一種轉人神經生長因子基因的小鼠及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及通過轉基因方法獲得的動物及其制備方法和應用，特別設及一種轉人 神經生長因子基因的小鼠及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 神經生長因子（即Nerve Growth Factor,簡稱NGF)是神經營養素家族的第一位成 員，它由Cohen和Levi-Mon化Icini在1954年發現,并在隨后的研究中闡明了其功能。Cohen 和Levi-Montalcini因此獲得了 1986年的諾貝爾醫學或生理獎。NGF不但對神經細胞的增殖 和分化有重要作用，還對非神經細胞，例如免疫細胞、成纖維細胞、膜腺細胞和屯、肌細胞等 的生長和活性都有重要功能。因此，NGF對神經性和非神經性疾病都有良好的潛在治療作 用。
[0003] 因為鼠神經生長因子即鼠源NGF(mouse NGF，mNGF)和人神經生長因子即人源NGF 化uman NGF，hNGF)在氨基酸序列上有85 %的同源性，并且許多研究已經報道鼠源NGF對治 療各種神經損傷或退化疾病有明顯的效果，從雄性小鼠的頌下腺純化而來的鼠源NGF在 2003年已被中國藥監局批準用于治療人神經損傷和退化相關疾病。目前，在中國藥品市場 上，鼠源NGF的價格約為1000元/毫克，2015年的銷售總量約為5百萬毫克，產量遠遠不足W 滿足市場需求。而且，最新的研究發現鼠源NGF和人源NGF在生理、生化和生物特性上存在顯 著的差異，并且在人細胞中鼠源NGF的生物活性顯著低于人源NGF。此外，由于鼠源NGF對人 來說是一種外源蛋白，在使用鼠源NGF進行治療可能會導致病人產生免疫反應，不太安全。
[0004] 為了消除鼠源NGF用于人類治療時帶來的上述問題，已經有許多研究嘗試通過大 腸桿菌、酵母、昆蟲細胞，哺乳動物細胞等表達系統來生產人源NGF。但是運些細胞系統表達 人源NGF的產量通常較低，并且其中一些系統無法對其所合成的人源NGF提供正確的翻譯后 修飾，影響人源NGF的藥用效果。同時，已有團隊嘗試利用轉基因兔的乳腺作為生物反應器 生產人源NGF。但乳腺作為生物反應器存在如下缺陷：1)只有性成熟后并且處在哺乳期的雌 性動物才能分泌乳汁;2)乳汁的分泌量有限;3)乳汁含有大量的內源蛋白，不利于從乳汁中 純化出所特異表達的外源蛋白即人源NGF。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種轉人神經生長因子基因的小鼠，通過轉基因方法將人源 NGF序列插入小鼠第5號染色體上，并獲得能在第5號染色體上穩定遺傳人源NGF基因序列和 在唾液腺組織特異表達具有生物活性的人源NGF的轉人神經生長因子基因的小鼠，并利用 該轉人神經生長因子基因的小鼠唾液腺作為生物反應器生產人源NGF藥物，且從轉人神經 生長因子基因的小鼠分泌的唾液中分離純化出人源NGF，并將人源NGF應用于人類疾病的治 療。由于小鼠唾液分泌量大，產生的人源NGF也多，而且唾液中內源蛋白較少，便于人源NGF 的分離純化;且唾液腺能對NGF產生正確的翻譯后修飾，產生的NGF是人源化的，其在人類疾 病治療時不會產生免疫反應，更加安全，因此可W解決上述問題。
[0006] 根據本發明的一個方面，提供了轉人神經生長因子基因的小鼠，該轉人神經生長 因子基因的小鼠的基因組中包含人源NGF基因序列，且該轉人神經生長因子基因的小鼠唾 液腺特異表達人源NGF。由此，該轉人神經生長因子基因的小鼠可W通過唾液分泌來產生人 源NGF，再對唾液中人源NGF進行分離提純，得到純化后的人源NGF并可用于人類疾病的治 療。該轉人神經生長因子基因的小鼠可W通過繁殖來獲得數量龐大的家系，并源源不斷的 產生唾液，從而獲得更多的人源NGF，而且能在唾液腺中進行正確的翻譯后修飾，W及唾液 中內源蛋白較少便于人源NGF的分離純化。而該人源NGF是人源化的，在用于人類疾病治療 時不會產生免疫反應，更加安全。
[0007] 在一些實施方式中，該人神經生長因子基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[000引在一些實施方式中，該人神經生長因子基因序列整合在轉人神經生長因子基因的 小鼠的第5號染色體上。
[0009] 在一些實施方式中，該人神經生長因子基因序列整合在轉人神經生長因子基因的 小鼠的第5號染色體的qu曰nine nucleotide-binding protein subunit曰Iph曰-12基因與 caspase recruitment domain-containing protein 11 基因間的非編碼間隔序列上的一 個叮TAA"位點中，且qu曰nine nucleotide-binding protein subunit 曰Iph曰-12與caspase recruitment domain-containing protein 11基因是小鼠第5號染色體上的已知公開基 因。由此，人源NGF基因序列整合在轉人神經生長因子基因的小鼠的第5號染色體且定點插 入第5號染色體qimnine nucleotide-bindin邑 protein subunit 曰Iph曰-12基因與c曰sp曰se recruitment domain-confining protein 11 基因間的非編碼間隔序列上的一個"TTAA" 位點中，該轉人神經生長因子基因的小鼠在唾液腺中特異表達人源NGF及從該轉人神經生 長因子基因的小鼠唾液中分離純化的人源NGF藥物具有更好的生物活性，對人類相關疾病 的治療具有更好的效果。
[0010] 根據本發明的另一個方面，提供了轉人神經生長因子基因的小鼠的制備方法，該 轉人神經生長因子基因的小鼠通過轉基因技術將人源NGF整合到小鼠基因組中，并能在轉 人神經生長因子基因的小鼠后代中穩定的遺傳。因此，通過該方法可W獲得能在后代中穩 定遺傳的包含人源NGF基因序列的轉人神經生長因子基因的小鼠，且該轉人神經生長因子 基因的小鼠的唾液腺特異分泌人源NGF，唾液中分泌的人源NGF被分離純化后可用于人類疾 病的治療，且通過該方法獲得的轉人神經生長因子基因的小鼠，及通過該轉人神經生長因 子基因的小鼠分離純化的人源NGF，產量高、不會對人類產生免疫反應更加安全，該方法包 括如下步驟：
[0011] (1)構建轉座子載體，該轉座子載體包含如SEQ ID NO: 1所示的人源NGF基因序列、 如SEQ ID N0:5所示的腮腺分泌蛋白基因啟動子序列、如SEQ ID N0:6所示的轉座子 口1邑邑78日〇5'末端重復序列和如560 10^:7所示的轉座子91肖肖78日。3'末端重復序列；
[0012] (2)將構建好的轉座子載體注射至小鼠受精卵的雄原核，然后將注射后的小鼠受 精卵移植至代孕母鼠的子宮內，飼養代孕母鼠至小鼠出生；
[OOU] (3)對出生的小鼠進行檢測，篩選出人源NGF基因能在后代中穩定遺傳的轉人神經 生長因子基因的小鼠。
[0014] 在一些實施方式中，轉座子載體的序列如SEQ ID N0:8所示。
[0015] 在一些實施方式中，轉座子載體整合在轉人神經生長因子基因的小鼠的第5號染 色體的qu曰nine nucleotide-binding protein subunit 曰Iph曰-12基因與c曰sp曰se recruitment domain-containing proteinll基因間的非編碼間隔序列上的一個"TTAA"位 點中。
[0016] 根據本發明的另一個方面，提供了制備人神經生長因子藥物的方法，通過建立利 用轉人神經生長因子基因的小鼠的唾液腺作為生物反應器生產人源NGF藥物的方法，獲得 在唾液腺組織特異表達具有生物活性的人源NGF的轉人神經生長因子基因的小鼠，且從轉 人神經生長因子基因的小鼠分泌的唾液中分離純化出人源NGF，通過該方法獲得的人源NGF 產量更高、生物安全性更好，該方法包括如下步驟：
[0017] 1)根據上述方法培養轉人神經生長因子基因的小鼠，該轉人神經生長因子基因的 小鼠為根據權利要求上述轉人神經生長因子基因的小鼠；
[001引2)從步驟1)中所述轉人神經生長因子基因的小鼠的唾液中分離純化出人源NGF藥 物。
[0019] 在一些實施方式中，該人源NGF藥物能夠促進NGF受體細胞增殖。
[0020] 在一些實施方式中，該人源NGF藥物能夠做成制劑用于人類疾病的治療。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為轉座子載體結構示意圖。
[00剖圖2為轉基因原代小鼠 PCR檢測電泳結果圖，圖中"N"表示空白對照，"WT"表示野生 型小鼠，甲'表示陽性對照，表示Marker標記，"557-569"表示轉基因原代小鼠。
[0023] 圖3為轉基因原代小鼠的巧光結果圖。
[0024] 圖4為轉基因原代小鼠的Southern blot結果圖，圖中表示Marker標記，"P (3C)"表示陽性對照（3個拷貝），"P(5Cr表示陽性對照（5個拷貝），"WT"表示野生型小鼠， "557-56滬表示轉基因原代小鼠。
[0025] 圖5為轉基因原代小鼠腮腺中hNGF mRNA的相對表達量檢測結果。
[00%]圖6為轉人神經生長因子基因的小鼠家系中唾液分泌NGF的濃度檢測結果。
[0027]圖7為包含人源NGF基因序列的轉座子載體序列整合在553家系轉人神經生長因子 基因的小鼠第5號染色體上的比對結果分析圖。
[002引圖8為轉人神經生長因子基因的小鼠不同組織中hNGF檢測結果圖，圖中表示 Marker標記，"TG"表示轉人神經生長因子基因的小鼠，叩a"表示腮腺，"Sm"表示頌下腺， "S1"表示舌下腺，"Muscle"表示肌肉，"Liver"表示肝臟，"Lung"表示肺，"Fat"表示脂肪， 叮estis"表示睪丸組織，"N"表示空白對照，"WT Pa"表示野生型小鼠腮腺。
[0029] 圖9為轉人神經生長因子基因的小鼠3個唾液腺組織中hNGF mRNA相對表達量檢測 結果圖。
[0030] 圖10為轉人神經生長因子基因的小鼠及野生型小鼠分別在白光及巧光下照片結 果，圖中叮G"表示轉人神經生長因子基因的小鼠，"WT"表示野生型小鼠。
[0031 ]圖11為轉人神經生長因子基因的小鼠及野生型小鼠 3個唾液腺組織中mNGF表達檢 測結果圖，圖中"WT male"表示野生型公鼠，"WT female"表示野生型母鼠，"