病毒滅活的生物混合物的制作方法
【技術領域】
[0001] -般來將，本發明涉及病毒滅活的生物液體或干燥混合物，并且涉及其制備。主要 地，本發明涉及但不限于病毒滅活的血小板提取物及其制備。
【背景技術】
[0002] 血小板是在止血和愈合中發揮基礎作用的小的、形狀不規則的無核細胞。血小板 包含完整的預合成蛋白陣列，其中包括信號蛋白、細胞骨架蛋白、膜蛋白和調節蛋白。它們 參與損傷部位處的組織再生和愈合過程的關鍵階段中，這主要是由于包含大量生物活性分 子（包括生長因子（GF)、細胞因子和趨化因子）的血小板顆粒內容物。
[0003] 諸如血小板衍生生長因子（PDGF)、轉化生長因子（TGF)、堿性成纖維細胞生長因 子（bFGF)、血管內皮生長因子（VEGF)之類的血小板生長因子在傷口愈合級聯的以下全部 階段中起關鍵作用：炎癥、增殖和重塑階段。
[0004] 研宄已表明，血小板衍生的生長因子刺激血管生成、有絲分裂發生、細胞增殖、中 性粒細胞和巨噬細胞、膠原合成、傷口收縮、細胞外基質合成、上皮形成和趨化作用。
[0005] 血小板通常通過輸注使用來例如促進止血。最近，血小板越來越多地以富血 小板血漿（PRP)的形式使用，其也稱為PRP凝膠、血小板凝膠、PRP凝塊等。通常，PRP 是由在有限體積的血漿中濃縮的自體血小板構成的間接體內制劑（Lacci KM，Dardik A.Platelet-rich plasma ：support for its use in wound healing.Yale J Biol Med. 2010 年 3 月；83 (I) :1-9)。
[0006] 對于局部施用，PRP通常通過添加凝血酶和/或CaCl2，從而通過凝血酶（內源性 或外源性的）與纖維蛋白原之間的相互作用形成纖維蛋白凝膠而活化。活化時，血小板發 生活性脫顆粒作用，并釋放出各種調節劑，包括GF (Lacci KM，Dardik A，2010)。PRP的注射 用途目前構成了小規模但快速成長的細分市場。將PRP用于軟和硬組織填充的基本原理是 其可能增強不愈性損傷中的組織再生、加速傷口成熟、血管形成和上皮形成、減少疤痕形成 以及減少術后并發癥和發病率（Lacci KM，Dardik A，2010)。
[0007] 連同各種細胞類型使用活化的PRP的研宄已表明從PRP釋放的因子例如 生長因子可誘導細胞增殖[(例如Kanno等人，Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation.J Oral Maxillofac Surg. 2005 年 3 月；63 (3) :362-9 ;Bertrand_Duchesne 等人，Epidermal growth factor released from platelet-rich plasma promotes endothelial cell proliferation in vitro. J Periodontal Res. 2010 年 2 月；45 (I) :87-93 ;Kakudo 等人， Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 2008 年 11 月； 122(5) :1352-60)，調節人內皮細胞的血管生成能力（Sulpice等人，Cross-talk between the VEGF-A and HGF signalling pathways in endothelial cells.Biol Cell. 2009年9 月；101 (9) :525-39 ;Rughetti 等人，Platelet gel-released supernatant modulates the angiogenic capability of human endothelial cells. Blood Transfus.2008 年 I 月； 6(1) :12-7)，并且引發骨誘導性能（Intini G. The use of platelet-rich plasma in bone reconstruction therapy. Biomaterials· 2009 年 10 月；30 (28) :4956-66)]。此外，據發現， 在與胎牛血清支持的水平相當或更高的水平下，活化的PRP支持體外細胞生長并維持多個 目標細胞的生存能力，所述目標細胞包括骨髓瘤、雜交瘤、肝細胞、成纖維細胞和上皮細胞 (Johansson等人，Platelet lysate ：a replacement for fetal bovine serum in animal cell culture? Cytotechnology. 2003 年 7 月；42 (2) :67_74)〇
[0008] PRP及釋放的生長因子目前用于多種組織再生手術，主要是骨科和牙科手術 (Nurden 等人，Platelets and wound healing. Front Biosci.2008 年 5 月 1 日；13 : 3532-48)。在骨科手術中，PRP主要用于膝關節成形術、腰椎融合和椎間盤退變（見Nurden 等人2008年的綜述）。牙科學和頒面外科學PRP應用主要包括鈦種植體的鞏固、上頒竇提升 和骨重塑（見Nurden等人2008年的綜述）。PRP還越來越多地用于肌腱和韌帶修復、面部 整形和重建手術、慢性皮膚傷口愈合、眼科學、面神經再生以及心臟和減肥手術（見Nurden 等人2008年的綜述）。
[0009] 然而，自體PRP及釋放因子的當前應用的主要缺點在于缺乏標準化。值得注意 的是，可以商購獲得參數，諸如制備時間、血小板收率和采集效率，不同的用于制備PRP的 不同人工、半自動和全自動系統（Mazzucco等人，Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations :Fibrinet，RegenPRP-Kit，Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 2009 年 8 月；97 (2) :110-8)〇
[0010] 另一個重要的變量是用于血小板活化的技術[自體、異源或重組凝血酶，氯化鈣 或巴曲酶（Rozman P，Bolta Z. Use of platelet growth factors in treating wounds and soft-tissue injuries. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat. 2007 年 12 月； 16(4) :156-65)]，其可影響顆粒釋放效率和分泌的GF的量（Rozman P，Bolta Z，2007)。此 外，由于血小板對機械應力和周圍環境的變化非常敏感，因此，它們可在預期活化步驟之 前，在加工過程中活化并釋放GF(Mazzucco等人，2009)。這種不受控制的活化可進一步增 加在使用不同PRP制備系統時最終產品組成的變化。另外，自體PRP制劑的一個主要固有 弱點在于血小板GF含量在個體中不同，并因此可導致次最佳的結果。最后，當處理自體PRP 時，應考慮專用設備、一次性PRP加工試劑盒以及對專門人才的需要所造成的經濟負擔。
[0011]
【背景技術】包括 Su 等人"A virally inactivated functional growth factor preparation from human platelet concentrates" · Vox Sang. 2009 年 8 月；97 (2)： 119-128 ；Burnouf 等人"A novel virally inactivated human platelet lysate preparation rich in TGF-beta，EGF and IGF，and depleted of PDGF and VEGF". Biotechnol Appl Biochem. 2010 年 8 月 6 日；56 (4) :151-60 ;和美國專利公開 US 。

【發明內容】

[0012] 在一個方面，本發明涉及一種用于制備病毒安全生物液體混合物的方法，所述方 法包括以下步驟：提供生物液體混合物；進行溶劑/洗滌劑（S/D)病毒滅活處理；使經S/D 處理的混合物與兩親性聚合物接觸；通過疏水作用色譜（HIC)和/或通過油提取移除S/D ; 收集包含來自HIC的流過級分和/或來自油提取的液體級分的材料；以及使材料經受至少 再一次正交病毒滅活處理。
[0013] 在本發明的一個實施例中，兩親性聚合物為無毒的。
[0014] 然而，在本發明的另一個實施例中，兩親性聚合物為烴基表面活性劑。
[0015] 然而，在本發明的另一個實施例中，兩親性聚合物具有約3. 5千道爾至小于約40 千道爾頓范圍內的平均分子量。
[0016] 在本發明的一個實施例中，平均分子量為約30千道爾頓。
[0017] 然而，在本發明的另一個實施例中，烴基表面活性劑為聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0018] 在本發明的一個實施例中，PVP具有約30千道爾頓（kDa)的平均分子量。
[0019] 在本發明的一個實施例中，HIC包括以下步驟：將經S/D處理的和聚合物接觸的混 合物上樣到HIC ;利用包含有機溶劑和/或鹽的溶液進行洗滌；以及收集經洗滌的級分。
[0020] 在本發明的一個實施例中，有機溶劑為乙醇。
[0021] 在本發明的一個實施例中，鹽為氯化鈉。
[0022] 在本發明的另一個實施例中，所述至少再一次正交病毒滅活處理包括熱滅活。
[0023] 在本發明的一個實施例中，所述方法還包括濃縮材料的步驟。
[0024] 在本發明的一個實施例中，所述方法用于制備病毒安全血小板提取物，并且生物 液體混合物為富含血小板的級分。
[0025] 在本發明的一個實施例中，所收集的材料包含與HIC洗滌級分混合的HIC流過級 分。
[0026] 在另一方面，本發明涉及一種可根據本發明的方法獲得的病毒安全生物液體混合 物。
[0027] 在本發明的一個實施例中，PVP K25的濃度在0· 1% (w/w)至低于1% (w/w)的范 圍內。
[0028] 在本發明的某些實施例中，PVP K25的濃度在0. 1% (w/w)至0. 5% (w/w)范圍內。
[0029] 在本發明的一個實施例中，病毒安全生物液體混合物中的PVP K17、K25、K30濃度 在 0.01-5 % (w/w)范圍內。
[0030] 在本發明的某些實施例中，生物液體混合物為富含H)GF-AB、TOGF-BB、EGF、VEGF 和/或bFGF的血小板提取物。
[0031] 在另一方面，本發明涉及從包含溶劑-洗滌劑（S/D)的生物液體混合物移除S/D 的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含S/D的混合物；使混合物與兩親性聚合物接觸； 通過疏水作用色譜（HIC)和/或通過油提取從混合物移除S/D ;以及收集包含來自HIC的 流過級分和/或來自油提取的液體級分的材料。
[0032] 在本發明的一個實施例中，兩親性聚合物為無毒的。
[0033] 在本發明的一個實施例中，生物液體混合物為富含血小板的級分。
[0034] 在本發明的另一個實施例中，混合物包含趨化因子、細胞因子、生長因子、營養因 子或者它們的混合物。
[0035] 在本發明的一個實施例中，HIC包括以下步驟：利用包含有機溶劑和/或鹽的溶液 進行洗滌；以及收集經洗滌的級分。
[0036] 在本發明的一個實施例中，兩親性聚合物為烴基表面活性劑。
[0037] 在本發明的一個實施例中，烴基表面活性劑為聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0038] 在本發明的一個實施例中，有機溶劑為乙醇。
[0039] 在本發明的一個實施例中，鹽為氯化鈉。
[0040] 在本發明的一個實施例中，所收集的材料包含與洗滌級分混合的流過級分。
[0041] 在本方法的一個實施例中，源首先與S/D進行接觸，然后與兩親性聚合物進行接 觸。
[0042] 在本方法的一些實施例中，經S/D處理的源中的PVP濃度在約0. 01至0. 9mM、0. 01 至0. 3mM、或者0. 025至0. 3mM的范圍內。
[0043] 在本方法的一些實施例中，經S/D處理的源中的HPMC濃度在約0. 01至0. 3mM范 圍內。
[0044] 在一些實施例中，所述方法還包括干燥材料的步驟，從而導致生物干燥混合物。
[0045] 在某一方面，公開了一種用于從生物源制備生物液體混合物組合物的方法。所述 方法包括以下步驟：提供源；提供PVP和/或HPMC ;利用溶劑洗滌劑（S/D)處理源以允許病 毒滅活，并且利用PVP和/或HPMC進行處理；通過使經處理的源與疏水作用色譜（HIC)樹 脂接觸來移除S/D ;以及收集包含來自HIC的未結合級分的材料。
[0046] 在某一方面，公開了一種可根據本發明所公開的方法獲得的生物液體混合物組合 物。
[0047] 在一個實施例中，組合物包括約0. 07至6mM、0. 07至2mM或者0. 17至2mM的范圍 內的PVP濃度。
[0048] 在另一個實施例中，組合物包括約0. 07至I. 5mM范圍內的HPMC濃度。
[0049] 在某一方面，公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含兩親性聚合物；選自趨 化因子、生長因子、細胞因子、營養因子及其混合物的血小板衍生蛋白質；和藥學上可接受 的載體，其中所述兩親性聚合物為濃度在約〇. 07至6mM的范圍內的PVP或濃度在約0. 07 至I. 5mM的范圍內的HPMC。
【附圖說明】
[0050] 圖1示出了利用在S/D移除（處理2和處理4)之前通過使裂解物與肝素接觸獲 得的血小板提取物處理的3T3成纖維細胞的增殖。在S/D移除之前裂解物未與肝素接觸的 前提下制備的血小板提取物用作對照組（處理1和3)。
[0051] 圖2示出了利用在S/D移除（處理2)之前或期間通過使裂解物與低分子量肝素 (LMWH)接觸制備的血小板提取物處理的3T3成纖維細胞的增殖。在S/D移除之后在不存在 裂解物與低分子量肝素（LMWH)接觸的前提下獲得的血小板提取物用作對照組（處理1)。
[0052] 圖3示出了利用在S/D移除之后在存在不同分子量PVP聚合物的情況下獲得的提 取物處理的3T3成纖維細胞的增殖：PVP K25-處理3 ;或者PVP K30-處理7。
[0053] 圖4示出了利用包括不同濃度PVP的提取物處理的3T3成纖維細胞的增殖。樣 品17 (處理17)和樣品19 (處理19)在S/D移除的第二洗滌方面為不同的，其中分別使用 0· 1%和 0· 5%的 PVP。
[0054] 圖5示出了利用在PVP K25(處理1)存在下S/D移除之后或者在肝素（處理2) 存在下S/D移除之后獲得的大規模血小板提取物處理的3T3成纖維細胞的增殖。
[0055] 此外，所有圖包括通過GraphPad Prism軟件計算的R2擬合，半數有效濃度（EC50) 和95%置信區間EC50值。
[0056] 圖6示出了執行手術后2星期時的大鼠背側皮瓣（3X IOcm)。沿頭至尾的方向抬 高皮瓣。A，B，C，D和E被采用樣品用于組織學分析的不同區域。A最靠近尾側皮瓣附接部 分，并且因此愈合最好，而E處于皮瓣的頭部，其顯示最高程度的壞死（黑色）。通過腹側中 線切口（沿皮瓣中心的線）移除腹部和胸部臟器。
[0057] 圖7示出了正常和愈合皮膚的典型著色圖案：H&E著色（表皮增生，分數1并且表 皮完全愈合處理后，分數0)，真皮和表皮增殖的PCNA著色（增殖組織，分數1并且正常組 織，分數〇)以及角蛋白6著色（上基底著色，分數1，對于愈合，并且對于正常皮膚的基部著 色，分數〇)。
[0058] 圖8示出了 2周后大鼠背側皮瓣附著性等級的分數，在通過利用組織鑷子輕輕地 牽拉區域A_C(參見圖6)中的皮瓣遠離創面來對其進行測試時。將皮瓣附接到下層組織與 皮膚的正常區域的附接對比，并且如下將等級分為1至3 :1 =皮瓣與下層組織之間無粘附 性至低附著性，2 =皮瓣與下層組織之間低于但接近正常粘著性，或者3 =皮瓣與下層組織 之的約正常粘著性。
【具體實施方式】
[0059] 本發明涉及一種用于制備病毒安全生物液體混合物諸如病毒安全的血小板提取 物的方法。血小板包含涉及組織再生和愈合過程的關鍵階段的一整套因子。目前，將完整 的自體活化血小板（來源于患者）用于促進傷口愈合。然而，使用完整的自體血小板存在 多個缺點，特別是缺乏標準化；愈合所需的因子在患者自身的血小板中可能缺乏；制備血 小板因子混合物需要專用設備；程序耗時并且需要對患者自身進行附加步驟；以及需要經 過醫學培訓的人員。這些問題可例如通過使用由多個供體制得的血小板提取物來解決。
[0060] 然而，來源于人類血液的產品可存有傳播感染原諸如病毒的風險。有效地降低病 毒傳播風險可通過包括至少兩次正交病毒滅活步驟而實現。另外，在血小板提取物的制造 中包括附加步驟可影響其中所含因子的回收率和活性。
[0061] 病毒滅活的這些方法中的一個為"溶劑洗滌劑（S/D)病毒滅活處理"。
[0062] 這種滅活包括利用S/D處理和移除S/D。根據本發明可發現，在通過HIC移除S/D 之后某些生長因子的回收率受損。
[0063] 根據本發明可發現，可通過在移除S/D之前和/或期間使經S/D處理的材料與聚 乙烯吡咯烷酮（PVP)或羥丙基甲基纖維素（HPMC) (PVP和HPMC均為無毒兩親性分子）接觸 來增加某些血小板因子例如I3DGF-AB JDGF-BB ;和bFGF的回收率。
[0064] 根據本發明可發現，使經S/D處理的材料與PVP和HPMC接觸導致TOGF-AB和其他 血小板因子例如I 3DGF-BB和bFGF增加的回收率或富集。
[0065] 在S/D移除期間，從使經S/D處理的材料與肝素和低分子量肝素（兩者皆已知為 綁定特定生長因子）接觸來增加因子的回收率，同時從使經S/D處理的材料與PVP接觸的 角度來講，這些發現為令人驚訝的，所述PVP為完全不同的化合物（具有兩親性特性），其具 有S/D移除期間對生長因子回收率相似的有利影響。
[0066] 另外，這些發現令人驚訝，因為添加 PVP K30、K25、K17和K12在某些測試條件下不 影響S/D移除。
[0067] 據發現，利用根據本發明的方法從包括源自血小板的因子混合物的源移除S/D導 致高因子回收率、高生物活性和有效的S/D移除。
[0068] 據發現，在S/D移除期間利用PVP Κ12、Κ17、Κ30或PVP Κ25增加血小板生長/營 養因子的回收率。據發現，利用Κ30的回收率高于利用Κ25的回收率。利用PVP Κ25獲得 并且因此包括PVP Κ25的材料比利用PVP Κ30獲得包括PVP Κ30的材料具有更高的增殖活 性。
[0069] 結果還顯示，可能的是，使與血小板因子混合物接觸的PVP Κ25濃度降低到低于 0. 5%或0. 17mM(從而使PVP在S/D移除后獲得的提取物中降低到低于0. 5%或0. 17mM)， 并且仍獲得因子回收率的增加同時維持HIC的能力以有效地移除S/D。
[0070] 結果顯示，提取物中不同量的PVP K25,例如0. 1% (0. 03mM)和0. 5% (0. 17mM)不 影響其活性。
[0071] 結果顯示，不同于處于一定濃度的肝素和硫酸葡聚糖，最終提取物中PVP的存在 不抑制凝血酶活性。當將纖維蛋白粘合劑用作血小板提取物（"血小板提取物"為一種生 物液體混合物組合物）的遞送劑時，PVP的這種特性是特別重要的。
[0072] 結果顯示，在存在PVP K25的情況下在大規模處理中生長因子回收率和活性相當 于小規模中的那些。
[0073] 這些結果表明，在S/D移除期間可有利地使用PVP以便獲得具有增加的生物效能 的最終提取物，前提條件是所使用PVP的類型及其濃度（例如，混合物中PVP的w/w或摩爾 濃度）不影響S/D移除。
[0074] 在一個實施例中，在S/D移除步驟期間使生物源與PVP (PVP與乙醇和氯化鈉混合） 接觸之后，獲得了血小板提取物。提取物包括roGF-AB/TGF-β I TDGF-AB/VEGF JGF-β 1/ bFGF ;和VEGF/bFGF比率，這些比率類似于經洗滌的白細胞減除單采血小板（WAP-LR)的原 料中和S/D移除之前材料中的比率。
[0075] 這些發現為制備根據本發明的生物液體混合物組合物提供了準備。
[0076] 本發明的方法允許制備下述血小板提取物，該血小板提取物在S/D移除之后具有 細胞因子、生長因子、趨化因子和/或營養因子增加的回收率。
[0077] 本發明公開了一種用于從生物源制備病毒安全生物液體混合物組合物的方法，該 方法包括以下步驟：提供源；提供兩親性聚合物；利用溶劑洗滌劑（S/D)處理源以允許病毒 滅活，并且利用兩親性聚合物進行處理；
[0078] 通過使經處理的源與疏水作用色譜（HIC)樹脂接觸來移除S/D ;以及收集包含來 自HIC的未結合級分的材料；其中該方法包括至少再一次正交病毒滅活處理，從而獲得病 毒安全生物液體混合物組合物。
[0079] 在一個方面，本發明提供用于制備病毒安全生物液體混合物的方法，該方法包括 以下步驟：
[0080] 提供源；進行溶劑/洗滌劑（S/D)病毒滅活處理；
[0081] 使經S/D處理的材料與無毒的兩親性聚合物接觸；通過疏水作用色譜（HIC)和/ 或通過油提取來移除S/D ;和使材料經受至少再一次正交病毒滅活處理。
[0082] 源的實例包括但不限于體液，諸如血液；血液級分、冷沉淀物、細胞培養物、親脂性 蛋白劑；細胞、細胞粒子和/或細胞器；細胞裂解物；血小板裂解物；血沉棕黃層；動物組織 提取物，諸如牛肺、牛腸或動物骨提取物明膠、牛血清白蛋白，以及來源于動物的與水不混 溶的脂肪，諸如羊毛脂。源可源自多個供體。
[0083] 在一個方面，本發明公開了一種用于從包含S/D的生物源中移除溶劑-洗滌劑（S/ D)的方法，該方法包括以下步驟：提供源；提供兩親性聚合物；利用S/D并且利用兩親性聚 合物處理源；通過使經處理的源與疏水作用色譜（HIC)樹脂接觸從生物源中移除S/D ;以及 收集包含來自HIC的未結合級分的材料。
[0084] 在一個實施例中，移除S/D的方法省略了油提取的另外的步驟。
[0085] 已發現，本發明的方法可用于在不存在油提取分離的步驟情況下移除S/D。
[0086] 在一個實施例中，本發明涉及一種用于制備病毒安全的血小板提取物的方法，該 方法包括以下步驟：提供來自多于一個供體的富含血小板的級分；進行溶