一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測引物及其組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及貧血癥的檢測技術領域，尤其涉及一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢 測引物及其組合物。
【背景技術】
[0002] 鐮刀形紅細胞貧血癥是一種常染色體隱性基因遺傳病，病患者的紅細胞在鏡下呈 現出鐮刀形，其攜帶氧功能只有正常紅細胞的一半，在缺氧狀態下，這種不正常的紅細胞會 破裂造成嚴重貧血，甚至引起病人死亡。鐮刀型細胞貧血癥主要發生在非洲及美國黑人中， 我國的南方地區近年來也有病例報道。分子生物學研究發現，該病的發病原因是編碼血紅 蛋白β亞基第六個氨基酸的基因序列由GAG突變成GTG，導致血紅蛋白β鏈該處的谷氨酸 突變成纈氨酸，從而引起血紅蛋白的功能異常。這種突變表現出一定的共顯性，只攜帶一個 突變基因的人群一般表型正常，此類型往往不需要治療，但其血液中還是存在一定比例的 鐮狀紅細胞，在缺氧狀態下，這種紅細胞也會破裂導致一系列嚴重后果，因此這類攜帶者 應避免尚山等缺氧環境。
[0003] 目前對鐮刀型貧血的基因檢測主要是直接測序法和PCR-限制性片段長度多態性 法（PCR-RFLP)。直接測序法可以直接獲得突變位點的序列，比較直觀，但操作繁瑣，耗時長， 且需要使用昂貴的試劑和儀器，因此并不適合大規模推廣；PCR-RFLP則是在PCR反應后酶 切產物，操作比較繁瑣，當樣本量較大時，很有可能引起樣本的交叉污染，因此也不是大樣 本研究或檢測的最佳手段。因此，需找一種新的適于大量檢測樣本的鐮刀型貧血檢測方法 和引物很有必要。
[0004] 環介導等溫擴增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)技術是日本 科學家于2000年開發出來的一種恒溫擴增技術，針對靶基因的六個區域設計四條特異性 引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下恒溫擴增，可在十幾分鐘到一小時之內產生109-101(]數 量級的產物，反應結束后通過肉眼直接觀察體系狀態的改變來判定待測樣本的基因型，無 需開管，因此大大簡化了操作步驟，同時又可以有效避免樣本交叉污染，而且，僅需普通水 浴鍋即可開展檢測，又節約了大量的檢測成本。因此，采用LAMP方法檢測鐮刀形細胞性貧 血癥是一種新的研究方向。

【發明內容】

[0005] 本發明要解決的問題是現有的鐮刀形細胞性貧血癥檢測方法不理想，不適于大規 模推廣使用。
[0006] 為解決上述問題，本發明在LAMP的基礎上采用等位基因特異性環介導等溫擴增 (Allele-SpecificLAMP)技術，針對編碼血紅蛋白的基因序列進行檢測，從而判斷待檢測 人群是否攜帶可導致鐮刀形細胞性貧血癥的突變基因。本發明提供了一種適于推廣使用的 鐮刀形細胞性貧血癥基因檢測引物及其組合物。
[0007] 本發明的第一個目的在于提供一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測引物，用于檢 測編碼血紅蛋白的基因序列，包括以下引物：
[0008] 5' -GTCGACTGTTGCTTACACTTTC-3'（SEQIDNo. 1，以下簡稱F3)
[0009] 5' -GCCCAGTTTCCATTTGCCT-3'（SEQIDNo. 2,以下簡稱B3)
[0010] 5' -TCTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC-3'（SEQIDNo. 3,以下 簡稱FIPA)
[0011] 5' -ACTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC-3'（SEQIDNo. 4,以下 簡稱FIPT)
[0012] 5' -TGAACGTGGATGCAGTTGGTGGGAGCCTCTCTTATAACCTTGATACC-3'(SEQIDNo. 5， 以下簡稱BIP)。
[0013] 本發明提供的引物中，針對編碼血紅蛋白β鏈的基因序列的野生型和突變型分 別設計特異性引物FIPA和FIPT，在這兩個特異引物的特異堿基的附近均添加了一個新的 突變，增加了引物的特異性，進一步減少非特異性的影響，提高了檢測的準確性。
[0014] 本發明的第二個目的在于提供一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測組合物。所述 組合物包括上述的引物，還包括dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。
[0015] 進一步地，所述組合物分為兩個體系，分別為檢測編碼血紅蛋白基因序列中A等 位基因的體系A和檢測T等位基因的體系T;
[0016] 體系A中包括F3、B3、FIPA、BIP、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水；
[0017] 體系T中包括F3、B3、FIPT、BIP、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。
[0018] 優選地，兩個體系中均還包括用于顯示體系顏色的指示劑。
[0019] 優選地，所述指示劑為鈣黃綠素和氯化錳的組合物或者為羥基萘酚藍。
[0020] 優選地，指示劑在體系A和體系T中的濃度相同。若指示劑為鈣黃綠素和氯化錳 的組合物，媽黃綠素為25μM，氯化猛為0. 5mM。若指示劑為羥基萘酸藍，其為120μM。
[0021] 進一步地，所述兩個體系中均還包括添加劑；所述添加劑為甜菜堿或二甲基亞砜 中的一種。體系中的甜菜堿或二甲基亞砜的存在，防止堿基堆積，減少引物二聚體的形成以 及模板之間的復雜二級結構的形成，使DNA雙鏈更易打開。添加劑在兩個體系中的濃度相 同。若添加劑為甜菜堿，其濃度為大于〇,小于等于1Μ;若添加劑為二甲基亞砜，其濃度為大 于0,小于等于10% (體積分數）。
[0022] 優選地，所述甜菜堿的濃度為0. 8Μ。
[0023] 優選地，所述兩個體系中：F3的濃度相同，為0. 4μΜ;Β3的濃度相同，為0. 4μΜ; BIP的濃度相同，為1.6μΜ;體系Α中FIPA的濃度和體系Τ中FIPT的濃度相同，均為 1. 6μΜ〇
[0024] 優選地，所述兩個體系中緩沖液的濃度相同，其包括：Tris-HCl20mM，KC1 50mM， (NH4) 2S0410mM，MgS044mM，Tween_2〇0· 1 % (體積分數）。
[0025] 優選地，兩個體系中dNTP的濃度相同，均為1. 4mM。兩個體系中Bst聚合酶均為 8U〇
[0026] 本發明的第三個目的在于提供一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測方法。所述檢 測方法，使用上述的鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測組合物，具體為：將待檢測的核酸分別 加入到體系A和體系T中，得到的兩個反應體系于55~70°C下反應，反應結束后觀察體系 的變化。
[0027] 進一步地，所述待檢測的核酸在兩個體系中的濃度一致，均為0. 8~4ng/μL。
[0028] 優選地，反應結束后，將兩個體系分別進行滅活處理。滅活處理使得體系中的酶失 活，防止體系放置時間長時發生非特異性擴增。
[0029] 優選地，反應溫度為60 °C。
[0030] 優選地，所述反應時間為40~120min。
[0031] 在本發明的反應體系中，反應前體系為澄清狀態，發生陽性反應時，鎂離子與副產 物焦磷酸形成沉淀，體系產生肉眼可見的沉淀，變為渾濁狀態。觀察體系狀態的變化可以直 接判定是否發生擴增反應。
[0032] 當體系中存在指示劑時：（1)若指示劑為羥基萘酚藍，反應前體系中的鎂離子與 dNTP螯合，體系呈現紫羅蘭色；當有陽性反應時，鎂離子與副產物焦磷酸形成沉淀，溶液pH 發生改變，顏色逐漸由紫羅蘭色變為天藍色；（2)若指示劑為鈣黃綠素和氯化錳的組合物 時，反應前鈣黃綠素與氯化錳中的錳離子結合，體系呈現黃色；當有陽性反應時，副產物焦 磷酸與錳離子結合生成沉淀，鈣黃綠素與體系中的鎂離子結合，顏色逐漸由黃色變為熒光 綠色。觀察反應體系顏色和/或狀態的變化可以直接判定是否發生擴增反應。
[0033] 本發明具有的優點和積極效果是：本發明在LAMP基礎上采用Allele-Specific LAMP技術，針對編碼血紅蛋白β鏈的基因序列設計了特異引物，從而判斷待檢測人群是否 攜帶引起鐮刀形細胞性貧血的基因。
[0034] 與普通PCR相比，本發明提供的檢測引物和組合物，利用Allele-SpecificLAMP 技術，具有以下優點：α)極高的靈敏度，其檢測下限可達幾個拷貝數；（2)易于檢測，無需 借助額外設備。只需觀察反應前后體系狀態的改變即可判定是否有反應的發生；(3)特異 性好，LAMP擴增的引物是針對模板的6個區域設計的4條特異性引物，只有當這四條引物 完全與模板配對時才會引發整個擴增，因此它的特異性要遠遠好于普通的PCR。
[0035] 本發明基于LAMP反應的這些特點，針對血紅蛋白β鏈的野生型和突變型分別設 計特異性引物，可快速準確的檢測鐮形紅細胞貧血。本發明提供的檢測引物及其組合物成 本低廉、檢測時間短、準確性高，易于推廣。
【附圖說明】
[0036] 圖1是檢測樣本1-5經LAMP反應得到的產物的電泳圖。
[0037] 圖2-圖5分別是檢測樣本1-4用PCR-測序法得到的測序圖譜。
【具體實施方式】
[0038] 為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例和附圖對本發明進行進一步的描 述。
[0039] 一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測引物，包括以下引物：
[0040] 5' -GTCGACTGTTGCTTACACTTTC-3'（SEQIDNo. 1，以下簡稱F3)
[0041] 5' -GCCCAGTTTCCATTTGCCT-3'（SEQIDNo. 2,以下簡稱B3)
[0042] 5' -TCTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC-3'（SEQIDNo. 3,以下 簡稱FIPA)
[0043] 5' -ACTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTA