一種sd大鼠頸總動脈內皮細胞的分離和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種SD大鼠頸總動脈內皮細胞的分離和培養方法。
【背景技術】
[0002]血管內皮細胞具有多種生理功能，能產生和分泌許多生物活性物質，在維持血管舒縮，抗凝血等方面起重要作用。體外血管內皮細胞的成功培養是研究內皮細胞功能及其在各種疾病發生發展中所起作用的基礎。從實驗用SD大鼠頸總動脈分離得到的內皮細胞(endothelial cell, EC)是廣泛用于實驗研究的血管內皮細胞。
[0003]內皮細胞體外生長能力較差，原代培養不易成功。以往主要是采用機械分離法和組織塊移植法。將臍靜脈剪開，用手術刀背等刮取內皮細胞或使用帶有尼龍篩的分離管，但這一方法很難掌握力度，用力太輕，取得的細胞數量很少；用力太重，易混雜其他血管壁細胞如成纖維細胞等，而且此方法易損傷內皮細胞。近幾年來內皮細胞分離已逐漸被酶消化法取代，此法獲得的細胞較純，且能較好地保持其生物活性，但是胰酶對細胞膜有較強的分解能力，能夠破壞細胞的完整性，影響細胞的活力，并且消化所得的內皮細胞中，可能含有大量的成纖維細胞，對后續實驗產生影響，膠原酶消化時間長，細胞解離不充分且損傷大，另外所得細胞極少，培養時細胞活性差。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種SD大鼠頸總動脈內皮細胞的分離和培養方法，不僅成活率高、對細胞損害低，而且經濟實用、簡單易行，適于工廠等大規模生產。
[0005]本發明為解決上述問題所采取的技術方案是:一種SD大鼠頸總動脈內皮細胞的分離和培養方法，包括以下步驟:
1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無菌條件下切取SD大鼠的頸總動脈并除去血污，備用;
2)將頸總動脈切割成長為3-5cm的長段后放入PBS溶液中，剝除頸總動脈的外膜，并將頸總動脈沿縱向切割，把頸總動脈的內膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內，使頸總動脈的內膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實現頸總動脈內膜的消化，所述消化酶溶液由質量濃度為0.2%的I型膠原酶和質量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得；
3)在頸總動脈內膜消化的過程中振動容器，使內皮細胞脫落，消化結束后除去頸總動脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1-2:2，攪拌均勻后制得混合液；
4)將混合液放入轉速為1500r/min的離心機中離心3min，除去上清液后得到頸總動脈內皮細胞，將頸總動脈內皮細胞放入內皮細胞培養基中進行培養，達到對數期后轉入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養箱中培養，之后進行傳代培養即可。
[0006]進一步優化，步驟2)所述消化的溫度為37°C、時間20min。
[0007]所述SD大鼠頸總動脈內皮細胞的傳代方法，包括了以下步驟:
A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動脈內皮細胞放入溫度為37°C的CO2培養箱中培養24小時，然后倒掉培養基，并用無菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細胞和死細胞；
B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入EBM培養基中培養，每隔2-3天換一次培養基，培養4-6天后除去培養基，并用無菌PBS溶液清洗，備用；
C、將SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入消化液中進行消化反應，待細胞變圓后除去消化液，并加入胎牛血清以終止消化反應；
D、將完成消化反應的SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入離心管中，在轉速為1500rpm的離心機中離心3min，除去上清液后，將沉淀加入到DMHM培基中培養即可。
[0008]進一步優化，步驟C中所述的消化液是將質量濃度為0.125 %的胰酶和質量濃度為0.02%的EDTA按6:1的體積比混合并攪拌均勻后制得。
[0009]有益效果
本發明采用SD大鼠為材料，材料來源廣泛，方便易得。采用胰酶和膠原酶聯合消化的方法分離得到內皮原代細胞，克服了兩種酶的各自缺點，可獲得較高的細胞存活數量。選擇37°C為消化條件，兩種酶活性最高，消化效果最佳，對內皮細胞的消化能力較強。兩種酶按1:1混合，對內皮細胞的損害較小，分離出的血管內皮細胞數量多，雜細胞污染少，細胞貼壁能力強。此方法經濟實用，簡便易行，有利于獲得所需的體外實驗模型細胞，為進一步研究內皮細胞在提高心血管疾病藥物藥效方面提供幫助。
【附圖說明】
[0010]圖1為內皮細胞培養過程中形態觀察結果；
圖2為內皮細胞VIII因子免疫組化結果；
圖3為丹參注射液對血管內皮細胞作用的MTT檢測存活率圖。
【具體實施方式】
[0011]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明，本發明的保護范圍不限于下述實施例。
[0012]一種SD大鼠頸總動脈內皮細胞的分離和培養方法，包括以下步驟:
1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無菌條件下切取SD大鼠的頸總動脈并除去血污，備用;
2)將頸總動脈切割成長為3-5cm的長段后放入PBS溶液中，剝除頸總動脈的外膜，并將頸總動脈沿縱向切割，把頸總動脈的內膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內，使頸總動脈的內膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實現頸總動脈內膜的消化，所述消化酶溶液由質量濃度為0.2%的I型膠原酶和質量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得；
3)在頸總動脈內膜消化的過程中振動容器，使內皮細胞脫落，消化結束后除去頸總動脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1-2:2，攪拌均勻后制得混合液；
4)將混合液放入轉速為1500r/min的離心機中離心3min，除去上清液后得到頸總動脈內皮細胞，將頸總動脈內皮細胞放入內皮細胞培養基中進行培養，達到對數期后轉入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養箱中培養，之后進行傳代培養即可。
[0013]所述SD大鼠頸總動脈內皮細胞的傳代方法，包括了以下步驟:
A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動脈內皮細胞放入溫度為37°C的CO2培養箱中培養24小時，然后倒掉培養基，并用無菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細胞和死細胞；
B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入EBM培養基中培養，每隔2-3天換一次培養基，培養4-6天后除去培養基，并用無菌PBS溶液清洗，備用；
C、將SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入消化液中進行消化反應，待細胞變圓后除去消化液，并加入胎牛血清以終止消化反應；
D、將完成消化反應的SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入離心管中，在轉速為1500rpm的離心機中離心3min，除去上清液后，將沉淀加入到DMHM培基中培養即可。
[0014]步驟2)所述消化的溫度為37°C、時間20min。
[0015]步驟C中所述的消化液是將質量濃度為0.125%的胰酶和質量濃度為0.02%的EDTA按6:1的體積比混合并攪拌均勻后制得。
[0016]實施例1
一種SD大鼠頸總動脈內皮細胞的分離和培養方法，包括以下步驟:
1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無菌條件下切取SD大鼠的頸總動脈并除去血污，備用;
2)將頸總動脈切割成長為3-5cm的長段后放入PBS溶液中，剝除頸總動脈的外膜，并將頸總動脈沿縱向切割，把頸總動脈的內膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內，使頸總動脈的內膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實現頸總動脈內膜的消化，所述消化酶溶液由質量濃度為0.2%的I型膠原酶和質量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得；
3)在頸總動脈內膜消化的過程中振動容器，使內皮細胞脫落，消化結束后除去頸總動脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1:2，攪拌均勻后制得混合液；
4)將混合液放入轉速為1500r/min的離心機中離心3min，除去上清液后得到頸總動脈內皮細胞，將頸總動脈內皮細胞放入內皮細胞培養基中進行培養，達到對數期后轉入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養箱中培養，之后進行傳代培養即可。
[0017]所述SD大鼠頸總動脈內皮細胞的傳代方法，包括了以下步驟:
A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動脈內皮細胞放入溫度為37°C的CO2培養箱中培養24小時，然后倒掉培養基，并用無菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細胞和死細胞；
B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入EBM培養基中培養，每隔2天換一次培養基，培養4-6天后除去培養基，并用無菌PBS溶液清洗，備用；
C、將SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入消化液中進行消化反應，待細胞變圓后除去消化液，并加入胎牛血清以終止消化反應；
D、將完成消化反應的SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入離心管中，在轉速為1500rpm的離心機中離心3min，除去上清液后，將沉淀加入到DMHM培基中培養即可。
[0018]步驟2)所述消化的溫度為37°C、時間20min。
[0019]步驟C中所述的消化液是將質量濃度為0.125%的胰酶和質量濃度為0.02%的EDTA按6:1的體積比混合并攪拌均勻后制得。
[0020]實施例2
一種SD大鼠頸總動脈內皮細胞的分離和培養方法，包括以下步驟:
1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無菌條件下切取SD大鼠的頸總動脈并除去血污，備用;
2)將頸總動脈切割成長為3-5cm的長段后放入PBS溶液中，剝除頸總動脈的外膜，并將頸總動脈沿縱向切割，把頸總動脈的內膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內，使頸總動脈的內膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實現頸總動脈內膜的消化，所述消化酶溶液由質量濃度為0.2%的I型膠原酶和質量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得；
3)在頸總動脈內膜消化的過程中振動容器，使內皮細胞脫落，消化結束后除去頸總動脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1:1，攪拌均勻后制得混合液；
4)將混合液放入轉速為1500r/min的離心機中離心3min，除去上清液后得到頸總動脈內皮細胞，將頸總動脈內皮細胞放入內皮細胞培養基中進行培養，達到對數期后轉入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養箱中培養，之后進行傳代培養即可。
[0021]所述SD大鼠頸總動脈內皮細胞的傳代方法，包括了以下步驟:
A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動脈內皮細胞放入溫度為37°C的CO2培養箱中培養24小時，然后倒掉培養基，并用無菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細胞和死細胞；
B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入EBM培養基中培養，每隔3天換一次培養基，培養4-6天后除去培養基，并用無菌PBS溶液清洗，備用；
C、將SD大鼠頸總動脈內皮細胞轉入消化液