一種酵母菌富集銅離子的馴化培養和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酵母菌培養方法，具體的說是一種酵母菌富集銅離子的馴化培養 和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 隨著我國經濟的飛速發展和人民生活水平的不斷提高，對肉、蛋、奶、皮、毛、羽等 畜產品的需求與日倶增。這導致了我國畜牧業的飛速發展，養殖種類增加，養殖規模加 大，飼料在養殖業中所占的成本比例和產值也在不斷擴大。2013年，全國商品飼料總產量 1. 934億噸（產值6784億元），已經成為國民經濟的支柱產業。微量金屬元素是動物體必 不可少的營養物質，參與多種代謝途徑。然而，最初的微量元素都是以無機鹽的形式添加， 在動物體內的轉化效率低，大部分隨糞便排到環境當中，嚴重污染環境。大劑量的無機鹽添 加還會影響到飼料的適口性，使動物的采食量降低。
[0003] 酵母是一種單細胞真菌，細胞個體大，且酵母富含維生素、酶、寡糖等營養物質，被 列為單細胞蛋白飼料的范圍內。在對酵母研究的一系列成果中均證明，酵母在自身代謝過 程中能夠利用多種微量元素轉化為自身成分，或者與酵母體內氨基酸結合變成金屬元素氨 基酸螯合物，這種形式存在的金屬元素在動物體內能夠與氨基酸一起直接被消化道上皮細 胞吸收，大大提高了生物學效價，降低了金屬離子的使用量。同時酵母培養簡單，培養成本 低，本方案采用無機銅離子(硫酸銅）作為銅源，培養和馴化酵母，然后作為動物飼料使用， 既可以降低養殖業無機銅的使用，減少環境污染；又能夠提供酵母蛋白，改善飼料品質。
[0004] 現有的發明專利如：專利201210595217采用酵母菌液態發酵法將無機銅硫酸銅 轉化為有機酵母銅，所涉及的菌株為釀酒酵母CGMCC-6438,該發明所生產的產品銅含量可 達21. 47mg/g風干菌體重，產量可達16. 05g/L風干菌體。專利200910066547提供一種酵母 銅、酵母鐵和酵母鋅復合仔豬飼料添加劑，由酵母銅、酵母鐵和酵母鋅組成。該發明相對于 現有飼料具有的優點在于：通過添加酵母銅、酵母鐵、酵母鋅，既減少銅、鐵和鋅的添加量， 又可避免微量元素銅、鐵和鋅之間的頡頏作用，提高仔豬的生長性能、增強仔豬的抗氧化作 用和免疫功能以及預防疾病的優點。這兩個專利技術前者主要是利用釀酒酵母生產釀酒酵 母銅產品，最終以產品形式體現，所用菌種也局限在了釀酒酵母，沒有形成富銅酵母培養和 馴化的系統方法。后者主要是一種簡單的有機微量元素復配，重點是作為有機微量元素添 加劑產品，也沒有體現酵母對銅離子的耐受力和如何培養馴化的方法。

【發明內容】

[0005] 本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種酵母菌富集銅離子的馴化培 養和檢測方法，所培養的酵母菌在250ug/mL的銅離子濃度培養基中正常生長，對銅離子的 轉化效率達到95. 6%，為酵母新功能開發提供基礎。
[0006] -種酵母菌富集銅離子的馴化培養方法，包括以下步驟： (1)、馴化培養基的配制：每lOOOmL蒸餾水中加入玉米漿40g，糖蜜20g，葡萄糖5g， 硝酸銨2g，硫酸鎂0. 2g和磷酸二氫鉀0. 5g，攪拌至完全溶解后用鹽酸或氨水調節pH值 為5. 0,將所得混合溶液分為10份，分別添加硫酸銅調整混合溶液中銅離子的濃度分別 為：0?156ymol/mL、0. 313ymol/mL、0. 469ymol/mL、0. 625ymol/mL、0. 781ymol/mL、 1. 563ymol/mL、2. 344ymol/mL、3. 125ymol/mL、3. 906ymol/ml,和 4. 688ymol/ml,,得至lj 十種不同銅離子濃度的馴化培養基，分別裝入10個三角瓶中，裝液量為三角瓶體積的20%， 進行高壓蒸汽滅菌后，備用； 基礎液體培養基的配制：每l〇〇〇mL蒸餾水中加入蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g和蒸餾水l〇〇〇mL，攪拌至完全溶解后用鹽酸或氨水調節pH值為5. 0,備用； (2) 、產朊假絲酵母培養：挑取2-3接種環活化后的產朊假絲酵母斜面菌種，接種到裝 有基礎培養基的試管中，30°C下，220rpm/min搖床培養至菌液的0D600值為1. 0,得到產朊 假絲酵母種子液，備用； (3) 、將產朊假絲酵母種子液分別接種到上述步驟（1)所制備10個裝有不同銅離子 濃度馴化培養基的三角瓶中；將接種后的10個三角瓶置于30°C下，220rpm/min，搖床培 養14h，得到產朊假絲酵母菌液；分別檢測上述步驟（3)中所培養的產朊假絲酵母菌液其 0D600值和上清液中銅離子的含量； (4) 、選擇上述步驟（3)中所培養的產朊假絲酵母菌其菌液0D600值最高，且其菌液中 銅離子的含量最低的產朊假絲酵母菌，作為出發菌種；取上述步驟（3)所培養的該出發菌 種的菌液lmL，接種到銅離子的濃度為0. 781umol/mL的50mL馴化培養基中，30°C下，搖瓶培 養14h后，吸取lmL菌液接種到銅離子的濃度為1. 563umol/mL的50mL馴化培養基中，30°C 下，搖瓶培養14h，吸取lmL菌液接種到銅離子的濃度為2. 344umol/mL的馴化培養基中， 30°C下，搖瓶培養14h，再次吸取lmL菌液，接種到銅離子的濃度為3. 125umol/mL的馴化 培養基中，30°C下，搖瓶培養14h，再次吸取lmL菌液，接種到銅離子的濃度為3. 906umol/ mL的馴化培養基中，30°C下，搖瓶培養14h，再次吸取lmL菌液，接種到銅離子的濃度為 4. 688umol/mL的馴化培養基中，30°C下，搖瓶培養14h;在培養過程中，所培養的菌液除接 種外所剩余菌液均存放于冰箱中，備用； (5) 、將上述步驟（4)冰箱中所保存的菌液取出，分別檢測不同代次產朊假絲酵母的銅 離子轉化率，當銅離子的轉化率不變或降低時，認為達到該菌種對銅離子的最大耐受能力； 保留此菌種作為富銅酵母生產菌種，以此時的培養基配方作為生產富銅酵母的最佳培養基 配方。
[0007]步驟（5)中所述檢測不同代次產朊假絲酵母的銅離子轉化率的方法為： (1)、稱取恒重的硫酸銅配制成銅離子濃度為0. 156umol/mL的銅離子標準液，用移液 槍依次吸取0. 50mL、1. 00mL、1. 50mL、2. 00mL和2. 50mL銅離子標準液，分別移入5個體積為 125mL的分液漏斗中；另外取1個不添加銅離子標準液的分液漏斗，即空白對照；然后分別 在6個分液漏斗中添加硫酸至分液漏斗中的溶液體積為20mL;然后，分別向6個分液漏斗 中依次加入5mL檸檬酸銨和乙二胺四乙酸二鈉的混合水溶液、3滴酚紅試劑，搖勻后，采用 氨水將分液漏斗中的溶液調至紅色；接著，再分別加入2mL二乙基二硫代氨基甲酸鈉水溶 液和10mL四氯化碳溶液，劇烈振搖2min，靜置等分層后，分別用脫脂棉將四氯化碳層濾入 體積為2cm的比色杯中；采用四氯化碳調節零點，在波長為440nm處測銅標準溶液的吸光 度，用銅標準溶液各點吸光值減去空白對照管吸光值后，在軟件中繪制標準曲線并計算回 歸方程； (2)、取lml冰箱中所保存的待檢測菌液加入到離心管中，放入3000r/min的離心機 中離心2min，取上清液置于分別250mL具塞錐形瓶中，加入lOOmL鹽酸，充分搖勻后，轉入 250mL容量瓶中，加水定容至250mL;吸取5mL容量瓶中溶液置于體積為125mL的分液漏斗 中，然后加入15mL水稀釋至20mL;按照銅離子標準曲線的方法進行測其在波長為440nm的 吸光度，將吸光度結果帶入回歸方程計算銅離子濃度。
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