一種快速去細胞單葉肝臟生物支架的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及器官組織去細胞化領域，具體涉及一種快速單葉肝臟去細胞生物支架 的制備方法。
【背景技術】
[0002] 細胞外基質（extracellular matrix，ECM)是填塞于細胞間的物質，其成分除水、 電解質、少量液相成分外，主要還有膠原、粘蛋白和蛋白多糖等，它們共同構成了細胞生長 的微環境。肝細胞局部微環境是由細胞外基質和基質細胞分泌的多種細胞因子包括肝細胞 生長因子（HGF)、血管內皮生長因子（VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)、表皮生長因 子（EGF)、轉化生長因子（TGF-P)以及血小板源性生長因子（PDGF)等構成。其中ECM不但 為肝內細胞生長提供了三維空間結構，并對細胞的增殖、分化和迀移有著重要的調控作用
[1]。因此，ECM是肝臟組織工程中支架材料的研究出發點。去細胞肝臟制備技術的出現為 研究肝內結構型ECM的生物學效應提供了一個全新的技術平臺，同時也為肝臟組織工程提 供了一種全新的生物材料。去細胞技術是通過物理（凍融）、化學（SDS)以及生物酶（胰蛋 白酶）等方法將細胞從組織或器官中去除而不造成ECM成分、生物學活性和機械性質的改 變[2]。天然的去細胞肝臟生物支架空間結構與肝內ECM排列非常類似[3,4];保留了完整 的三維空間結構，可為細胞提供粘附、生長、分化、增殖相關信號；具有良好的生物相容性及 低免疫原性[5,6];此外還保留部分有活性的細胞因子如HGF，因此被廣泛運用。 2010年以來國外學者雖然利用不同去垢劑灌注成功制備全肝去細胞生物支架[4， 7-11]，但灌注通路與方案缺乏統一的標準，這會對去細胞肝臟生物支架的制備質量和穩定 性造成嚴重影響。由于肝臟三維結構復雜，由門靜脈和肝動脈組成的雙重供血系統，并且供 應各肝葉血流的血管管徑不完全一致，從肝動脈或門靜脈主干進行灌注無法使各肝葉均達 到一致的去細胞效果。目前已有學者開始嘗試去細胞單葉肝臟，Hussein等[12]使用0. 1 % 十二烷基硫酸鈉（SDS)通過行右外側肝葉的門靜脈分支的灌注制備出豬單葉肝臟生物支 架。 目前國內外制備去細胞肝臟生物支架的去垢劑主要有Triton、SDS等。但SDS作為常 用的去垢劑，其殘留會導致組織移植后易形成血栓，并且去細胞組織在復細胞化過程中低 再植率等問題[13]。因此本研究主要采用弱堿性的Triton溶液灌注法制備去細胞左外葉 肝臟生物支架。NaOH的加入可使中性的Triton溶液呈弱堿性，增強其裂解移除細胞的效 果，縮短去除細胞所需時間。制備的去細胞左外葉肝臟細胞外基質支架經DNA、ELISA、掃描 電鏡、透射電鏡、組織化學、血管鑄型等鑒定，結果表明肝內細胞基本被完全去除，肝內ECM 成分（如FN、LN、IV型膠原等）和肝內脈管的三維空間結構得到完整保留，完成了左外葉肝 臟生物支架的制備。

【發明內容】

[0003] 為了解決現有技術的缺點，本發明以大鼠肝臟為研究對象，采用一種快速新型的 單葉肝臟去細胞化流程來制作去細胞生物支架，并檢測其形態結構與成分，探討一種去細 胞生物支架在肝臟疾病治療中的新的應用模式。本發明提供了設計并獲得一種快速去細胞 單葉肝臟生物支架的制備方法，通過含有氫氧化鈉的Triton-IOO溶液作為去垢劑，制備去 細胞單葉肝臟生物支架。 一種快速去細胞單葉肝臟生物支架的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟： (1) 在離體肝臟的肝動脈用24G留置針插管，用肝素PBS溶液沖洗肝臟內殘余血液，至 肝臟呈均一土黃色； (2) 用小號灌胃針插入到門靜脈的左外葉肝臟分支并固定，在恒溫37°C下依次持續灌 注400ml含有0. 06% NaOH的1 % Trltion X ? 100溶液2~3h，及含青、鏈霉素的PBS溶 液，灌注速度均為3ml/min，灌注過程中觀察單葉肝臟顏色及形態的變化，待肝臟顏色變成 半透明狀，其中可觀察到肝內脈管的分支，即得單葉肝臟生物去細胞支架，將制得的單葉肝 臟生物去細胞支架于_80°C條件下保存。 所述的步驟（2)中灌注時的灌注壓為3. 6mmHg。 所述的步驟（2)中含青、鏈霉素的PBS溶液濃度為105IU/L。 所述的步驟（2)中灌注含青、鏈霉素的PBS溶液的灌注時間為lh。 本發明的有益效果是：本發明提供了一種快速去細胞單葉肝臟生物支架的制備方法， 不使用存在對組織移植后易形成血栓和去細胞組織在復細胞化過程中低再植率等問題 離子型去垢劑SDS，采用弱堿性的Triton溶液灌注法制備去細胞左外葉肝臟生物支架， Triton溶液中NaOH的加入可使中性的Triton溶液呈弱堿性，增強細胞裂解移除的效果，縮 短去除細胞所需時間，且使用NaOH配合Triton具有溶液時間短，所需濃度低，對細胞外基 質無損害，這是其它堿性物質配合Triton溶液在肝臟去細胞化所不具備功能，并且采用了 最佳的NaOH的與Trltion溶液的濃度和用量，使去細胞化效果最佳，制備的去細胞左外葉 肝臟細胞外基質支架經DNA、ELISA、掃描電鏡、透射電鏡、組織化學、血管鑄型等鑒定，結果 表明能較完全地去除肝組織細胞，完整地保留ECM成分（FN、LN、IV型膠原等）及血管網絡 的三維空間結構，完成了左外葉肝臟生物支架的制備。 【附圖說明】 圖1為本發明細胞單葉肝臟顏色及形態的變化圖； 圖2為本發明DNA含量曲線圖； 圖3為本發明Elisa量化分析圖； 圖4為本發明掃描電鏡和透射電鏡觀察圖（A.掃描電鏡；B.透射電鏡，標尺不2 ym); 圖5為本發明肝組織HE染色及PAS染色圖； 圖6為本發明肝臟血管鑄型圖（A.對照組B.去細胞組標尺示5_) 【具體實施方式】 SD大鼠全肝的獲取 健康成年SD大鼠，稱重，按0. 3~0. 4ml/100gl0 %水合氯醛行腹腔注射麻醉，起效后固 定，打開腹腔，分離出下腔靜脈，注射肝素鈉溶液行全身肝素化處理。找到位于肝臟下方的 肝門，分離肝動脈、膽管和門靜脈，離斷膽管，結扎肝動脈、門靜脈起始處并離斷，同時離斷 肝靜脈，分離肝臟與膈肌相連的部分，取下肝臟，一組肝臟進行灌注去細胞化處理，另一組 肝臟保存于-80°C作為對照組。 去細胞單葉肝臟生物支架的制備 (1) 將一組肝臟保存于-80°C