裂霉素C的成纖維細胞培養液，培養箱中孵育。孵育完后用PBS洗5遍，用0.25%胰蛋白酶將貼壁的成纖維細胞消化下來，收集細胞。重懸細胞后，轉入24孔貼壁培養板，每孔接種6-8 X 14個成纖維細胞，幾乎全部細胞貼壁后可用來做飼養層細胞。
[0020]第四步:擬胚體細胞與小鼠成纖維細胞共培養向原始生殖細胞分化
培養的擬胚體，用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化成單細胞，加入少量原始生殖細胞培養液懸浮細胞，將細胞稀釋為15個cells/ml原始生殖細胞。棄去鋪好小鼠胚胎成纖維細胞培養皿中的培養液，用原始生殖細胞培養液培養重懸的細胞培養，每個孔500 μ I培養液，37°C、飽和濕度、5% C02條件下培養。兩天以后，待到幾乎全部的細胞貼壁生長，在不弄壞培養皿底部飼養層細胞的基礎上，用移液槍吸走全部的培養液，加入500 μ I新的含有2μM的視黃酸的原始生殖細胞培養液，繼續培養，此后每兩天換半液，即吸出200 μ I培養液，加入250 μ I預暖的新鮮原始生殖細胞培養液，培養至第4天之后，原始生殖細胞開始大量出現。。
[0021]原始生殖細胞培養液:DMEM高糖+10% FBS +0.23 mM丙酮酸鈉+0.1 mM非必需氨基酸 +2 mM L-谷氨酰胺 +0.1 mM 疏基乙醇 +20 ng/ml EGF +40 ng/ml bFGF +40ng/ml SCF +1%青鏈霉素。
[0022]實施例二:
第一步:小鼠皮膚干細胞的分離培養
收集出生當天小鼠，用剪刀和鑷子將小鼠背部皮膚整塊撕下來，去掉脂肪和血液，將干凈的皮膚組織用PBS洗三遍，剪成1-2 mm2左右的碎片，剪碎的組織加入1ml PBS1500rpm離心5min，棄上清，加加I ml 0.25% Trypsin+0.04% EDTA消化液后，用槍頭攪拌混勻，置于37°C、飽和濕度、5% C02培養箱中消化20-30 min,消化后棄掉消化液，使用40 μ m細胞濾器過濾細胞，收集單細胞。加I ml皮膚干細胞培養液重懸細胞，將細胞再次過150目細胞篩。將細胞接種到10mm懸浮培養版上，在5% 二氧化碳培養箱中培養。
[0023]小鼠皮膚干細胞培養液:DMEM/F12 +2% B-27 +20 ng/ml EGF +40 ng/ml bFGF+1%青鏈霉素。
[0024]第二步:小鼠皮膚干細胞體外形成擬胚體
當細胞培養到第二代又3-4天時，將細胞收集到15 ml離心管中，離心，棄上清液，加入EB分化培養液，吹打成單細胞，細胞計數，分散到24孔板中培養，每兩天換半液，用槍將其吹散。
[0025]擬胚體培養液:Medium199 +3 mg/ml BSA +1 mg/ml Fetuin +5 μ 1/ml ITS +0.23 mM 丙酮酸鈉 +1 ng/ml bFGF。
[0026]第三步:小鼠成纖維細胞的培養與飼養層細胞的制備
取出子宮中的胎鼠，只保留軀干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化5 min。消化后用移液槍吹打，離心，加培養液重懸細胞，過400目細胞篩，把細胞接種到成纖維細胞培養液中培養，貼壁培養，作PO代。傳代時收集細胞懸液，離心，接入成纖維細胞培養液中培養。
[0027]成纖維細胞培養液:DMEM高糖+10% FBS +1%丙酮酸鈉+1%非必需氨基酸+1%
青鏈霉素。
[0028]選P2-P4代生長在對數期的小鼠成纖維細胞，加入含有絲裂霉素C的成纖維細胞培養液，培養箱中孵育。孵育完后用PBS洗5遍，用0.25%胰蛋白酶將貼壁的成纖維細胞消化下來，收集細胞。重懸細胞后，轉入24孔貼壁培養板，每孔接種6-8 X 14個成纖維細胞，幾乎全部細胞貼壁后可用來做飼養層細胞。
[0029]第四步:擬胚體細胞與小鼠成纖維細胞共培養向原始生殖細胞分化
培養的擬胚體，用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化成單細胞，加入少量原始生殖細胞培養液懸浮細胞，將細胞稀釋為15個cells/ml原始生殖細胞。棄去鋪好小鼠胚胎成纖維細胞培養皿中的培養液，用原始生殖細胞培養液培養重懸的細胞培養，每個孔500 μ I培養液，37°C、飽和濕度、5% C02條件下培養。兩天以后，待到幾乎全部的細胞貼壁生長，在不弄壞培養皿底部飼養層細胞的基礎上，用移液槍吸走全部的培養液，加入500 μ I新的含有5 μΜ的視黃酸的原始生殖細胞培養液，繼續培養，此后每兩天換半液，即吸出200 μ?培養液，加入250 μ I預暖的新鮮原始生殖細胞培養液，培養至第4天之后，原始生殖細胞開始大量出現。。
[0030]原始生殖細胞培養液:DMEM高糖+10% FBS +0.23 mM丙酮酸鈉+0.1 mM非必需氨基酸 +2 mM L-谷氨酰胺 +0.1 mM 疏基乙醇 +20 ng/ml EGF +40 ng/ml bFGF +40ng/ml SCF +1%青鏈霉素。
[0031]實施例三:
第一步:小鼠皮膚干細胞的分離培養
收集出生當天小鼠，用剪刀和鑷子將小鼠背部皮膚整塊撕下來，去掉脂肪和血液，將干凈的皮膚組織用PBS洗三遍，剪成1-2 mm2左右的碎片，剪碎的組織加入1ml PBS1500rpm離心5min，棄上清，加加I ml 0.25% Trypsin+0.04% EDTA消化液后，用槍頭攪拌混勻，置于37°C、飽和濕度、5% C02培養箱中消化20-30 min,消化后棄掉消化液，使用40 μ m細胞濾器過濾細胞，收集單細胞。加I ml皮膚干細胞培養液重懸細胞，將細胞再次過150目細胞篩。將細胞接種到10mm懸浮培養版上，在5% 二氧化碳培養箱中培養。
[0032]小鼠皮膚干細胞培養液:DMEM/F12 +2% B-27 +20 ng/ml EGF +40 ng/ml bFGF+1%青鏈霉素。
[0033]第二步:小鼠皮膚干細胞體外形成擬胚體
當細胞培養到第二代又3-4天時，將細胞收集到15 ml離心管中，離心，棄上清液，加入EB分化培養液，吹打成單細胞，細胞計數，分散到24孔板中培養，每兩天換半液，用槍將其吹散。
[0034]擬胚體培養液:Medium199 +3 mg/ml BSA +1 mg/ml Fetuin +5 μ 1/ml ITS +
0.23 mM 丙酮酸鈉 +1 ng/ml bFGF。
[0035]第三步:小鼠成纖維細胞的培養與飼養層細胞的制備
取出子宮中的胎鼠，只保留軀干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化5 min。消化后用移液槍吹打，離心，加培養液重懸細胞，過400目細胞篩，把細胞接種到成纖維細胞培養液中培養，貼壁培養，作PO代。傳代時收集細胞懸液，離心，接入成纖維細胞培養液中培養。
[0036]成纖維細胞培養液:DMEM高糖+10% FBS +1%丙酮酸鈉+1%非必需氨基酸+1%
青鏈霉素。
[0037]選P2-P4代生長在對數期的小鼠成纖維細胞，加入含有絲裂霉素C的成纖維細胞培養液，培養箱中孵育。孵育完后用PBS洗5遍，用0.25%胰蛋白酶將貼壁的成纖維細胞消化下來，收集細胞。重懸細胞后，轉入24孔貼壁培養板，每孔接種6-8 X 14個成纖維細胞，幾乎全部細胞貼壁后可用來做飼養層細胞。
[0038]第四步:擬胚體細胞與小鼠成纖維細胞共培養向原始生殖細胞分化
培養的擬胚體，用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化成單細胞，加入少量原始生殖細胞培養液懸浮細胞，將細胞稀釋為15個cells/ml原始生殖細胞。棄去鋪好小鼠胚胎成纖維細胞培養皿中的培養液，用原始生殖細胞培養液培養重懸的細胞培養，每個孔500 μ I培養液，37°C、飽和濕度、5% C02條件下培養。兩天以后，待到幾乎全部的細胞貼壁生長，在不弄壞培養皿底部飼養層細胞的基礎上，用移液槍吸走全部的培養液，加入500 μ I新的含有10μM的視黃酸的原始生殖細胞培養液，繼續培養，此后每兩天換半液，即吸出200 μ I培養液，加入250 μ I預暖的新鮮原始生殖細胞培養液，培養至第4天之后，原始生殖細胞開始大量出現。。
[0039]原始生殖細胞培養液:DMEM高糖+10% FBS +0.23 mM丙酮酸鈉+0.1 mM非必需氨基酸 +2 mM L-谷氨酰胺 +0.1 mM 疏基乙醇 +20 ng/ml EGF +40 ng/ml bFGF +40ng/ml SCF +1%青鏈霉素。