專利名稱：一種促分化抑增殖抗癌藥二萜類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從熱帶鞘蕊花屬植物提取的二萜類化合物及制備方法和用途，特別是涉及下式Ⅰ結構的化合物及制備方法和用途。
目前人們對于這類化合物的研究主要集中在對細胞跨膜信號通路的影響方面，如文獻1譚薇琦、管考梅在“生物化學雜志”，1995,Vol.11,No.3發表的“毛喉萜對人胃癌細胞(BGC-823)中蛋白激酶C及其亞類的影響”。毛喉萜類是從毛喉鞘蕊花中提取出的一種二萜類化合物，國際上曾有報道毛喉鞘蕊花植物中的二萜類化合物有效成分，是腺甘酸環化酶的特異性激活劑。也有人做了毛喉萜類抑制人胃癌細胞(BGC-823)增殖與ras基因表達相關性研究，如文獻2“生物化學雜志”1995年Vol.11,No.4上發表的“毛喉萜抑制人胃癌細胞BGC-823增殖與ras基因表達相關性研究”(譚薇琦、管考梅)，文中描述將人胃癌細胞BGC-823培養于含10％小牛血清的RPMI1640培液中，加入毛喉萜類，對照組不加藥，于37℃、5％CO2條件下培養，細胞生長呈濃度依賴曲線。如

圖1所示。
對于這類植物二萜的研究，如毛喉萜類作用機理的研究，多年來人們主要集中在其對環腺苷酸(cAMP)通路的影響。如它能增高多種類型細胞中腺苷酸環化酶活性和增加cAMP的積累，通過激活cAMP依賴的蛋白激酶A(PKA)，引起特異的底物蛋白磷酸化，從而調節細胞內有關基因表達等生理效應。另外還有人報道二萜類化合物在細胞內磷脂酰肌醇通路中的作用及對癌細胞的生理效應。
在上述文獻中所介紹的二萜類化合物具有如下結構式
它們是具有從2-7位乙酰一類的二萜化合物的混合物，且含量在0.01％-0.05％之間，難以得到高純度的單一成分，更沒有單一結構化合物藥效的報道，至今未實現臨床藥用。
本發明的目的在于1．目前臨床上癌癥的藥物治療主要是以細胞毒為基礎的傳統癌癥殺傷療法，盡管這類療法在許多惡性腫瘤和晚期癌癥患者的治療中取得了顯著療效，但是由于所用藥物有較大的毒副作用，同時也殺傷許多正常細胞，給患者帶來極大的生理危害，如脫發、掉牙齒、損傷分泌腺等。為了改變目前臨床上單一應用細胞毒藥物的現狀，開發一種促分化抑增殖的抗癌新藥，為癌癥的治療開辟一條新的途徑。2、為了達到本發明二萜類化合物的最佳藥效，還提供一種該化合物與維甲酸的協同組合。維甲酸是另一類具有一定毒性的白血病細胞的分化誘導劑，聯合應用不同作用機制的分化誘導劑，可提高藥效、降低毒性和克服癌細胞的耐藥性。3、為了提供一種從鞘蕊花屬植物中提取式Ⅰ結構的二萜類化合物的制備方法，并且提取產率超過0.1％，純度在98％以上。4、為了提供式Ⅰ結構的二萜類化合物臨床用藥的合適劑型的用途。本發明的目的是這樣實現的本發明提供的從熱帶鞘蕊花屬植物中提取的二萜類化合物具有如下結構
本發明的二萜類化合物的結構如式Ⅰ，經元素分析、質譜、紅外、紫外、核磁共振等分析方法確定。該化合物為白色結晶，分子量410，熔點為226～228℃，理化性質穩定，即對光、熱穩定，加熱至226～230℃不升華，冷卻后又成晶體，在有機溶劑(乙醇、甲醇、苯、乙酸乙酯、二甲基亞砜)中也很穩定，可長期在室溫下保存。
本發明提供的從熱帶鞘蕊花屬植物中提取、純化式Ⅰ結構的二萜類化合物的方法，包括以下步驟①將洗干凈的熱帶鞘蕊花屬植物的根或莖曬干或烘干磨碎成粉末，也可用新鮮植物根或莖粉碎后備用。②上述干燥后的植物粉末用有機溶劑(乙醇、丙酮)萃取，干粉與萃取溶劑用量比例為1∶3～10份。采用通常的浸泡或回流萃取，萃取時間2-3天，溫度35°-80℃，可得二萜類化合物的粗品(混合物)。③將步驟②得到的二萜類化合物的粗品用石油醚再提取，溶劑用量比例為1∶100～150份，操作同上，提取時間10′-60′；提取溫度28°-60℃，其作用是脫脂，去掉產物中的部分雜質。④步驟③所得產物再用甲醇溶劑提取，提取物與溶劑用量比例為1∶100～150份，操作同上，提取時間40′-60′；提取溫度30°-60℃，其作用為進一步去掉提取物中所含雜質。⑤用氧化鋁吸附層析法進一步純化，將步驟④得到的提取物，放入通常的層析裝置內，用苯溶液洗脫，洗脫按3～5個洗脫體積進行，將雜質吸附在層析柱上，得到含式Ⅰ結構的二萜類化合物(純度＞80％)。
上述步驟中所用有機溶劑如甲醇、乙醇、石油醚、苯等均為揮發性溶劑，保證提取物中不殘留，安全有效。可使用的上述溶劑純度均在分析純以上。⑥脫色處理上述步驟⑤得到的粗品還可經脫色處理，去掉色素進一步純化。取二萜類化合物粗品與脫色劑按1∶30～50份比例混合配成懸浮液，將該懸浮液離心分離5-20分鐘，這樣處理過的產品，純度可達95％以上。其脫色劑包括非離子型去污劑(如吐溫80、吐溫20或司班80)或活性炭。
此外，需要時可按照本身已知的成鹽方法(如通過合適的酸處理)將得到二萜類化合物轉化成鹽。⑦該化合物經過高效液相色譜(HPLC)純化后純度可達98-99％，可供臨床口服、注射；機理、藥效和藥理研究用或作為分析試劑用。本發明的式Ⅰ結構的二萜類化合物的用途在于抑制癌細胞增殖，并促其向正常逆轉分化，其抗癌作用機制是通過調控癌細胞周期的關鍵信息分子及轉錄因子來抑制癌細胞的增殖，并誘導癌細胞向正常逆轉分化。它的作用機制有以下幾個方面1、對表皮生長因子受體(EGF-R)的下調作用，對轉化生長因子-β(TGF-β)和轉化生長因子-α(TGF-α)的正負調節作用，及對細胞膜脂流動的影響(增強細胞膜脂微粘度)；2、調控第二信使的傳遞，如促進環腺苷酸(cAMP)含量的增高，降低堿性磷酸酶(Apase)，酪氨酸蛋白激酶(TPK)，磷脂酶C(PLC)，肌醇三磷酸(IP3)的活性，調控Ca的釋放及蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)的活性，增加蛋白酪氨酸磷酸酶的活性，促進底物蛋白磷酸化；3、抑制生長因子受體基因(如EGF-R基因，TGF-α基因)及癌基因(H-ras,C-myc)的表達，促進抑癌基因p-53的表達。誘導癌細胞(如UMR106,HL60,BGC-823等)惡性表型及腫瘤亞細胞結構向正常逆轉分化，從而抑制癌細胞的致瘤力。
本發明的式Ⅰ結構的二萜類化合物對鼻咽癌、胃腸癌、食道癌、膽囊癌等的有明顯的抑制作用，尤其是對人的白血病的誘導分化治療以及與維甲酸(RA)聯合應用抗癌療效更佳。從下面對癌癥的體內外實驗可明顯看出。實驗實例1(急性毒性)本發明的式Ⅰ結構的二萜類化合物的急性毒性實驗動物NIH健康小鼠，體重18～22g，雌雄各半，隨機分組10只/組方法實驗前禁食16小時，自由飲水，腹腔注射(或口服)。
藥物本發明的產物給藥劑量分別為175mg/Kg體重、122.5mg/kg體重、85.75mg/kg體重、40.02mg/kg體重，組距0.8。本實驗為腹腔注射。觀察時間連續7天。
實驗結果計算法用Biss法計算小鼠腹腔(IP)注射LD50值，為94.2mg/kg，95％的可信限，為82.0～108.3mg/kg。見附圖10、11。
結論僅有微毒。實驗實例2一、本發明的產物對人白血病細胞的誘導分化作用細胞模型人白血病細胞(HL60)誘導劑本發明的產物，純度98％以上(HPLC純)對照物無血清RPM11640培養基陽性對照物維甲酸(RA)聯合效應物本發明的產物+RA(一)、不同濃度的本發明的產物對HL60細胞生長的影響本發明的產物濃度5μM,10μM,20μM,30μM,50μM.
本發明的產物+RA濃度50μM∶50μMHL60細胞5×104/ml培養基RPM11640培養基，含10％新生小牛血清，(給藥時不含血清)對照為無血清RPM11640培養基培養條件5％CO2,37℃恒溫孵育3天。
本發明的產物的細胞生長抑制率為25％、30％、36％、42％、54％，呈濃度依賴曲線，本發明的產物與RA聯合效應抑制率為62％(見表1)。
表1、藥物對HL60細胞的生長的抑制作用藥物生長抑制率(％)本發明的產物5μM2110μM2520μM3050μM42100μM54陽性對照物RA 100μM46本發明的產物+RA (50μM50μM)62(三次重復，p＜0.05)(二)、不同濃度的本發明的產物及與RA聯合應用對HL60細胞促分化效果觀察分化劑本發明的產物濃度10μM,20μM,30μM,50μM陽性對照物維甲酸(RA)100μM(文獻中有效量)聯合效應物本發明的產物+RA(50μM∶50μM)對照物RPM11640培液HL60細胞5×104/ml培養條件同(一)培養三天后作NBT還原反應，計數200個細胞，記錄含甲顆粒的陽性細胞百分數。
結果如表230μM,50μM本發明的產物作用細胞三天后，NBT陽性率明顯高于對照組，也明顯高于陽性對照組。本發明的產物+RA聯合作用NBT陽性率明顯增高。
表2藥物對HL60細胞的誘導分化作用(p＜0.05)本發明的產物 濃度 NBT陽性率50μM 67％30μM 24％20μM 14％10μM 4％對照 2％陽性對照(RA) 29％聯合效應物(本發明的產物+RA) 77％(三)、本發明的產物對HL60細胞促分化作用的動態觀察分化劑本發明的產物，20μM細胞:HL60細胞，5×104/ml陽性對照物RA(維甲酸)對照物RPM11640培養液聯合效應物本發明的產物+RA(50μM∶50μM)培養條件同上觀察時間2、4、6、8、10天結果培養4天后，隨著藥物處理時間的延長，4-唑氮蘭(NBT)陽性率逐漸增加，第8、第10天明顯高于對照和陽性對照，本發明的產物與RA聯合，顯示出明顯的協同效應，如圖2所示。實驗實例3本發明的產物對白血病患者新鮮骨髓標本誘導分化作用效果觀察例3-1急性粒單細胞白血病(M4)骨髓經分離種入1×105/ml細胞，加入20μM本發明的產物誘導2天計數NBT陽性率。例3-2急性粒細胞白血病(M2b)骨髓經分離種入1×105/ml細胞，加入20μM本發明的產物誘導3天，計數NBT陽性率。例3-3急性粒細胞白血病(M2b)骨髓經分離種入1×105/ml細胞，加入20μM本發明的產物誘導5天，計數NBT陽性率。結果本發明的產物對粒細胞(或粒單細胞)白血病患者的新鮮骨髓標本具有明顯的誘導分化作用，NBT陽性反應率比對照明顯升高。(見表3)表3本發明的產物對白血病人骨髓標本誘導分化作用的觀察病例類型 式Ⅰ結構種入細胞數誘導天數NBT陽性率例1 M4 20μM1×106/ml2 45.0％對照/ 1×106/ml2 21.30％例2 M2b 26μM5×106/ml3 10.0％對照/ 5×106/ml3 1.0％例3 M2b 20μM5×106/ml5 23％對照/ 5×106/ml5 15％實驗實例4二萜類化合物對人白血病細胞裸鼠異種移植瘤的抑癌效果實驗動物模型BALB/C裸鼠，4-5周齡雌雄各半，8只/組細胞用人HL60細胞異種移植瘤分離藥物本發明的產物30μM對照物RPMI1640培液給藥途徑腹腔注射給藥時間30天實驗設計對照組皮下接種細胞1×107個/只實驗Ⅰ組皮下接種細胞1×107個/只腹腔給藥每日一次，100μg/只/天實驗Ⅱ組細胞在體外用30μM本發明的產物處理9天后，細胞作NBT還原實驗，細胞陽性率為40％-50％，按陽性細胞計數接種于裸鼠，2×107個/只，同時腹腔注射100μg/只本發明的產物/天，注射四周。
所有動物均在接種前經銫源照射400rad分別于接種后14、18、23天測量瘤塊大小，計算體積。在實驗結束時統計鼠存活率。
結果列于表4、表5表4本發明的產物對腫瘤生長的影響組別成瘤潛伏期成瘤率(％)抑瘤率(％)對照組6-14天 100/實驗Ⅰ組 18-30天 8043實驗Ⅱ組 23-30天 4555(P＜0.05)
表5本發明的產物對裸鼠生存時間的影響動物數組別 始終存活天數(±SD)存活率P值對照組8 0 24.2±4.78 0實驗組Ⅰ 8 5 28.2±5.04 62％ ＜0.05實驗組Ⅱ 8 8 33.8±3.66 100％＜0.1結論本發明的產物能明顯地抑制HL60細胞生長(三次重復)及腫瘤的形成，并能使裸鼠模型延長壽命。實驗實例5本發明的產物治療人的白血病預臨床效果觀察例數5例，其中3例早幼粒型，效果明顯醫院北大醫院醫師周時間91-92年本發明的產物純度70％以上劑量6-12mg/日。
劑型膠囊，填沖劑淀粉，用藥途徑口服例5-146歲男早幼粒細胞白血病(后轉為粒細胞型)
入院時骨髓中早幼粒白細胞高過50％。1992年2月入院后，用本發明的產物6mg/日，骨髓中早幼粒細胞經32天治療，降至6.5％。例5-235歲男，早幼粒細胞白血病91年入院時，骨髓中早幼粒白血病80％，臨床出現DIC，在治療DIC同時，用本發明的產物12mg/日，2周后，病癥好轉，達部分緩解，出院后繼續應用本發明的產物2個月后，骨髓中病癥達完全緩解以至后來也未復發。(92年3月復查)例5-3:30歲男，早幼粒細胞白血病92年11月住院，骨髓中早幼粒白血病88.5％，合并DIC；住院后，用抗凝劑治療DIC，用本發明的產物與RA合用，2個月后完全緩解。例5-4:67歲，粒單細胞白血病91年3月入院時，骨髓中粒單細胞為64％，化療后無效，應用本發明的產物配合RA后，下降為21％，但外周血中粒單細胞有所升高，可以認為有一定療效。例5-5:38歲，急性粒單型白血病91年1月入院，骨髓中幼粒單細胞為87％，化療7個療程后，用本發明的產物后，有所下降。
結論本發明的產物對早幼型粒型白血病有明顯療效，對粒單型療效次于早幼粒型。實驗實例6本發明的產物對人鼻咽癌的抑制效果實驗動物模型BALB/C裸鼠，無菌飼養，體重18-22g，8只/組細胞株人鼻咽癌(CNE-2)細胞藥物本發明的產物濃度為1×10-4mol/L對照生理鹽水給藥途徑皮下注射治療時間28天實驗方法(1)在無菌條件下，將4.5×105個/ml細胞接種于裸鼠的頸部皮下。同時注射本發明的產物8mg/kg體重，連續注射28天后，測量瘤體大小(測量計算法同實施例4)。(2)接種前，細胞在體外用30μM本發明的產物處理，每日一次，7日后接種于裸鼠，同時注射本發明的產物8mg/kg，分別在21天和28天時測量瘤體大小。結果如表6表6本發明的產物對人鼻咽癌的抑制作用藥物劑量(mg/kg) 成瘤率瘤重mg抑瘤率對照組 0 100％382±240.3 0本發明的產物 8 66％ 123.3±117 67.7％結論本發明的產物對人鼻咽癌裸鼠模型確有明顯的抗癌作用。實驗實例7本發明的產物對人大腸癌的抑制效果實驗動物模型BALB/C裸鼠，雌性，5-7周齡，無菌飼養，8只/組細胞株人大腸癌(CAⅡ細胞)藥物本發明的產物400μg/ml(純度95％以上)對照RPMI 1640培液給藥途徑局部皮下注射給藥時間28天實驗方法(1)接種細胞(1.5×106個/只)后，連續注射本發明的產物(80μg/只/天)4周，解剖測定瘤體大小。(2)用2×10-5mol/L本發明的產物連續處理細胞8天，接種裸鼠(1.5×106個/只)，同時連續注射本發明的產物(80μg/只/天)4周，停藥一周后，解剖測定瘤體大小(統計方法同實施例4)。結果見表7表7本發明的產物對大腸癌的抑制作用組別接種細胞數成瘤潛伏期成瘤率抑瘤率對照組1.5×106個 7～12天 100％0實驗Ⅱ組 1.5 ×106個 100％實驗Ⅰ組 1.5×106個 28～35天 35％ 68.5％
(P＜0.1)結論本發明的產物對人大腸癌裸鼠模型確有明顯抑癌作用。如圖3和4實驗實例8本發明的產物對人胃腺癌(BGC-823)的抑癌效果實驗動物模型BALB/C裸小鼠，5-7周齡，無菌飼養，8只/組細胞株人胃腺癌(BGC-823)細胞藥物本發明的產物400μg/ml(純度95％以上)對照生理鹽水給藥途徑皮下注射給藥時間28天實驗方法(1)用本發明的產物2×10-5mol/L體外處理細胞7天，接種于裸小鼠(1.5×106個/只)，同時連續注射本發明的產物(80μg/只/天)4周，停藥一周后，解剖，測定瘤體大小(方法同前)。(2)接種細胞(1.5×106個/只)，連續注射本發明的產物(80μg/只/天)4周，停藥一周后，解剖測量瘤體大小。結果見表8表8本發明的產物對人胃腺癌(BGC-823)的抑制作用組別成瘤潛伏期成瘤率(％)抑瘤率(％)對照組 5-11天 100實驗Ⅰ組30-35天 2874.2實驗Ⅱ組29-35天 3663(P＜0.05)結論本發明的產物對胃腺癌(BGC-823)裸鼠模型有抑癌作用，效果明顯，如圖4所示。實驗實例9本發明的產物治療人胃腸癌的預臨床效果觀察例數4例醫院內蒙古武警部隊醫院醫師青時間97年3-9月本發明的產物純度90％以上填充劑淀粉劑型膠囊服藥途徑口服 一療程15天劑量6-8mg/kg體重例(1)男46歲，晚期胃癌，手術一年后病理切片證實轉移(肝、淋巴、腹水)，不能進食，臥床不起，服本發明的產物，每日60mg-80mg，兩個療程15×2天。第一療程后，腹水減少，臨床癥狀減輕，能少量進食。第二療程后，腹水消失，淋巴結縮小，全身癥狀改善，能下床行走。
例(2)男45歲，晚期胃癌，剖腹后發現已轉移，不能手術，服藥前不思飲食，不能入睡，服本發明的產物60mg/日，并配合10mg/日維甲酸，一個療程后，食欲增強，臨床癥狀減輕，病情穩定，仍在治療中。
例(3)男75歲，食道癌晚期，未經手術，不能進食，靠輸液維持。每日服用本發明的產物60mg，一個療程后，改變了吃不下飯的臨床癥狀；兩個療程后，每日能進食4兩，臨床癥狀減輕，仍在治療中。
例(4)女60歲，膽囊癌，服本發明的產物60mg/日，并配合10mg/日維甲酸，15天后，臨床癥狀減輕，肝功和肺病理檢查都正常，食欲增加，仍在治療中。上述資料還沒來得及詳細整理，但是有一點可以看出，本發明的產物在改善生活質量方面效果明顯。實驗實例10本發明的產物對人肺癌細胞(PG)裸鼠異種移植瘤的抑癌效果實驗動物模型BALB/C裸小鼠，6-8只/組細胞系人肺癌細胞(PG)移植瘤分離藥物本發明的產物(98％純度以上)，用培養液或生理鹽水配制成濃度0.04％的本發明的產物與RA(SIGMA產品)按1∶1(0.02％∶0.02％)混合。
對照物DMEM培養液或生理鹽水給藥途徑腹腔注射給藥時間4周實驗方法對照組皮下接種細胞(2×107)個/只，接種前用臺盼藍染色，90％以上是活的。
實驗Ⅰ組皮下接種細胞(2×107)個/只，腹腔給藥，每日1次，100μg/只/天，注射8周。
實驗Ⅱ組細胞在體外用30μM本發明的產物處理8天后，細胞(2×107個/只)接種于BALB/裸鼠，同時注射本發明的產物，每日1次，100μg/只/天，注射4周。
實驗Ⅲ組細胞在體外用30μM本發明的產物處理8天后，細胞(2×107個/只)接種于BALB/裸鼠，同時注射本發明的產物+RA，每日1次，100μg(50μg+50μg)/只/天，注射4周。
所有動物均在接種前經銫源照射400rod。
在接種后14天、21天、28天，測量瘤塊，計算體積，其結果如下表9藥物對人肺癌移植瘤的抑制作用組別成瘤潛伏期成瘤率(％)抑瘤率(％)對照組 5-11天 1000實驗Ⅰ組18-28天 28 30.8實驗Ⅱ組21-27天 36 41.3實驗Ⅲ組24天 40 57.6(P＜0.05)結論本發明的產物對PG的抑制作用以及對PG細胞的致癌力有明顯的抑制作用，并能使裸鼠延長壽命。實驗實例11(體外)本發明的產物對成骨肉瘤細胞增殖的抑制效果實驗，及本發明的產物與RA的協同效應實驗。
細胞模型成骨肉瘤細胞(UMR106)藥物本發明的產物(純度98％)濃度10-5mol/L；聯合用藥維甲酸(RA)10-5mol/L+本發明的產物10-5mol/L陽性對照藥維甲酸(RA)10-5mol/L對照物無血清MEM培養基實驗方法1)增殖曲線細胞接種與50ml培養瓶中，接種數為8×105個，分別用10-5mol/L處理UMR 106細胞，(37℃,5％CO2恒溫孵育)連續處理24h,48h,72h,96h,臺盼藍染色后，計數，設相應對照。
實驗結果UMR106增殖率從63.6％降低到40.5％，如圖5和6所示。2)DNA合成(3H-TdR摻入實驗)將8×105個細胞接種與48孔培養板上，37℃、5％CO2恒溫孵育，用10-5mol/L本發明的產物處理細胞24小時，加入2μCi3H-TdR溫育6小時，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，用0.25％胰酶消化，收集細胞滴在玻璃纖維膜上，用醇醚混合液洗膜，干燥后加入閃爍液，用液閃儀計數。
結果本發明的產物TdR的摻入率降低84％，本發明的產物+RATdR摻入率降低90％，RATdR的摻入率降低84％。(三次重復實驗)結論本發明的產物能夠抑制UMR106細胞增殖抑制其DNA合成如圖7所示。實驗實例12(體外)本發明的產物對白血病(HL60)，紅白血病細胞(K562)，鼠肉瘤細胞(S180)的DNA合成的抑制效果及與RA的協同效應實驗。
細胞模型人白血病細胞(HL60)，人紅白血病細胞(K562)，鼠肉瘤細胞(S180)藥物(1)本發明的產物(HPLC純)(2)陽性對照維甲酸(RA)(3)聯合應用物本發明的產物+RA濃度(1)10-5mol/L(2)10-5mol/L(3)10-5mol/L:10-5mol/L培養條件培基RPlM 1640,37℃,5％CO2恒溫孵育實驗方法3H-TdR摻入將細胞分別接種于24孔板上，細胞數為8×105個，用10-5mol/L本發明的產物、10-5mol/LRA、本發明的產物+RA(1∶1)分別處理2-4小時，加入2μCi3H-TdR，溫育6小時，用冷PBS洗3次，用0.25％胰酶消化，收集細胞，滴在玻璃纖維膜上，用醇混合液洗膜，干燥后加入閃爍液，用液閃儀計數。
結果見表10表103H-TdR摻入率細胞系本發明的產物RA本發明的產物+RAHL60細胞降低80％ 68％ 87％K562細胞降低39％ 19％ 53％S180細胞降低33％ 60％ 72％
結論本發明的產物能夠抑制HL60細胞、K562細胞、S180細胞DNA合成的抑制作用，如圖8所示。
近年來，根據腫瘤細胞的分化中止于某一發育階段的理論，提出應用誘導分化方法，使腫瘤細胞繼續分化，而使其表型趨于正常。如何使癌細胞的增殖逆轉，促進其向正常分化是當前腫瘤發病機理和治療學研究的熱點，它對傳統單一殺傷腫瘤細胞的治療方針是一個極重要的補充。
國內外許多實驗室試圖尋找對癌細胞有較強的抑制作用，而對正常細胞毒性較小的有效抗癌藥物，本發明的二萜類化合物正是為了這一目的。本發明提供的二萜類化合物有效成份是腺苷酸環化酶(Adenylate cyclase)的特異性激活劑，它能夠抑制癌細胞的異常增殖，促其向正常細胞分化逆轉，而無害于正常細胞，這-特點是當前癌癥治療的新方向。本發明的從鞘蕊花屬植物中提取的二萜類化合物除對癌細胞具有明顯的促分化抑增殖作用外，還能夠下調EGF受體和TGF-α的自分泌能夠調控第二信使的傳遞；抑制癌細胞的DNA合成，阻斷細胞周期G1向S期移行；阻遏癌基因(C-myc、H-ras)的表達，促進抑癌基因(p53)的表達；調控生長因子受體基因(EGF-R、TGF-α、TGF-β)的表達。可以肯定本發明的化合物對癌細胞的惡性增殖具有較強的負調控作用，并誘導癌細胞惡性表型和亞細胞結構的分化逆轉，其作用明顯優于維甲酸(RA)，且獨特之處在于細胞超微結構觀察沒有毒殺作用，動物抑瘤作用顯著；急性毒性試驗為微毒；與維甲酸聯合應用顯示出良好的協同效應。
本發明的優點本發明的式Ⅰ結構二萜類化合物一反傳統的細胞毒藥物的性質，即不殺傷正常細胞，誘導癌細胞的逆轉分化，具有較強的抑制腫瘤細胞惡性增殖，促進其向正常細胞分化的負調控作用，且具有廣譜性的抗癌藥效以及毒性甚微的優點。對癌癥的全身性治療調整具有明顯的效果，降低手術后腫瘤復發率；還可配合放化療，抑制腫瘤轉移穩定病情，改善患者的生活質量，延長生命以及治愈腫瘤都將會起到積極的作用。另外式Ⅰ結構的二萜類化合物與維甲酸協同使用更可提高藥效，克服癌細胞的耐藥性。此外，還有降壓、強心、鎮痛和治療皮炎等作用。
本發明的制備方法工藝簡單，設備投資少，生產成本低，最主要的優點是在生產過程中不使用毒性大的溶劑，有機溶劑用量少(產品中不殘留)，產品純度高，醫用對人安全。使用該方法獲得的產品純度在98％以上，產品提取率超過0.1％。
本發明的二萜類化合物主要藥效(1)對腫瘤細胞體外生長的抑制作用曾分別以10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L濃度的本發明的產物分別處理大鼠成骨肉瘤細胞(UMR106)，人白血病細胞(IIL-60)，人胃癌細胞(BGC-823)，人肺癌細胞(PG)，人鼻咽癌細胞(CNE-2)，人結腸癌CAⅡ細胞系，生長抑制率為43％-59％，用最佳濃度10-5mol/L本發明的產物分別處理UMR106、BGC-823、PG細胞，軟瓊脂集薄形成能力顯著降低；熒光偏振度技術測定本發明的產物處理后的正常C3Ⅱ10細胞及轉化的C3Ⅱ10細胞，正常細胞膜微粘度值變化較小，而轉化細胞的微粘度值明顯升高，說明癌細胞膜脂流動性被降低；用10-3mol/L本發明的產物處理UMR106、K562、S180、HL-60細胞，用TdR雙阻斷法測定，3H-TdR相對參入率明顯降低，降低率為39-84％UMR106細胞經本發明的產物處理后，在倒置顯微鏡下可見細胞由雜亂無章變成梭形有序排列，掃描電鏡下觀察，細胞表面微絨毛幾乎完全消失，細胞由多折皺、變得豐滿光滑、細胞形態呈梭狀，似正常成纖維細胞。透射電鏡觀察亞細胞結構趨向正常分化，即核質比明顯降低，核出現分化葉，核糖體大量減少，溶酶體增多等。
(2)對動物移植性腫瘤的抑制作用用本發明的產物腹腔注射治療4周，對昆明小鼠體內S180肉瘤模型和Ehrlich ascise細胞造成的腹水癌的抑癌率分別為66％(p＜0.05)和73.3％(p＜0.1)。
(3)對人體移植性腫瘤的抑制作用將BGC-832細胞，PG細胞，CNE-2細胞分別接種于BALB/C裸鼠，同時用本發明的產物局部注射治療，4周后，腫瘤抑制率分別為72％、42％、68％(p＜0.05-0.1)。
(4)本發明的產物處理后的癌細胞的致瘤抑制作用用本發明的產物處理CAⅡ細胞，CNE-2細胞，PG細胞，同時注射本發明的產物；4周后成瘤抑制率分別為61.8％、67.7％、41％(p＜0.05)，對照組的成瘤率為100％。
(5)最佳藥效的實施用本發明的產物與維甲酸(RA)聯合應用，抑癌作用明顯增高。體外實驗結果對成骨肉瘤(UM106)的生長抑制率比單用本發明的產物提高30.6％；對細胞周期的阻斷作用提高11％；對HL60、K562、S180細胞，DNA合成的降低作用分別提高8.5％,28％,30.5％。
體內實驗結果動物移植瘤抑瘤率(S180)提高16％；人異種移植瘤抑瘤率人胃癌(BGC-823)提高28.8％；人肺癌(PG)提高8.8％。
當本發明的化合物用作治療藥物時，可口服或用作注射針劑(如靜脈注射、肌肉注射、皮下注射等)其有效劑量取決于用藥患者的臨床癥狀，疾病的程度、體重和年齡、醫生的判斷等。通常，用藥劑量為0.6mg～2mg/公斤/天，一天可分1-3次服用。
當本發明的化合物作為藥物使用時，可將有效量的化合物與可藥用的載體或稀釋劑(如賦形劑、溶劑、其它輔助劑等)一起配制成適于給藥的給藥單位，例如配制成下述劑型片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、腸內吸收劑、錠劑、糖漿、酏劑、液體制劑、懸浮液和乳液。
適用于上述制劑中的載體或稀釋劑，有賦形劑如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇和羧甲基纖維素；潤滑劑如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石粉；粘結劑如糊精、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯膠、玉米淀粉和明膠；崩解劑如土豆淀粉和羧甲基纖維素；稀釋劑如注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、丙二醇和聚乙二醇；等等，此外，需要時，可以加入調味劑、著色劑、張力劑、穩定劑、防腐劑、使本發明化合物成為無痛的試劑等。
此外，需要時，也可將另外的藥理活性物質配入本發明的藥物中，使藥物發揮更好的藥效。
下面結合附圖及實施例對本發明做詳細說明圖1毛喉萜對于人胃癌細胞(BGC-823)的生長抑制作用圖。
圖2在不同時間內用本發明的產物處理HL60細胞，NBT的增殖率圖。
圖3本發明的產物、RA、本發明的產物+RA分別對人結腸癌細胞(CAⅡ)、人鼻咽癌細胞(CNE-2)致瘤力的抑制作用比較圖。
圖4本發明的產物、RA、本發明的產物+RA分別對人胃癌細胞(BG-823)、人結腸癌細胞(CAⅡ)移植性腫瘤的抑制作用比較圖。
圖5在不同時間內本發明的產物、RA、本發明的產物+RA對UMR106細胞增殖的抑制作用圖。
圖6在不同時間內本發明的產物、RA、本發明的產物+RA對UMR106細胞生長的抑制率圖。
圖7本發明的產物、RA、本發明的產物+RA對UMR106細胞3H-TdR摻入率的抑制作用圖。
圖8本發明的產物、RA、本發明的產物+RA分別對HL60細胞、K562細胞、S180細胞3H-TdR摻入率的抑制作用圖。
圖9本發明的產物、RA、本發明的產物+RA對人肺癌細胞(PG)致瘤力的抑制作用圖。
圖10Lg(D)-p正規偏差值曲線11Lg(D)-p正規偏差值直線面說明如下圖1中---▲---▲---表示對照組---■---■---表示0.2×10-5mol/L毛喉萜---◆---◆---表示2×10-5mol/L毛喉萜圖2中-口-口-表示本發明的產物(20μmol/L)-△-△-表示RA(260μmol/L)-◇-◇-表示對照(0.25％乙醇)-×-×-表示本發明的產物與RA合用圖3-圖9中
表示C
表示本發明的產物
表示RA
表示本發明的產物+RA實施例1制備式(Ⅰ)結構的二萜類化合物①取鞘蕊花根或莖干粉350克，加入1500ml工業酒精回流48小時后，(溫度控制在70°～80℃或室溫下)真空濃縮干燥后，②加400ml水，攪拌30～40分種后，離心(3000RPM/min，10分鐘)棄上清液留沉淀，③再加入130～150ml石油醚攪拌30′后離心(3000RPM/min，10分鐘)，留沉淀，再加入130ml石油醚攪拌20′后，離心取沉淀(為粗的本發明的產物7種組分混合物)，④加入130～150ml甲醇攪拌20′～30′，離心，取上清液，沉淀中，再加入甲醇重復上步，取上清同前一次上清液合并。(粗品五種組份)。⑤取20ml的層析氧化鋁液體，加入到上步的上清液中，攪拌吸附后，真空抽干。⑥取40ml層析氧化鋁裝入層析柱，把上述20ml吸附好的樣品氧化鋁加到柱上，用苯洗脫，收集洗脫液真空抽干。(較純的本發明的產物)⑦將抽干的樣品脫色，用95％酒精130ml溶解5-6g樣品，離心取上清液加入20～30ml吐溫80或吐溫20和司班80混合，真空抽干，加水攪拌，離心。留沉淀，甲醇溶解，真空抽干，烘烤成白色干粉末，分子量410，熔點為226～228℃，理化性質穩定，即對光、熱穩定，加熱至226～230℃不升華，冷卻后又成晶體，在有機溶劑(乙醇、甲醇、苯、乙酸乙酯、二甲基亞砜)中也很穩定，可長期在室溫下保存。實施例2利用實施例1得到的式(Ⅰ)結構的二萜類化合物與維甲酸(RA)協同使用，作為藥物制劑。
根據臨床治療學的角度，治療惡性腫瘤時，聯合應用二種或多種藥物較使用單一藥物更為有效，而且可降低毒性，克服癌細胞的耐藥性，本發明提供二萜類化合物與維甲酸(RA)聯合應用，發現它們有良好的協同效應，表現出更強的抑癌作用。本發明在藥理實驗中發現本發明的產物與RA具有協同效應，并在結構上的部分互為重疊，如下結構式
(式Ⅰ)結構與RA結構疊合由此為依據將本發明的產物與RA聯合匹配制成混合藥物，用于人體移植瘤實驗。如對人肺癌PG細胞的移植瘤實驗①將本發明的產物10-5mol/L和RA10-5mol/L混合，用生理鹽水或細胞培養液配制，②選6-8只/組，5-7周齡BALB/C裸小鼠，經銫源照射400rad(接種細胞前)，③取人肺癌癌細胞(PG)皮下接種于裸小鼠，接種前用臺盼藍檢測其活細胞數90％以上。④取100μg/0.3ml本發明的產物+RA混合液，腹腔注射，每日1次。對照組注射生理鹽水或培養基連續注射4周，⑤在注射14天、21天、28天，停藥一周后解劑，測量瘤塊大小，計算瘤體積，和抑癌率。(2)本發明的產物+RA對癌細胞致癌力的抑制實驗。將人肺癌細胞用30μM本發明的產物處理8天后，PG細胞2×107個接種于BALB/C小鼠，同時注射本發明的產物+RA混合液，注射28天，停藥一周后解剖，測量瘤塊大小，計算，致瘤率的大小。(3)同時計算動物存活率的延長率，其抑瘤率結果和裸鼠生存時間如下表11藥物對人肺癌移植裸鼠的抑瘤作用組別成瘤潛伏期成瘤率抑瘤率對照組5～12天 100％(1) 25～30天 16％ 54％(2) 25～32天 13％ 65％(P＜0.05)表12裸鼠生存時間組別 動物數存活天數p值對照組 8 13實驗(1)組 8 32 ＜0.05實驗(2)組 8 35 ＜0.01實施例3利用實施例1得到的式(Ⅰ)結構的二萜類化合物與維甲酸(RA)協同使用，對大鼠成骨肉瘤UMR106細胞增殖的抑制實驗細胞模型成骨肉瘤細胞(UMR106)藥物本發明的產物(純度98％)濃度10-5mol/L和RA10-5mol/L混合，用生理鹽水或細胞培養液配制，注射給小鼠，與對照組實驗數據如表13。
表13本發明的產物和RA對UMR106細胞增殖的抑制作用時間(小時)24 48 72 96對照(細胞數)1.40+0.23×1061.87+0.28×1062.58+0.31×1063.6+0.31×106生長率(％) 100 100 100 100本發明產物(細胞數) 0.89+0.20×1060.99+0.24×1061.22+0.27×1061.46+0.30×106生長率(％) 63.652.947.2 40.5RA(細胞數) 1.03+0.21×1061.15+0.24×1061.48+0.32×1061.96+0.27×106生長率(％) 73.661.457.4 52.8本發明產物+RA細胞數 0.70+0.25×1060.81+0.23×1060.96+0.25×1061.04+0.28×106生長率(％) 50 43 37.2 28.權利要求
1.一種從熱帶鞘蕊花屬植物中提取的式Ⅰ結構表示的分子量為410，熔點226-228℃的白色結晶二萜類化合物
2.一種制備權利要求1的式Ⅰ結構的二萜類化合物的方法，其特征在于包括如下步驟①用干凈的鞘蕊花的根或莖磨碎成粉末，進行去水干燥；②干燥后的植物粉末用有機溶劑萃取，干粉與萃取劑用量比例為1∶3～10份，采用通常的浸泡式回流萃取，萃取時間2-4天，溫度30-80℃，可得產物包括1-7位的二萜類化合物；③進一步用石油醚提取，步驟②的提取物與萃取劑用量按1∶100～150的比例，操作方法同上，提取時間10-60′提取溫度20-60℃；④步驟③的產物用甲醇溶劑提取，操作方法同上，提取時間40′-60′提取溫度30-60℃；⑤步驟④的產物在氧化鋁層析柱內用苯溶液洗脫，洗脫按3～5洗脫體積進行。
3.按權利要求2所述的提取式Ⅰ結構的二萜類化合物的方法，其特征在于還包括在上述步驟后進行的脫色工藝，取上一步驟提取的式Ⅰ結構的二萜類化合物和脫色劑按1∶30～50份比例混合配成懸浮液，離心分離。
4.按權利要求3所述的提取式Ⅰ結構的二萜類化合物的方法，其特征在于所述的脫色劑包括非離子去污劑吐溫80、吐溫20、司班80或活性碳。
5.按權利要求3所述的提取二萜類化合物的方法，其特征在于還包括在上述步驟后再進行高壓液相色譜純化工藝。
6.按權利要求3所述的提取二萜類化合物的方法，其特征在于所述的有機溶劑包括丙酮、乙醇和苯。
7.一種權利要求1的式Ⅰ結構的二萜類化合物的用途，其特征在于用于治療白血病、鼻咽癌、胃腸癌、食道癌、膽囊癌或皮炎和用于強心或鎮痛。
8.按權利要求1所述式Ⅰ結構的二萜類化合物的藥物制劑，其特征在于有效劑量為0.6-2.0mg/公斤體重/日。
9.按權利要求8所述的用于治療癌癥的藥物制劑，其特征在于還包括0.6mg-2mg/公斤/天有效劑量的權利要求1所公開的式(Ⅰ)結構的二萜類化合物與0.2-0.6mg/公斤/天有效劑量的維甲酸混合使用。
10.按權利要求8所述的用于治療癌癥的藥物制劑，其特征在于包括有效劑量的權利要求1所公開的式(Ⅰ)結構的二萜類化合物及其可藥用的載體或稀釋劑。
全文摘要
本發明涉及一種從熱帶鞘蕊花屬植物提取的式Ⅰ結構二萜類化合物及制備方法和用途。該方法將鞘蕊花根或莖磨成粉,經有機溶劑萃取,石油醚脫脂,甲醇提取,氧化鋁層析得到式Ⅰ結構的純品。該化合物有廣譜性抑癌作用,用于治療鼻咽癌,白血病,胃腸癌,食道癌,膽囊癌等,其主要特點是抑制癌細胞增殖,促進癌細胞向正常逆轉分化,一反傳統細胞毒藥物的性質,不殺傷正常細胞。該化合物可與維甲酸聯合應用,增強療效。
文檔編號C07D311/92GK1220992SQ9812441
公開日1999年6月30日 申請日期1998年10月30日 優先權日1997年10月30日
發明者王敬澤, 孟琨 申請人:中國科學院動物研究所