一種高純度重組人血小板源性生長因子bb的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域中一種包含重組人血小板源性生長因子B鏈的融合蛋 白及其編碼基因與重組人血小板源性生長因子BB的制備方法。
【背景技術】
[0002] 人血小板源性生長因子（PDGFs)是貯存于血小板a顆粒中的一種堿性蛋白質。能 刺激停滯于G0/G1期的成纖維細胞、神經膠質細胞、平滑肌細胞等多種細胞進入分裂增殖 周期，它向間質源細胞施以有力的促有絲分裂和趨化活性。TOGFs在胚胎發育、細胞分化和 對組織損傷的反應等過程中具有許多極為重要的作用。它是創面愈合過程中較早出現的生 長因子之一。特別是對一些慢性難愈性傷口，如糖尿病潰瘍、慢性靜脈性潰瘍、壓瘡、放射性 潰瘍等均有明顯促進愈合作用。
[0003] 人血小板源性生長因子在人體內有三種活性形式分別是：TOGF-AA、TOGF-AB、 TOGF-BB，其中TOGF-BB活性最高。TOGF-BB，是一種同源二聚體蛋白質，依靠兩條多肽鏈間 兩對二硫鍵鏈接，同時，兩條多肽鏈鏈內各有三對二硫鍵。
[0004] 1998與1999年美國藥品食品監督管理局（FDA)與歐洲藥品評價局（EMEA)先后 批準酵母表達的重組人血小板源性生長因子BB (rhPDGF-BB)用于糖尿病足的治療，商品名 為貝卡普明。在2005年-2012年間，美國FDA、加拿大、歐盟EMEA、澳大利亞等國先后批準 rhH)GF-BB用于牙齦萎縮及牙骨缺失的治療（商品名為GEM21S)。GEM21S為rhH)GF-BB與 磷酸三鈣的組合醫療器械，用于患處時，rhH)GF-BB可迅速從產品中釋放至患處及周圍 組織中，發揮其趨化性、促細胞分裂的作用，促進牙周組織、成骨細胞再生，并向患處聚集， 形成新牙周組織和牙骨質附著層。
[0005] 盡管rhH)GF-BB在臨床可用于治療糖尿病足和牙周疾病，解決患者疾苦，但是當 前上市產品仍存在質量風險。主要表現為rhH)GF-BB在酵母表達過程中，受蛋白酶作用導 致降解。降解位置主要發生在N端第5和6位氨基酸之間，由于僅相差5個氨基酸，利用目 前的純化方法難以分離，導致成品蛋白質分子中，存在兩條肽鏈N端不均一的產物。在EMEA 對GEM21S的評審報告中，要求研發企業采取有效手段來控制降解產物含量。但是研發企業 盡管采取了工程菌改造、高選擇性色譜純化等手段和措施，在已上市產品中仍然存在N端 不均一產物，并有可能影響產品活性。
[0006] 本發明針對上述技術難題，提供一種新的高純度rhTOGF-BB的制備方法，解決了 上市的同類產品N端不均一及活性等問題。通過融合表達技術，增加降解產物與未降解產 物的理化性質差異，并進一步通過純化徹底分離不均一產物，實現產物N端完全均一。通過 選擇合適的融合標簽，保證其生物活性與天然蛋白一致。且融合標簽為在畢赤酵母中高效 表達的蛋白，同時增加目的蛋白的表達量，明顯提高得率。為rhH)GF-BB與磷酸三鈣組 合，開發三類醫療器械，解決瓶頸技術問題，奠定了基礎。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種優化的編碼重組人血小板源性生長因子B鏈的核酸 分子。
[0008] 本發明的另一目的在于提供一種融合標簽蛋白，該融合標簽分子能促進重組人血 小板源性生長因子BB的表達，且不影響重組人血小板源性生長因子B鏈自發形成具有生物 活性的高級結構。
[0009] 本發明的另一目的在于提供一種宿主細胞，其能夠表達包含上述融合標簽和重組 人血小板源性生長因子B鏈的融合蛋白。
[0010] 本發明的另一目的在于利用上述宿主細胞制備N端完全均一的高純度的重組人 血小板源性生長因子BB。
[0011] 本發明采用的技術方案是：
[0012] 一種經優化的編碼重組人血小板源性生長因子B鏈的核酸分子，其具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；優選地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] -種融合標簽蛋白，包括來源于釀酒酵母的葡糖淀粉酶或其片段；優選地，所述融 合標簽蛋白為來源于釀酒酵母的葡糖淀粉酶（GenBank :AAA20560. 1)的第367-482位氨基 酸，并且其中，所述葡糖淀粉酶的第415位天冬氨酸被突變為絲氨酸，第435位天冬氨酸被 突變為甘氨酸；更優選地，所述融合標簽的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。編碼所述融合 標簽的核酸分子具有SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列；優選地，所述核酸分子的核苷酸序列 如SEQ ID N0. 3所示。所述融合標簽促進重組人血小板源性生長因子BB高效表達，其不影 響重組人血小板源性生長因子B鏈自發形成具有生物活性的同源二聚體高級結構。
[0014] 一種包含重組人血小板源性生長因子B鏈的融合蛋白，其為通過接頭（Linker)將 上述融合標簽融合至所述人血小板源性生長因子B鏈N端，其中所述接頭包含酶切位點； 優選地，所述酶切位點位于接頭C端；優選地，所述酶切位點為腸激酶酶切位點；優選地，所 述接頭還包含柔性連接肽-(GGS) n-、組氨酸標簽或其組合；優選地，所述接頭的氨基酸序 列為-GGSHHHHHHGGSGGSGSEFDDDDK-，其編碼核酸序列為 GGAGGITCCCATCACCATCACCATCACGG AGGTTCTGGAGGTTCTGGTTCCGAATTCGATGACGATGACAAG ;優選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0. 4所示；優選地，所述融合蛋白以單體或二聚體形式存在。編碼所述融合蛋白的 核酸分子，優選地，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。
[0015] -種包含編碼上述融合蛋白的核酸分子的載體。優選地，所述載體為表達載體；優 選地，所述表達載體選自PPIC9、pPIC9K、pPICZ a A、pPICZ a B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、 pPICZC或pPIC3. 5K。
[0016] -種包含所述載體的宿主細胞，其能夠表達所述融合蛋白。優選地，所述宿主細胞 為細菌或真菌；優選地，所述宿主細胞為酵母；優選地，所述宿主細胞為畢赤酵母；優選地， 所述畢赤酵母選自GS115、X-33、KM71或SMD1168。。
[0017] -種制備所述融合蛋白的方法，其包括，培養所述的宿主細胞，和，從所述宿主細 胞的培養物中回收所述融合蛋白；優選地，所述融合蛋白被分泌到宿主細胞的胞外或者在 宿主細胞的胞內表達。
[0018] -種重組人血小板源性生長因子BB的制備方法，其主要步驟包括：
[0019] 1)培養表達所述融合蛋白的宿主細胞；
[0020] 2)從所述宿主細胞的培養物中回收所述融合蛋白；
[0021] 3)對回收的融合蛋白進行酶切，并從酶切產物中回收重組人血小板源性生長因子 BB；
[0022] 優選地，所述融合蛋白經腸激酶酶切。
[0023] 本發明的有益效果是：
[0024] 通過接頭將融合標簽融合至人血小板源性生長因子B鏈N端形成融合蛋白，進行 融合表達，使得發生降解和未降解產物理化性質差距拉大，從而利用純化手段將發生降解 和未降解產物完全分離，得到N端完全均一的人血小板源性生長因子BB，解決了目前國內 外存在的技術難題。
[0025] 通過接頭序列-GGSHHHHHHGGSGGSGSEFDDDDK-實現融合表達，其包含柔性連接 肽-(GGS) n-，使得融合標簽未對目的蛋白高級結構的形成造成影響，重組人血小板源性生 長因子B鏈能自發形成具有生物活性的同源二聚體；包含組氨酸標簽，利于純化，提高收 率；包含腸激酶位點-DDDDK-，使得融合標簽被有效去除，最終獲得的重組人血小板源性生 長因子BB的N端序列與天然hPDGF-BB完全一致。
[0026] 對編碼人血小板源性生長因子B鏈的核酸及編碼融合標簽的核酸的核苷酸序列 進行優化，同時選擇的融合標簽為可以在宿主細胞，尤其是畢赤酵母中實現高效表達的釀 酒酵母葡糖淀粉酶或其片段，使得重組人血小板源性生長因子BB高效表達。
[0027] 利用本發明的方法制備重組人血小板源性生長因子BB，rhTOGF-BB表達量不低于 可溶蛋白的20 %。最終得率為500mg/L發酵液，N端完全均一，純度大于98 %，生物活性為 80萬IU/mg-100萬IU/mg，內毒素小于0. 5EU/mg。制備的rhH)GF-BB滿足與0 -磷酸三鈣 組合，用于三類醫療器械開發的需求。
[0028] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進一步詳細說明。應當理解，此處說描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于 限定本發明。
【附圖說明】
[0029] 圖1為優化的人TOGF-B基因序列與天然TOGF-B基因序列比對分析（優化：優化后 的F>DGF-B基因序列；天然：GenBanK公布的天然F>DGF-B基因序列；Consensus:相同序列）
[0030] 圖2為優化的人TOGF-B基因序列編碼的氨基酸序列與天然TOGF-B的氨基酸序列 比對分析（優化seq:優化后的TOGF-B基因編碼的氨基酸序列；天然seq :GenBanK公布的 天然I^DGF-B氨基酸序列；Consensus:相同序列）
[0031] 圖3為本發明構建的表達質粒pPIC9-PDGF的結構圖；
[0032]圖4為本發明構建的畢赤酵母表達工程菌搖瓶誘導篩選結果；
[0033] 圖5為原液SDS-PAGE非還原性電泳純度檢測結果，M為蛋白質分子量標準，1泳道 和2泳道為經純化超濾脫鹽獲得的原液，電泳進樣量分別為5 y 1和10 y 1，純度大于98%;
[0034] 圖6為原液SDS-PAGE還原性電泳檢測結果，M為蛋白質分子量標準，1泳道為原液 還原性電泳檢測結果，表觀分子量為14kD;
[0035] 圖7為原液SEC-HPLC檢測結果，純度大于98 % ;
[0036] 圖8為原液生物活性測定標準曲線。
【具體實施方式】
[0037] 實施例1重組人血小板源性生長因子BB融合蛋白工程菌構建
[0038] 1、pPIC9-PDGF/GS115 工程菌構建
[0039] 人血小板源性生長因子BB單鏈全長序列為241個氨基酸。成熟蛋白序列為去掉 信號肽和前導肽的序列，包括第82位至190位序列，共109個氨基酸。優化改造人血小板 源性生長因子BB成熟蛋白的基因序列，綜合考慮在畢赤酵母中表達的密碼子偏好性、基因 GC含量、CpG含量、mRNA二級結構、序列內含子剪接位點、RNA結構不穩定序列、非轉錄終止 區的轉錄終止序列、長的重復序列等與基因表達序列相關的因素。對核酸序列進行同義突 變，優化后的基因序列如SEQ ID NO. 1所示，其與天然的人TOGF-B序列（GenBank登錄號： AH003517. 1)不同，只有74%同一性，如圖1所示。但優化基因編碼的氨基酸序列與天然序 列保持一致，如圖2所示。
[0040] 融合標簽選取來源于釀酒酵母葡糖淀粉酶（GenBank :AAA20560. 1)的第367-482 位氨基酸，并將415位天冬氨酸突變為絲氨酸，435位天冬氨酸突變為甘氨酸，其氨基酸序 列如SEQ ID N0. 2所示。并根據上述基因序列優化方法進行基因優化，優化后的編碼基因 核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。
[0041]選擇接頭序列-GGSHHHHHHGGSGGSGSEFDDDDK-，對應的核酸序列為 GGAGGTTCCCATC ACCATCACCATCACGGAGGITCTGGAGGITCTGGITCCGAATTCGATGACGATGACAAG。用接頭將人血小板源 性生長因子B鏈的N端連接上融合標簽，所獲融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。 所述融合蛋白的編碼核酸序列如SEQ ID N0. 5所示。其通過在所述融合蛋白對應的編碼核 酸序列的5'端加h.序列CTCGAG[