中文字幕无码日韩视频无码三区

一種用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑及制備方法與應用

文檔(dang)序號:9320473閱(yue)讀:380來(lai)源:國知局
一種用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑及制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術和醫療領域,特別涉及一種誘導干細胞向成軟骨分化的制劑 及制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 干細胞(stemcell)是一類具有自我復制能力(self-renewing)的多潛能細胞。 在一定條件下,它可以分化成多種功能細胞。根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞 (embryonicstemcell,ES細胞)和成體干細胞(somaticstemcell)。根據干細胞的發育 潛能分為三類:全能干細胞(totipotentstemcell,TSC)、多能干細胞(pluripotentstem cell)和單能干細胞(unipotentstemcell)(專能干細胞)。干細胞(StemCell)是一種 未充分分化,尚不成熟的細胞,具有再生各種組織器官和人體的潛在功能,醫學界稱為"萬 用細胞"。
[0003] 胚胎干細胞具有萬能分化性(pluripotency)功能,特點是可以細胞分化 (Cellulardifferentiation)成多種組織的能力,但無法獨自發育成一個個體。它可以差 轉成為外胚層、中胚層及內胚層三種胚層的成員,然后再差轉成為人體的220多種細胞種 類。
[0004] 萬能分化性是胚胎干細胞與在成年人體內可找到的多功能干細胞的主要分別:多 功能干細胞只能差轉成為某幾種特定的細胞種類。在無外界提供差轉的刺激之下(即可在 實驗環境下生長),胚胎干細胞在經過多重細胞分裂之后,仍然能保有萬能分化性。成人干 細胞能否保有萬能分化性,直到現在仍然有爭議。不過,有研究已示范了萬能干細胞可以從 成纖維細胞集叢產生出來。
[0005] 由于胚胎干細胞的"全能"性,僅從技術角度來說,用胚胎干細胞來培養人體組織 和器官用以治療疾病是最理想的。但胚胎干細胞要從胚胎中提取,有關研究在一些國家遇 到倫理方面的反對,進行得不太順利。而成年動物體內也有一些干細胞,稱為成體干細胞。 它們具有一定的分化潛力,但分化方向比較固定,比如造血干細胞通常只發展成血液細胞。 成體干細胞不涉及倫理問題,研究比較便利,然而其分化能力有限。2007年11月,美國和 日本科學家分別宣布獨立發現將普通皮膚細胞轉化為干細胞的方法,這樣得到的干細胞稱 為誘導多功能干細胞(inducedpluripotentstemcellsiPS),又名iPS細胞。iPS細胞 具有和胚胎干細胞類似的功能,卻繞開了胚胎干細胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障 礙,因此在醫療領域的應用前景非常廣闊。隨后日本科學家僅用兩個移植基因培育成了人 類誘導多功能干細胞(iPS細胞),日本慶應大學教授岡野榮之的研究小組,僅用先前培育 iPS細胞所用4個誘導基因中的兩個,8卩"0ct3/4"基因和"Klf4k"基因,也成功培育出了 iPS細胞。目前,國際上關于iPS細胞的研究可謂日新月異,是干細胞研究的熱點領域之一。
[0006] 軟骨退化疾病,特別是退行性關節炎,是在中老年人群中發病率很高的一種消耗 性慢性疾病。基于種子細胞,生物材料及細胞生長因子的軟骨組織工程的發展為臨床修復 軟骨退化和缺損提供了可能。通過軟骨組織工程構建軟骨的首要條件是能夠獲得足夠量的 種子細胞。目前,用于軟骨組織工程的種子細胞主要有:成體軟骨細胞、成體干細胞和胚胎 干細胞。而誘導多能干細胞具有與胚胎干細胞同樣的體外培養無限增值,自我更新,和多 能分化潛能的特點;同時由于誘導多能干細胞來源于成體細胞,避免了倫理道德方面問題; 而且誘導多能干細胞可以從患者的皮膚成纖維或其他種類成體細胞誘導產生,克服了軟骨 組織工程中宿主對異體移植物產生免疫排斥的障礙。因此誘導多能干細胞在軟骨組織工程 中細胞來源是一個長遠時期的最佳選擇。

【發明內容】

[0007] 本發明的首要的目的在于克服現有技術的缺點與不足,提供一種用于誘導干細胞 向成軟骨分化的制劑。
[0008] 本發明的另一目的在于提供所述用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑的制備方 法。
[0009] 本發明的再一目的在于提供所述用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑的應用。
[0010] 本發明的目的通過下述技術方案實現:一種用于誘導干細胞向成軟骨分化的制 劑,包括小分子多肽、轉化生長因子-0 (TGF-0 )、地塞米松和維生素C;
[0011] 所述的小分子多肽的氨基酸序列如下所示:DPKRLWCKN。
[0012] 所述的用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑,還包括胰島素樣生長因子(IGFs) 和骨形態發生蛋白(BMPs)中的一種或兩種。
[0013] 所述的IGFs為IGF-1和IGF-2中的一種或兩種。
[0014] 所述的BMPs為BMP-2、BMP-4和BMP-6中的一種以上。
[0015] 所述的小分子多肽的濃度為5~50yM,優選為15~25yM,更優選為20yM。
[0016] 所述的TGF-0的濃度為1~100ng/ml,優選為5~15ng/ml,更優選為10ng/ml。
[0017] 所述的地塞米松的濃度為1~100yM,優選為5~15yM,更優選為10yM。
[0018] 所述的維生素C的濃度為5~100mg/L,優選為40~60mg/L,更優選為50mg/L。
[0019] 所述的IGFs的濃度為1~100yg/ml,優選為5~15ng/ml,更優選為10yg/ml。
[0020] 所述的BMPs的濃度為1~500ng/ml,優選為90~110ng/ml,更優選為100ng/ml。
[0021] 所述的用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑,優選由如下物質組成:小分子多肽 20yM、TGF- 0 10ng/ml、地塞米松10yM和維生素C50mg/L,溶劑為培養基。
[0022] 所述的培養基優選為HG-DMEM培養基。
[0023] 所述的用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑的制備方法,包括如下步驟:將小分 子多肽、TGF-P、地塞米松和維生素混合后得到。
[0024] 所述的用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑的制備方法,包括如下步驟:將IGFs 和BMPs中的一種或兩種、小分子多肽、TGF-P、地塞米松和維生素混合后得到。
[0025] 所述的用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑的應用,是將該制劑用于誘導干細胞 轉化為軟骨細胞,進而形成軟骨組織。
[0026] 所述的干細胞包括人臍帶間充質干細胞和人iPS細胞。
[0027] 所述的用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑的應用,包括如下步驟:用干細胞生 長培養基將干細胞培養至完全融合,接著加入用于誘導干細胞向成軟骨分化的制劑培養, 3~4天換液一次,誘導培養至得到軟骨細胞。
[0028] 所述的誘導培養的時間優選為2~3周。
[0029] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
[0030] (1)本發明提供的制劑,能直接誘導干細胞特別是人臍帶間充質干細胞向軟骨分 化,也能誘導人類誘導多能干細胞特別是誘導多能間充質干細胞向軟骨細胞的定向誘導分 化,并取得了較好的效果
[0031] ⑵采用該制劑,誘導人臍帶間充質干細胞和人iPS細胞,可以發現,細胞從加入 誘導用的組合物后,逐漸形態不規則,呈多邊形、星形等,緊密排列成"鋪路石"狀外觀,接著 細胞逐漸變為長梭形。而對照組的細胞形態不變,仍為纖維樣。經甲苯胺藍染色,細胞基質 的糖胺多糖被染上藍色。
【附圖說明】
[0032] 圖1是軟骨誘導分化對照組放大200倍的照片圖;其中,圖(A)為iPS-MSCs,圖(B) 為hUC-MSCs。
[0033] 圖2是軟骨誘導分化甲苯胺藍染色放大200倍的照片圖;其中,圖(A)為 iPS-MSCs,圖(B)為hUC-MSCs。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限 于此。
[0035]實施例1
[0036] -、誘導多能間充質干細胞(iPS-MSC,購自中國科學院上海細胞庫,目錄號 SCSP-1301)和人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs,購自中國科學院上海細胞庫,目錄號 SCSP-403)的培養。DMEM培養基購自美國GIBC0公司。
[0037] 1、傳代:在倒置顯微鏡中觀察,培養瓶中細胞100%融合時可進行傳代培養。倒去 培養皿(培養瓶)中的液體,輕輕甩干,然后加0.5-lml0.25% (w/v)胰酶溶液消化。輕輕 搖晃,讓胰酶與細胞充分接觸,轉移到顯微鏡下觀察,待觀察到少量細胞脫落,且大部分細 胞逐漸變回圓
當前第1頁1 2 
網友詢問留言(yan) 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1