新型糖胺聚糖類似物及其合成方法及其在體外胚胎干細胞增殖及定向神經分化中的應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于聚合物合成及其在生物醫學應用領域，具體涉及一種新型糖胺聚糖類 似物的合成方法，采用RAFT合成技術利用含磺酸基團單體以及含糖單體，通過控制其相對 比例調節聚合物結構，獲得了具有體外促進胚胎干細胞增殖并誘導其發生高效定向神經分 化的高分子物質。
【背景技術】
[0002] 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG)是一類由生物體產生的多功能性活性分子， 它在細胞黏附、增殖、分化以及抗凝血等生理過程中都發揮著十分關鍵的作用。近年來人們 發現，糖胺聚糖物質在體外條件下可以誘導胚胎干細胞的定向神經分化，這些研宄對神經 系統疾病的發病機理以及相關治療策略等方面都具有非常重要的意義。然而，生物體自身 合成糖胺聚糖分子結構復雜且活性不穩定，因此，通過人工合成糖胺聚糖類似物應用于生 物醫用材料研宄和疾病治療具有重要的科學價值和社會意義。
[0003] 目前，人們制備糖胺聚糖類似物的方法主要有以下幾種： (1)通過利用簡單的含有磺酸基團的小分子單體的聚合作用合成帶有多磺酸基團的高 分子物質。該方法比較簡便，但由于糖胺聚糖分子中所含有的獨特功能的糖組分未被聚合 在該物質結構中，因此所獲得的產物活性及功能性受到很大的限制。
[0004] (2)通過將多糖物質進行磺化處理，合成具有類似糖胺聚糖分子的磺化多糖物質。 該策略可得到既含有糖單元，也含有磺酸基團的產物，但由于磺酸基團在糖分子中的修飾 位置及其相對比例難以控制，因此其所獲得的產物活性的穩定性也有待于進一步提高。
[0005] (3)通過嚴格按照糖胺聚糖分子結構中組成單元的順序性和磺酸基團修飾位點的 特異性合成磺化寡糖分子。此類化合物具有特異的生物活性結構，因此具有較高的細胞和 生理調節功能。然而該技術在操作過程中需要繁瑣的合成和純化步驟，并且產率有限，所以 也未得到廣泛的應用。
[0006] 因此，開發和研宄操作簡單、易于調節分子中糖單元和磺酸基團的相對比例、且產 物結構可控的糖胺聚糖類似物的合成方法，并將其利用于生物醫學領域，特別是體外干細 胞增殖以及定向神經分化，就具有十分重要的意義。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種新型糖胺聚糖類似物的合成方法，通過調節聚合物中兩 種功能基團的比例以及控制分子結構，實現在體外條件下對胚胎干細胞增殖的促進作用以 及定向神經分化的誘導作用。
[0008] 為了實現上述目的，本發明的技術方案為：一種新型糖胺聚糖類似物，其特征在 于：將對苯乙烯磺酸鈉單體或/和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體按照一定比例添加到混 合溶劑中，所述混合溶劑為水與氮氮二甲基甲酰胺（N, N-DimethyIformamide)的混合物，利 用可逆加成-斷裂鏈轉移聚合（RAFT)的方法聚合分別得到若干種不同比例的對苯乙烯磺 酸鈉單體或/和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體的聚合物。
[0009] 進一步，所述聚合物可以為以下三種： 2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體的均聚物（pMG); 對苯乙烯磺酸鈉單體的均聚物（pSS); 對苯乙烯磺酸鈉單體和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體按照0. 5-4:1的摩爾比聚合 形成的共聚物（pSG)。
[0010] 控制單體對苯乙烯磺酸鈉（SS)及MAG在水與DMF混合溶劑中的比例，利用RAFT方 法聚合分別得到上述三種聚合物pMAG、pSS及pSG。 toon] 進一步，所述聚合物的分子式為
本發明的另一種技術方案為：一種新型糖胺聚糖類似物的合成方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1》制備2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體：將鹽酸葡萄糖胺與甲基丙烯酰氯在含碳酸 鉀的甲醇溶液中反應后，對沉淀物進行純化得到2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體； (2)制備聚合物：控制對苯乙烯磺酸鈉單體及2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體在混合 溶劑中的比例，所述混合溶劑為水與氮氮二甲基甲酰胺的混合物，利用可逆加成-斷裂鏈 轉移聚合方法聚合分別得到若干種不同比例的對苯乙烯磺酸鈉單體或/和2-甲基丙烯酰 胺吡喃葡萄糖單體的聚合物。
[0012] 本發明的進一步的技術方案為：一種使用糖胺聚糖類似物的促進胚胎干細胞體 外增殖或體外定向神經分化的應用方法，其特征在于，包括以下步驟：分別向種有胚胎干細 胞的若干個培養板內各倒入一種含有所述聚合物的培養液，培養若干天。
[0013] 進一步，所述培養板預先鋪滿明膠。
[0014] 由于上述技術方案的應用，與現有技術相比，本發明具有以下突出特點： 1.本發明由于包含了較為自由的含糖基團的結構，因此具有更高的生物學活性。
[0015] 2.本發明由于磺酸基團和糖單元的比例能較好地進行控制，因此可應用于不同的 生物活性要求。
[0016] 3.本發明所述的方法工藝簡單，工藝過程容易控制。
【附圖說明】
[0017] 圖1中為實施例一中所獲得的糖胺聚糖類似物聚合物pSG的分子結構； 圖2中為實施例一中所獲得的糖胺聚糖類似物聚合物pSG的IH-NMR譜圖； 圖3中為實施例一中所獲得的糖胺聚糖類似物聚合物pSG的FT-IR譜圖； 圖4中為實施例二中利用高活性糖胺聚糖分子-肝素以及本方法合成的糖胺聚糖類似 物對胚胎干細胞增殖的結果對比； 圖5是實施例三中qPCR定量分析分別經過聚合物pSS、pSG與肝素培養的胚胎干細胞 β Ill-tubulin基因表達量； 圖6是實施例三中分別經過聚合物培養的胚胎干細胞熒光染色圖。
【具體實施方式】
[0018] 以下實施例提供了新型糖胺聚糖類似物的合成方法，包括含磺酸基團單體以及含 糖單體制備，聚合物的RAFT合成方法，以及單體相對比例和分子結構的調控，同時利用體 外細胞增殖和神經分化檢測技術驗證了所獲得的聚合物分子在胚胎干細胞增殖并其定向 神經分化中的作用。
[0019] 下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明，但不限制本發明。
[0020] 一種新型糖胺聚糖類似物的合成方法，包括以下步驟： (1) 選取含磺酸基團的分子SS與含糖基團的分子MG作為單體，通過調節兩者相對比 例，利用RAFT方法制備具有不同功能基團的均聚物與共聚物(分子量在6000-20000范圍 內)。
[0021] (2)分別將所得聚合物加入到胚胎干細胞培養液中，對胚胎干細胞進行培養，一定 時間后研宄細胞在不同聚合物環境下增殖情況。
[0022] (3)分別將所得聚合物加入到胚胎干細胞培養液中，對胚胎干細胞進行培養，一定 時間后研宄細胞在不同聚合物環境下定向神經分化情況。
[0023] 本發明的原理是：采用RAFT合成的方法，利用含磺酸基團單體以及含糖單體，通 過控制其相對比例調節聚合物結構，合成分子中含有磺酸基團和糖單元兩種糖胺聚糖功能 組分的聚合物，并利用該聚合物在體外條件下促進胚胎干細胞的增殖以及定向神經分化。
[0024] -種新型糖胺聚糖類似物的合成方法，包括以下步驟： (1》制備單體2-甲基丙烯酰