謝性疾 病，以及感染性疾病(如AIDS、乙型肝炎)等。載體(vector)是將外源基因導入宿主細胞的運載工具。基因治療載體系統包括 病毒與非病毒兩種。雖然病毒載體作為基因傳遞的工具被廣泛地采納，但它們仍存在著不 少的局限性，如腺病毒載體誘導機體產生超級免疫反應，腺病毒病毒載體和逆轉錄病毒載 體會引起染色體整合突變等。而非病毒載體則具有無傳染性、不限制載體容量，可大量制備 等優點而受到許多研究人員和臨床醫生的重視。目前，非病毒載體主要存在以下缺點轉染 效率低，在體內往往只能瞬時表達，如要穩定持久地表達，載體必須整合到宿主細胞染色 體上，載體的隨機整合會引起插入突變或導致轉基因的沉默。此外最新的研究表明，外源基 因表達盒與細菌質粒骨架之間的共價連接會導致外源基因的沉默，這是造成質粒載體所攜 帶的外源基因在體內只能瞬時表達的主要原因，也是質粒載體臨床應用的主要限制因素。 原核質粒序列在真核宿主細胞并沒有功能，并且基因治療導入宿主細胞后對患者存在潛在 的危險因素，如抗菌素抗性基因的失控隨機分布、某些未知的表達信號的激活等。因此，構 建新型、高效、安全的基因治療表達載體，是基因治療中亟待解決的問題。
發明內容
本發明的目的在于提供一種微環游離表達載體，能在宿主菌內完成微環載體的重 組過程，消除原核質粒元件，并且可游離于宿主細胞基因組DNA之外穩定持久的表達外源 基因。本發明的目的還在于提供一種微環游離表達載體的構建方法。本發明的目的還在于提供一種微環游離表達載體在基因治療或基因工程方面的 應用。為了實現上述目的，本發明的技術方案在于采用了 一種微環游離表達載體，其是 在真核表達載體上引入鏈霉菌噬菌體(pc31整合酶基因、內切酶I-SceI基因、I-SceI酶切 位點、人源性的MAR序列及鏈霉菌基因組attB和鏈霉菌噬菌體attP位點構建而成的重組質粒載體。本發明的技術方案在于采用了一種微環游離表達載體的構建方法，包括以下步 驟(1)構建含cpc31整合酶和I-SceI基因的原核表達載體ρΕΤ-φΙ根據鏈霉菌噬菌體cpc31整合酶基因合成引物Pl和Ρ2，根據內切酶I-SceI基因 序列合成引物P3和P4，其中引物P1和引物P3均含有酶切位點和起始密碼，引物P2引物含 有終止密碼、SD序列及酶切位點，引物P4含有終止密碼和酶切位點；通過PCR分別擴增鏈 霉菌噬菌體cpc31整合酶基因和I-SceI基因，擴增產物經測序驗證后，通過酶切將目的基 因連接到經同樣酶切的原核表達載體pET-28a(+)上，經驗證所引入的目的基因正確后，將 構建形成的新的載體命名為ρΕΤ-φΙ; (2)構建含人源性的MAR序列的哺乳動物細胞表達載體pcDNAM根據人源性的MAR序列設計引物P5和P6，兩條引物均含有酶切位點；提取人基因 組DNA，通過PCR擴增人源性的MAR序列，擴增產物經測序驗證后，通過酶切擴增產物連接至 相同酶切的PCDNA3. 1(+)載體上，經驗證所引入的目的基因正確后，將構建形成的含MAR序 列的新載體命名為PcDNAM ；(3)微環游離表達載體PEMW的構建根據pcDNA3. 1 (+)序列設計引物P7和P8，引物兩端分別加入attB和attP序列 及酶切位點，以PcDNAM質粒為模板進行PCR擴增，酶切擴增產物，連接到相同酶切的載體 ρΕΤ-φΙ上，經驗證所引入的目的基因正確后，將構建形成的新的載體命名為pEMW。本發明的技術方案在于采用了一種微環游離表達載體在基因治療或基因工程方 面的應用。其中，所述的噬菌體cpc31整合酶基因的GenBank登錄號為X59938. 1 ；所述的內 切酶I-SceI基因的GenBank登錄號為EU372689. 1 ；所述的人源性的MAR序列的Genbank登 錄號為M83137. 1 ；attB和attP位點序列的Genbank登錄號分別為X60952和X57036。所述的引物序列如下
Pl5'-ATTCGCTAGCATGACACAAGGGGTTGTGACCGGGGTGGA-3‘；
P25'-CGCGAATTCACCTCCTCTACGCCGCTACGTCTTCCGTGC-3‘；
P35'-CTAAAGCTTATGCATCAAAAAAACCAGGTAATGA-3‘；
P45'-CGGCTCGAGTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAGAT-3‘；
P55'-ACTCTCGAGTCGCCACGCACAAGATCAAT-3‘；
P65'-CGATCTAGAAGCGGGAACATCACTGCAAA-3‘；
P75'-GCAGACATGCGTCCGCGCCCGGGGAGCCCAAGGGCACGCCCTGGCACTAGGGATAACAGGGT
AATGTTGACATGATTATTGACTAGTT-3‘；P85 ‘ -GAAGCTCTTCAGCTCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTTGGGGCGGGAGCTTT TTGCAAAAGCCTAGG-3‘。本發明的表達載體含有(pc31整合酶及attB和attP位點序列，能在大腸桿菌 (E. coli) T0P10菌株中表達鏈霉菌噬菌體cpc31整合酶，介導attB和attP序列的DNA進行 重組反應，非可逆地產生含有另外兩個特異性序列(attL 36bp和attR 37bp)的新的重組 DNA分子，最終形成不含原核質粒序列的人類及哺乳動物細胞的微環載體；同時含有內切酶I-SceI的完整表達盒及I-SceI酶切位點，能在宿主菌E. coli表達I-SceI酶及將載體 切割成線性DNA ；此外在載體上還插入了人源的β -干擾素MAR片段，能使形成的微環質粒 游離于人類及哺乳動物細胞染色體DNA外穩定高效表達外源基因。
圖1為pET_28a(+)載體的物理圖譜；圖2為pcDNA3. 1⑴載體的物理圖譜；圖3為原核表達載體ρΕΤ-φΙ的構建流程圖；圖4為含MAR的哺乳動物細胞表達載體pcDNAM的構建流程圖；
圖5為微環游離表達載體pEMW的構建流程圖；圖6為微環游離表達載體pEMW的物理圖譜；圖7為微環游離表達載體pEMWV的物理圖譜；圖8為pEMWV載體重組形成的微環載體pEMV的物理圖譜。
具體實施例方式下面實施例具體說明本發明所述載體pEMW的構建過程與應用。特別需要指出的 是，本發明說明書所舉實施例只是為了幫助理解本發明，它們不具任何限制作用，即本發明 除說明書所舉實例外，還可以有其他實施方式。因此，凡是采用等同替換或等效變換形式形 成的任何技術方案，均落在本發明要求的保護范圍中。本發明實施例中所使用的質粒載體pET_28a(+)(質粒圖譜如圖1所示)購自 Novagen公司，質粒載體pcDNA3. 1 (+)(質粒圖譜如圖2所示)購自invitrogen公司，質粒 Pl-SceI (含I-SceI基因的質粒)由本實驗室保存，所使用的菌株E. coli T0P10及DH5 α 購自天根生化科技(北京)有限公司，鏈霉菌噬菌體(pc31來源于德國微生物與細胞培育 中心，Braunschweig，Germany DSM No. 49156，所使用的試劑均為市售商品。實施例1本實施例構建含鏈霉菌噬菌體CPC31整合酶和內切酶I-SceI基因的原核表達載 體ρΕΤ-φΙ的方法(質粒構建流程如圖3所示)(I)PCR擴增目的基因根據鏈霉菌噬菌體(pc31整合酶基因(GenBank登錄號為X59938. 1)，選用大腸桿 菌偏愛密碼子，設計并合成第一對引物Pl和P2，同時根據I-SceI基因(GenBank登錄號為 EU372689. 1)序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，設計并合成第二對引物P3和P4，其中第一對 引物含有Nhe I酶切位點和起始密碼ATG，P2含有終止密碼TAG、SD序列及EcoRI酶切位 點；P3含有HindIII位點和起始密碼ATG，P4含有終止密碼TAG和Xho I位點，引物序列如 下(斜體為基因序列、方框為SD序列、下劃線為酶切位點)PI 5' -ATTCGCTAGCATGACACAAGGGGTTGTGACCGGGGTGGA-3‘， P2 5' -CGCGAATTC ACCTCCTCTA
CGCCGCTACGTCTTCCGTGC “3 ‘P3 5' -CTAAAGCTT A TGCA TCA AAA AAA CCA GGTAA TGA -3'，P4 5' -CGGCTCGAG TTA TTTCA GGA A A GTTTCGGA GGA GAT-V
用病毒基因組DNA快速提取試劑盒提取鏈霉菌噬菌體(pc31的基因組DNA，同時提 取pl-Scel質粒，作為PCR擴增的模板，采用常規PCR擴增方法進行PCR擴增，使用引物Pl 和P2擴增鏈霉菌噬菌體(pc31整合酶基因序列，使用引物P3和P4擴增I-SceI基因序列， 分別用瓊脂糖凝膠電泳回收擴增產物，并送生物公司測序驗證，結果表明，擴增出的DNA片 段與GenBank登錄的(pc31整合酶基因序列和I-SceI基因序列完全一致；(2)構建含cpc31整合酶基因的ρΕΤ-φ載體用Nhe I和EcoRI雙酶切(pc31整合酶基因的PCR擴增產物(經測序驗證正確的 序列)，同時用Nhe I和EcoR I雙酶切pET_28a(+)質粒DNA，采用常規的酶切方法和瓊脂 糖凝膠電泳鑒定酶切結果，凝膠回收ipc31整合酶基因片段及pET-28a(+)線形載體；酶切 回收后的(pc31整合酶基因片段和pET-28a(+)質粒DNA按1 5 (摩爾比)進行連接，16°C 連接過夜；然后將連接產物加入E. coliDH5a菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，接種在含 有卡那霉素的LB平板上37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，并進行重組質粒載體的雙酶 切(Nhe I和EcoR I)驗證；選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完全 正確的載體命名為ρΕΤ-φ;(3)在載體ρΕΤ-φ中引入I-SceI基因序列，構建ρΕΤ-φΙ載體用Hind III和Xho I雙酶切I-SceI基因，并同時用Hind III和Xho I雙酶切 ρΕΤ-φ質粒DNA，酶切、連接、轉化等步驟的方法同上述②中所述的方法，用Hind III和Xho I雙酶切鑒定重組質粒載體；選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完 全正確的載體命名為ρΕΤ-φΙ。實施例2 本實施例構建含人源性MAR序列的真核表達載體pcDNAM的方法(構建流程如圖 4所示)(I)PCR擴增目的基因根據人源性MAR序列(Genbank登錄號為M83137. 1)，設計并合成引物P5和P6，其 中引物P5包括Xho I酶切位點，引物P6包括Xba I酶切位點，引物序列如下(斜體為基因 序列、下劃線為酶切位點)P5 5' -ACTCTCGAG TCGCCACGCACAAGATCAAT ，P6 5' -CGATCTAGA AGCGGGAACATCACTGCAAA -3‘；用Axygen血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取人外周血基因組DNA，作為PCR 擴增的模板，采用常規PCR擴增方法進行PCR擴增，使用引物P5和P6擴增MAR序列，瓊脂 糖凝膠電泳回收擴增產物，送生物公司測序驗證，結果表明，擴增出的DNA片段與GenBank 登錄的MAR序列完全一致；(2)構建含MAR序列的真核表達載體pcDNAM用Xho I和Xba I雙酶切MAR序列的PCR擴增產物(經測序驗證正確的序列)，同 時用Xho I和Xba I雙酶切pcDNAM質粒DNA，采用常規的酶切方法和瓊脂糖凝膠電泳鑒定 酶切結果，凝膠回收MAR序列片段及pcDNA3. 1(+)線形載體；酶切回收后的pcDNA3. 1 (+)質 粒DNA和MAR序列片段按1 5 (摩爾比)進行連接，16°C連接過夜；然后將連接產物加入 E. coli DH5a菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，接種在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，并進行重組質粒載體的雙酶切(Xho I和Xba I)驗證；選 取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完全正確的載體命名為pcDNAM。實施例3本實施例構建微環游離表達載體pEMW的方法(構建流程如圖5所示)根據pcDNAM序列，設計并合成引物P7和P8，其中在引物P7的5'端引入34bp的 attB序列、I-SceI酶切序列及PshAI酶切位點，在引物P8的5 ‘端引入39bp的attP序列及 Sap I酶切位點，引物序列如下(加粗為I-SceI酶切序列、斜體為基因序列、方框為attB/ attP序列、下劃線為酶切位點)P7 5 ‘ -GCAGACATGCGTC jCGCGCCCGGGGAGCCCAAGGGCACGCC
丨CTGGCAC丨 TAGGGATAACAGGGTAAT GTTGACATGATTATTGACTAGTT
-3'；P8 5 ‘ -GAAGCTCTTCAGCT [CCCCAACTGGGGTAACCTTTGAG TTCT
CTCAGTTTGGGG \cGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG °用pcDNAM質粒DNA作為PCR擴增的模板，采用常規PCR擴增方法進行PCR擴增， 然后用PshAI和Sap I雙酶切PCR擴增產物，同時用PshAI和Sap I雙酶切ρΕΤ-φΙ質粒 DNA，采用常規的酶切方法進行酶切，凝膠回收目的片段(含cpc31整合酶基因、I-SceI基 因片段、I-SceI酶切序列及attB/attP位點的基因片段)和ρΕΤ-φΙ線形載體；隨后將酶 切回收后的目的片段和ρΕΤ-φΙ線形載體按1 3(摩爾比)進行連接，16°C連接過夜；然 后將連接產物加入E.ColiDH5a菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，接種在含有卡那霉素 的LB平板上37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，并進行重組質粒載體的雙酶切(PshAI和 Sap I)驗證；選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完全正確的載體命 名為pEMW(質粒圖譜如圖6所示)。實施例4微環游離表達載體pEMW的應用(1)人血管內皮生長因子(VEGF)基因的克隆根據人的VEGF基因cDNA序列(Genbank登錄號AF022375. 1)設計PCR引物P9和 P10，其中引物P9包含Nhe I酶切位點，引物PlO包含Hind III酶切位點，引物序列如下 (斜體為基因序列、下劃線為酶切位點)P9 5' -GGCGCTAGC ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG -3‘，PIO 5' -GCGAAGCTT TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTG -3‘；取人心肌組織約50mg，按RNA提取的Trazol試劑盒操作說明提取總RNA，取一定 量的總RNA，用1.0%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性后，-70°C保存，備用；在50yL 反應體系中，分別加入dNTP lyL(l(kimol/L)，RNA 1 μ g，濃度為20 μ mol/L的P9、PlO引 物各 1 μ L 以及 AMV-Taq DNA 聚合酶 1 μ L (5U/ μ L)，AMV 反轉錄酶 1 μ L (5U/ μ L)，按照 One Step PCR Kit(AMV)試劑盒操作說明進行RT-PCR反應在50°C下，保持30min，將mRNA反轉 錄成cDNA ；然后按如下參數循環30次94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s ；取PCR 產物10 μ L進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果擴增出大小片段為576bp，與預期大小相符；用DNA凝膠純化試劑盒回收目的DNA，送公司測序驗證，結果表明，擴增出的DNA片段與 GenBank登錄的VEGF基因cDNA序列完全一致；(2)微環游離表達載體pEMWV的構建用Nhe I禾口 Hind III雙酶切PCR擴增產物，同時用Nhe I禾口 Hind III雙酶切pEMW 質粒DNA，采用常規的酶切方法進行酶切，凝膠回收目的片段和pEMW線形載體；隨后將酶切 回收后的目的片段和PEMW質粒DNA按1 5(摩爾比)進行連接，16°C連接過夜；然后將 連接產物加入E. coli ToplO菌株感受態細胞懸液中，進行轉化，接種在含有卡那霉素的LB 平板上37°C培養過夜，挑取單菌落繼代培養，并進行重組質粒載體的雙酶切(Nhe I和Hind III)驗證；選取酶切驗證正確的質粒，進行測序驗證，將目的基因序列完全正確的載體命 名為pEMWV(質粒圖譜如圖7所示)；(3)微環游離表達載體pEMWV的重組提取上述構建好的pEMWV質粒轉化大腸桿菌E. coli TopolO,含有卡那霉素(終 濃度為50mg/L)的LB培養基中，37°C培養過夜，然后在37°C下，按1 100(即Iml菌液加 入IOOmlLB培養基中)進行擴大培養至菌液的吸光度為A_ = 0. 6時，加入IPTG至終濃度 為lmmol/L，誘導培養6h，然后按常規質粒提取方法抽提純化pEMWV質粒，加入核酸外切酶， 370C 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒大小。測定0D260質粒濃度，送生物公司測序進一步驗 證，經驗證正確的質粒即為重組形成的微環質粒pEMV(質粒圖譜如圖8所示)。(4)含血管內皮生長因子的微環游離表達載體在基因治療中的應用取經重組的pEMV質粒，制成純品，配制成針劑或口服膠囊，用于心血管疾病的治 療。
序列表
<110>新鄉醫學院
<120> 一種微環游離表達載體及其構建方法和應用 <160>10
<170>PatentIn Version3.3 <211>39 Pl
<212>DNA <213>人工序列
<400>attcgctagc atgacacaag gggttgtgac cggggtgga 39 <211>39 P2
<212>DNA <213>人工序列
<400>cgcgaattca cctcctctac gccgctacgt cttccgtgc 39 <211>34 P3
<212>DNA <213>人工序列<400>ctaaagctta <211>36 P4
<212>DNA <213>人工序列 <400>cggctcgagt <211>29 P5
<212>DNA <213>人工序列 <400>actctcgagt <211>29 P6
<212>DNA <213>人工序列 <400>cgatctagaa <211>88 P7
<212>DNA <213>人工序列 <400>gcagacatgc ggataacagg <211>78 P8
<212>DNA <213>人工序列 <400>gaagctcttc gggcgggagc <211>33 P9
<212>DNA <213>人工序列 <400>ggcgctagca <211>34 PlO <212>DNA <213>人工序列 <400>gcgaagcttt 序列表
tgcatcaaaa aaaccaggta atga
34
tatttcagga aagtttcgga ggagat
36
cgccacgcac aagatcaat
29
gcgggaacat cactgcaaa
29
gtccgcgccc ggggagccca agggcacgcc ctggcactag gtaatgttga catgattatt gactagtt
88
agctccccaa ctggggtaac ctttgagttc tctcagtttg tttttgcaaa agcctagg
78
tgaactttct gctgtcttgg gtg
33
caccgcctcg gcttgtcaca tctg
34<110>新鄉醫學院
<120> 一種微環游離表達載體及其構建方法和應用 <160>10
<170>Patentln Version3.3 <211>39 PI
<212>DNA <213>人工序列
<400>attcgctagc atgacacaag gggttgtgac cggggtgga 39 <211>39 P2
<212>DNA <213>人工序列
<400>cgcgaattca cctcctctac gccgctacgt cttccgtgc 39 <211>34 P3
<212>DNA <213>人工序列
<400>ctaaagctta tgcatcaaaa aaaccaggta atga34
<211>36 P4
<212>DNA <213>人工序列
<400>cggctcgagt tatttcagga aagtttcgga ggagat 36 <211>29 P5
<212>DNA <213>人工序列
<400>actctcgagt cgccacgcac aagatcaat 29 <211>29 P6
<212>DNA <213>人工序列
<400>cgatctagaa gcgggaacat cactgcaaa 29 <211>88 P7
<212>DNA <213>人工序列
<400>gcagacatgc gtccgcgccc ggggagccca agggcacgcc ctggcactagggataacagg <211>78 P8
<212>DNA <213>人工序列 <400>gaagctcttc gggcgggagc <211>33 P9
<212>DNA <213>人工序列 <400>ggcgctagca <211>34 P10 <212>DNA <213>人工序列 <400>gcgaagcttt
gtaatgttga catgattatt gactagtt 88
agctccccaa ctggggtaac ctttgagttc tctcagtttg tttttgcaaa agcctagg 78
tgaactttct gctgtcttgg gtg 33
caccgcctcg gcttgtcaca tctg 34
1權利要求
一種微環游離表達載體，其特征在于所述載體是在真核表達載體上引入鏈霉菌噬菌體整合酶基因、內切酶I SceI基因、I SceI酶切位點、人源性的MAR序列及鏈霉菌基因組attB和鏈霉菌噬菌體attP位點構建而成的重組質粒載體。FSA00000030671000011.tif
2.根據權利要求1所述的一種微環游離表達載體，其特征在于所述的噬菌體cpc31整 合酶基因的GenBank登錄號為X59938. 1 ；所述的內切酶I-SceI基因的GenBank登錄號為 EU372689. 1 ；所述的人源性的MAR序列的Genbank登錄號為M83137. 1 ；所述的attB和attP 位點序列的Genbank登錄號分別為X60952和X57036。
3.—種如權利要求1所述的微環游離表達載體的構建方法，其特征在于所述構建方 法包括以下步驟(1)構建含鏈霉菌噬菌體φο31整合酶和內切酶I-SceI基因的原核表達載體ρΕΤ-φΙ根據鏈霉菌噬菌體q>c31整合酶基因合成引物Pl和Ρ2，根據內切酶I-SceI基因序列合成引物P3和P4，其中引物P1和引物P3均含有酶切位點和起始密碼，引物P2引物含有終止 密碼、SD序列及酶切位點，引物P4含有終止密碼和酶切位點，通過PCR分別擴增鏈霉菌噬菌 體q>c31整合酶基因和I-SceI基因；將目的基因酶切后連接到經相同酶切的原核表達載體 pET-28a(+)上，經驗證所引入的目的基因正確后，將構建形成的新的載體命名為ρΕΤ-φΙ;(2)構建含人源性的MAR序列的哺乳動物細胞表達載體pcDNAM根據人源性的MAR序列設計引物P5和P6，兩條引物均含有酶切位點；提取人基因組 DNA,通過PCR擴增人源性的MAR序列，擴增產物經測序驗證后，將擴增產物酶切后連接到經 相同酶切的PCDNA3. 1(+)載體上，經驗證所引入的目的基因正確后，將構建形成的含MAR的 新載體命名為pcDNAM ；(3)微環游離表達載體pEMW的構建根據pcDNA3. 1 (+)序列設計引物P7和P8，引物兩端分別加入attB和attP序列、酶切 位點，以pcDNAM質粒為模板進行PCR擴增，酶切擴增產物，連接到相同酶切的載體ρΕΤ-φΙ 上，經驗證所引入的目的基因正確后，將構建形成的新的載體命名為pEMW。
4.根據權利要求3所述的一種微環游離表達載體的構建方法，其特征在于所述的鏈 霉菌噬菌體(pc31整合酶基因的GenBank登錄號為X59938. 1 ；所述的內切酶I-SceI基因的 GenBank登錄號為EU372689. 1 ；所述的人源性的MAR序列的Genbank登錄號為M83137. 1 ； 所述的attB和attP位點序列的Genbank登錄號分別為X60952和X57036。
5.根據權利要求3所述的一種微環游離表達載體的構建方法，其特征在于所述的引 物Pl和P2序列如下Pl 5' -ATTCGCTAGCATGACACAAGGGGTTGTGACCGGGGTGGA-3'；P2 5' -CGCGAATTCACCTCCTCTACGCCGCTACGTCTTCCGTGC-3'。
6.根據權利要求3所述的一種微環游離表達載體的構建方法，其特征在于所述的引 物P3和P4序列如下P3 5' -CTAAAGCTTATGCATCAAAAAAACCAGGTAATGA-3'；P4 5' -CGGCTCGAGTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAGAT-3'。
7.根據權利要求3所述的一種微環游離表達載體的構建方法，其特征在于所述的引 物P5和P6序列如下P5 5' -ACTCTCGAGTCGCCACGCACAAGATCAAT-3'； P6 5' -CGATCTAGAAGCGGGAACATCA CTGCAAA-3‘。
8.根據權利要求3所述的一種微環游離表達載體的構建方法，其特征在于所述的引 物P7和P8序列如下P7 5 ‘ -GCAGACATGCGTCCGCGCCCGGGGAGCCCAAGGGCACGCCCTGGCACTAGGGATAACAGGGTAATG TTGACATGATTATTGACTAGTT-3‘；P8 5 ‘ -GAAGCTCTTCAGCTCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTC TCAGTTTGGGG CGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3‘。
9.一種如權利要求1所述的微環游離表達載體在基因治療或基因工程方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種微環游離表達載體及其構建方法和應用，該載體含有噬菌體整合酶基因、I-SceI基因及酶切位點、人源性的MAR序列及attB和attP位點；其構建方法是首先構建含整合酶基因和I-SceI基因的載體pET-及含人源性的MAR序列的載體pcDNAM，然后將pcDNAM載體上的目的片段再克隆到pET-載體中構建成微環游離表達載體pEMW；其應用體現在基因治療及基因工程方面。本發明的載體能在宿主菌內完成微環載體的重組過程，消除原核質粒元件；還可游離于宿主細胞基因組DNA之外穩定持久的表達外源基因；利用本發明的表達載體可以成功地在各種人類及動物細胞中高效表達外源基因。
文檔編號A61K48/00GK101942475SQ201010106639
公開日2011年1月12日 申請日期2010年2月5日 優先權日2010年2月5日
發明者張靖, 楊磊, 林艷, 王天云, 王小引, 石如玲, 董玉珍, 韓忠敏 申請人:新鄉醫學院