一種促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法
【技術領域】
[0001]本發明是一種促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的技術方法，屬于生物醫學的干細胞與組織工程學技術領域。
【背景技術】
[0002]干細胞體外分化為生殖細胞為治療不孕不育帶來了新的希望。胚胎干細胞向配子分化的研究已經有較多報道，但是它存在著道德倫理的爭議。而患者皮膚干細胞向配子分化具有取材方便、來源豐富和避免移植的免疫反應等優點，成為干細胞向配子分化研究的一個新的開拓方向。將干細胞分化成配子的研究和應用需要大量的早期生殖細胞，在體外如何高效的獲得數量更多的原始生殖細胞是我們目前亟待解決的問題之一。
[0003]皮膚是人體中最大的器官，在機體中具有較強的再生能力。皮膚干細胞賦予了皮膚極強的修復和再生能力，它在胚胎發育階段由外胚層分化而來，直至成年一直具有增殖分化的潛能。皮膚干細胞具有三個顯著的特征:首先，它具有慢周期性，其增殖周期為短暫增殖細胞的兩倍，由于其分裂緩慢，在細胞分裂活躍時加入氚標的胸苷可長期檢測到其放射活性；其次，它在體外培養過程中能夠無限增殖，在機體中有能夠自我更新，保證了損傷的正常修復，正常成人的皮膚每2秒鐘就會產生100萬個新生細胞，大約每28天更新一次。皮膚干細胞的另一個特點是具有黏附性，主要通過表達整合素蛋白實現對基底膜的黏附，這一特性是誘導干細胞脫離干細胞群落進入分化的重要過程。皮膚干細胞的這些特性是研究成體干細胞向生殖細胞分化過程的基礎，有科學家分離了豬的皮膚來源干細胞并且證明了其具有多向分化的潛能，隨后，他們證明豬來源皮膚干細胞在豬卵泡液的誘導下具有體外分化成卵母細胞的能力，并且這些卵母細胞樣細胞能夠發育成孤雌胚胎樣結構。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于克服現有技術缺點，提供一種促進新生小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法。本發明方法分離新生鼠皮膚，體外培養皮膚干細胞，利用視黃酸誘導成功獲得大量狀態良好的原始生殖細胞。
[0005]具體操作如下:
第一步:小鼠皮膚干細胞的分離培養
收集出生當天小鼠，用剪刀和鑷子將小鼠背部皮膚整塊撕下來，將皮膚組織剪成1-2_2左右的碎片，消化后棄掉消化液，使用40 μ m細胞濾器過濾細胞，收集單細胞。加皮膚干細胞培養液重懸細胞，將細胞過150目細胞篩。
[0006]第二步:小鼠皮膚干細胞體外形成擬胚體結構
當細胞培養到第二代又3-4天時，將細胞收集到離心管中，離心，棄上清液，加入擬胚體分化培養液，吹打成單細胞，細胞計數，分散到24孔板中培養，每兩天換半液，用槍將其吹散，繼續懸浮培養，I天后懸浮細胞會聚集形成擬胚體結構，4天時擬胚體結構變得致密，并且體積增大。
[0007]第三步:小鼠胚胎成纖維細胞的培養及飼養層細胞的制備
取出子宮中的胎鼠，只保留軀干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化。消化后用移液槍吹打，離心，加培養液重懸細胞，400目細胞篩過濾，把細胞接種到成纖維細胞培養液中培養，貼壁培養，作PO代。傳代時收集細胞懸液，離心，接入成纖維細胞培養液中培養。選P2-P4代生長在對數期的胚胎成纖維細胞，加入含有絲裂霉素C的成纖維細胞培養液，培養箱中孵育。孵育完后用PBS洗5遍，用0.25%胰蛋白酶將貼壁的成纖維細胞消化下來，收集細胞。重懸細胞后，轉入24孔貼壁培養板，每孔接種6-8 X 14個成纖維細胞，幾乎全部細胞貼壁后可用來做飼養層細胞。
[0008]第四步:擬胚體細胞與飼養層細胞共培養向原始生殖細胞分化
將培養的擬胚體消化成單細胞，加入少量原始生殖細胞培養液懸浮細胞，將細胞稀釋為15個cells/ml，然后接種到飼養層細胞所在的24孔板中，用原始生殖細胞培養液培養。兩天后，待到幾乎全部的細胞貼壁生長，在不破壞培養皿底部細胞的基礎上，用移液槍吸走全部培養液，加入500 μ I新的含有不同濃度的視黃酸(O ymol/L~10 ymol/L )的原始生殖細胞培養液，繼續培養，此后每兩天換半液，即吸出200 μ I培養液，加入250 μ I預暖的新鮮原始生殖細胞培養液。培養至第4天之后，原始生殖細胞開始大量出現。
[0009]通過以下步驟來檢測和驗證視黃酸對原始生殖細胞增殖的促進作用:
1、溴脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)染色
小鼠原始生殖細胞與飼養層細胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化液消化下來并消化成單細胞固定、染色、一抗二抗孵育，封片，鏡檢
2、細胞免疫熒光
小鼠原始生殖細胞與飼養層細胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化液消化下來并消化成單細胞，PBS清洗，固定，山羊血清封閉，一抗、二抗孵育，封片，鏡檢
3、流式細胞儀分析細胞周期
收集細胞，消化成單細胞，清洗，乙醇固定，加50 μ I PI稀釋液孵育，加入I ml PBS混勻，過300目細胞篩，將細胞轉移到流式管中上機。
[0010]4、流式統計小鼠原始生殖細胞SSEA-1的陽性細胞
收集細胞，消化成單細胞，清洗，多聚甲醛固定，清洗，加入PBST (含0.05% TritonX-100的PBS)透化，加入含山羊血清或馬血清的PBST，室溫封閉一小時，加入二抗(FITC標記的山羊抗小鼠)，37°C避光放置I小時，PBS清洗，加入4%多聚甲醛，300目細胞篩過濾，上機。
[0011]本說明書中出現的中英文技術術語對照:胚胎干細胞一 ESCs ;皮膚干細胞一SDSCs ;原始生殖細胞一 PGCs ;擬胚體一 EBs ;胚胎成纖維細胞一 MEF ;磷酸鹽緩沖液一 PBS
本發明方法建立了視黃酸促進小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞增殖的方法，從有限的材料來源獲得大量的原始細胞樣細胞，操作簡便，可重復性好。為小鼠皮膚干細胞體外培養及研究應用提供了技術基礎。
【附圖說明】
[0012]附圖是小鼠原始生殖細胞的分化以及視黃酸對增殖的影響
其中，A-D分別是培養4天時添加O μΜ、2 μΜ、5 μΜ和10 μΜ視黃酸的原始生殖細胞形態；E-H分別是培養6天時添加O μΜ、2 μΜ、5 μ M和10 μ M視黃酸的原始生殖細胞形態；1-L分別是培養8天時添加O μ Μ、2 μ Μ、5 μ M和10 μ M視黃酸的原始生殖細胞形
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【具體實施方式】
[0013]實施例一:
第一步:小鼠皮膚干細胞的分離培養
收集出生當天小鼠，用剪刀和鑷子將小鼠背部皮膚整塊撕下來，去掉脂肪和血液，將干凈的皮膚組織用PBS洗三遍，剪成1-2 mm2左右的碎片，剪碎的組織加入1ml PBS1500rpm離心5min，棄上清，加加I ml 0.25% Trypsin+0.04% EDTA消化液后，用槍頭攪拌混勻，置于37°C、飽和濕度、5% C02培養箱中消化20-30 min，消化后棄掉消化液，使用40 μ m細胞濾器過濾細胞，收集單細胞。加I ml皮膚干細胞培養液重懸細胞，將細胞再次過150目細胞篩。將細胞接種到10mm懸浮培養版上，在5% 二氧化碳培養箱中培養。
[0014]小鼠皮膚干細胞培養液:DMEM/F12 +2% B-27 +20 ng/ml EGF +40 ng/ml bFGF+1%青鏈霉素。
[0015]第二步:小鼠皮膚干細胞體外形成擬胚體當細胞培養到第二代又3-4天時，將細胞收集到15 ml離心管中，離心，棄上清液，加入EB分化培養液，吹打成單細胞，細胞計數，分散到24孔板中培養，每兩天換半液，用槍將其吹散。
[0016]擬胚體培養液:Mediuml99+3 mg/mlBSA +1 mg/mlFetuin +5 μ 1/ml ITS + 0.23mM 丙酮酸鈉 +Ing/mlFGF。
[0017]第三步:小鼠成纖維細胞的培養與飼養層細胞的制備
取出子宮中的胎鼠，只保留軀干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化5 min。消化后用移液槍吹打，離心，加培養液重懸細胞，過400目細胞篩，把細胞接種到成纖維細胞培養液中培養，貼壁培養，作PO代。傳代時收集細胞懸液，離心，接入成纖維細胞培養液中培養。
[0018]成纖維細胞培養液:DMEM高糖+10% FBS +1%丙酮酸鈉+1%非必需氨基酸+1%
青鏈霉素。
[0019]選P2-P4代生長在對數期的小鼠成纖維細胞，加入含有絲