卷煙煙氣中芳香胺類化合物體外誘導上皮細胞中muc5ac表達的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及卷煙煙氣毒理研究技術領域，具體涉及一種卷煙煙氣中芳香胺類化合 物體外誘導上皮細胞中MUC5AC表達的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 慢性阻塞性肺病（chronicobstructivepulmonarydisease，C0PD)是世界范圍 內一種發病率高、致殘致死率高、且嚴重影響患者生活質量的疾病，同時會加重患者的經濟 負擔。
[0003]在各種致病因素中，吸煙是最重要的環境危險因素。據統計，由吸煙所致死亡的疾 病中，慢性肺部疾患占45 %，C0PD是其中的慢性肺病之一。國外有80 %~90 %的C0PD是 由吸煙引起的，我國約有72%的C0PD是由吸煙引起的。
[0004] 正常情況下，氣管、支氣管上皮細胞和黏膜下腺分泌的黏液能保護氣道上皮免受 空氣污染物和病原體的攻擊，而在慢性氣道炎癥性疾病如慢性阻塞性肺病、哮喘等病理情 況下，常常伴有黏液過度分泌，過多分泌的黏液阻塞氣道，使呼吸功能長期不能改善，且易 導致病原菌定植，引起反復感染，與病情嚴重程度密切相關。
[0005] 大量研究證實，氣道黏液高分泌已成為coro急性加重期患者死亡率升高的獨立 危險因素，在致死性哮喘患者氣道中也發現有大量黏液阻塞，杯狀細胞急性脫顆粒釋放大 量黏液是造成哮喘急性惡化及死亡的重要原因。早有研究證實，吸煙患者的慢性支氣管炎、 肺氣腫、支氣管哮喘、肺間質纖維化等一系列慢性炎性病變的發生率遠遠高于非吸煙者，且 病情更嚴重，不易緩解。
[0006] 長期大量吸煙的正常人中，雖然小氣道形態學上并無異常，但上皮細胞中編碼細 胞因子、固有免疫反應、凋亡、黏蛋白等的基因都存在調節上的異常，更易發生病變，導致 C0PD的發生發展。吸煙者氣道的杯狀細胞大量增生、肥大，其體積和數量多于吸煙者的數 倍，能儲存高于正常2. 2倍乃至更多的黏液，在有小氣道阻塞性病變的吸煙者中尤其顯著， 故在急性發作期，更易產生黏液栓，使病情惡化。
[0007] 卷煙煙氣是多種化合物組成的復雜混合物，截止1988年（據Roberts， 1988TobaccoR印orter報道）已經鑒定出煙氣中的化學成分已達5068種，其中1172種是煙 草本身就有的，另外3896種是煙氣中獨有的。美國健康基金會副董事長D.霍夫曼博士列 出卷煙煙氣中的44種主要有害成分，除焦油、煙堿和一氧化碳這些主要成分外，其他大致 可分為九類：①氨；②四種芳香胺；③苯并芘；④八種醛酮類化合物；⑤氫氰酸；⑥七種無 機元素；⑦七種酚類化合物；⑧四種煙草特有亞硝胺；⑨其他揮發性有機成分。
[0008] 國內的鄭州煙草研究院根據國家局要求以及行業質量安全性工作的需要，推出卷 煙煙氣中7種主要有害成分包括C0,HCN，NNK，NH3,B[a]P，苯酚和巴豆醛的行業標準。芳香 胺類物質作為煙氣中主要成份之一，對呼吸道具有強刺激作用以及致癌作用，目前針對卷 煙煙氣中芳香胺類物質體外誘導氣道上皮Muc5ac表達，尚無公開發表的研究。

【發明內容】

[0009] 本發明提供了一種卷煙煙氣中芳香胺類化合物體外誘導上皮細胞中MUC5AC表達 的檢測方法，操作簡單，方便快速，靈敏度高，能夠準確檢測卷煙主流煙氣中各種芳香胺類 物質對人氣道上皮細胞中MUC5AC表達的誘導作用。
[0010] -種卷煙煙氣中芳香胺類化合物體外誘導上皮細胞中MUC5AC表達的檢測方法， 包括：
[0011] 步驟1，以pGL6為質粒載體，構建含有MUC5AC啟動子的MUC5AC-promotor-pGL6質 粒；
[0012] 步驟2,將MUC5AC-promotor-pGL6質粒轉染入人氣道上皮細胞16HBE中，得到 MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE細胞；
[0013] 步驟3,在MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE細胞中加入卷煙煙氣中的芳香胺類化合 物，作用至少48h ;
[0014] 步驟4,對步驟3的作用產物進行熒光素酶活性檢測，依據所得的熒光素酶活性， 得到上皮細胞中MUC5AC的誘導表達倍數。
[0015] 本發明選取人氣道上皮細胞中MUC5AC啟動子序列-1300-+48作為靶標序列，利用 PCR擴增該序列，并克隆到具有熒光素酶報告基因和G418篩選標記的PGL6質粒中，將測序 驗證正確的質粒轉染入人氣道上皮細胞16HBE中，將轉染后的細胞與卷煙提取物相作用， 獲得上皮細胞中MUC5AC的表達程度。
[0016] 作為優選，MUC5AC-promotor_pGL6質粒的構建方法如下：
[0017] 步驟1-1、設計MUC5AC啟動子-1300-+48的引物序列如下：
[0018]上游引物為：5'-AGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC-3'（序列如SEQIDN0:1 所示的 DNA序列）；
[0019]下游引物為：5'-CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3'（序列如SEQIDN0 :2所 不的DNA序列）；
[0020] 以人氣道上皮細胞16HBE的總基因組DNA為模板，利用PCR擴增MUC5AC啟動子序 列；
[0021] 步驟1-2、利用Κρη I和Xhol I雙酶切步驟1-1的PCR產物和質粒載體pGL6,用 T4DNA連接酶連接至少24h，得到MUC5AC-promotor-pGL6質粒。
[0022] 作為優選，步驟1-1中PCR反應的條件如下：
[0023]
[0024] 變性、退火、延伸循環28~30次。
[0025] 作為優選，PCR產物與pGL6載體的摩爾比為3:1。
[0026] 作為優選，利用Lipofectamine3000轉染試劑將MUC5AC-promotor_pGL6質粒轉染 入人氣道上皮細胞16HBE中，然后采用G418篩選得到MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE細胞。
[0027] 作為優選，步驟3中，芳香胺類化合物的加入量為不對人氣道上皮細胞16HBE產生 細胞毒性的最大量。
[0028] 本發明提供的檢測方法，具有以下優點：
[0029] (1)由于卷煙煙氣進入人體氣道后主要作用細胞，本發明采用人氣道上皮細胞作 為研究對象，更接近吸煙的實際狀態。
[0030] (2)特異性的選取人氣道上皮細胞中MUC5AC的啟動子序列，使檢測更加具有針對 性和特異性。
[0031] (3)建立MUC5AC-promotor-PGL6-16HBE穩轉細胞，不用反復瞬時轉染質粒，使篩 選更加快速和經濟。
[0032] (4)采用熒光素酶報告基因作為最終檢測指標，靈敏度高。
【附圖說明】
[0033] 圖la表示1-氨基萘對16HBE的細胞毒作用；
[0034] 圖lb表示3-氨基聯苯對16HBE的細胞毒作用；
[0035] 圖2a表示1-氨基萘對16HBE中Muc5ac表達的誘導作用；
[0036] 圖2b表示3-氨基聯苯對16HBE中Muc5ac表達的誘導作用；
[0037] 圖3為PGL6質粒圖譜；
[0038] 圖4表示卷煙提取物對人氣道上皮細胞中Muc5ac的誘導作用。
【具體實施方式】
[0039] 實施例1
[0040] 芳香胺類物質是卷煙主流煙氣中的主要物質之一，主要有如1-氨基萘，2-氨基 萘，1-氨基聯苯，3-氨基聯苯等。為檢測這些芳香胺類物質是否是吸煙導致肺部炎癥的主 要化合物，對1-氨基萘和3-氨基聯苯是否會誘導人氣道上皮細胞中MUC5AC的表達進行檢 測，包括以下步驟：
[0041] 步驟1，以pGL6為質粒載體，構建含有MUC5AC啟動子的MUC5AC-promotor-pGL6質 粒，構建方法如下：
[0042] 步驟1-1、設計MUC5AC啟動子-1300-+48的引物序列如下：
[0043]上游引物為：5 ' -AGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC-3 ' ；
[0044]下游引物為：5' -CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3' ；
[0045] 以人氣道上皮細胞16HBE的總基因組DNA為模板，利用PCR擴增MUC5AC啟動子序 列。
[0046] PCR反應體系包括：
[0047]
[0048] PCR反應的條件如下：
[0049]
[0050] 將PCR產物利用1%瓊脂糖凝膠，110V，20min電泳分離后，得到的擴增條帶中的目 的條帶約680bp切下，用GelExtractionKitDNA純化試劑盒進行純化。
[0051] 步驟1-2、采用ΚρηI和XholI雙酶切純化產物5h，同時采用ΚρηI和XholI 雙酶切2μg質粒載體pGL6 5h，再次純化回收后，用T4DNA連接酶在16°C下連接24h。
[0052] 連接反應體系如下：
[0053]
[0054