20°C放置2小時；4°C 15,000g 離心15min，沉淀懸浮于80%的冷丙酮中，-20°C放置1小時，離心去丙酮，將沉淀干燥成 粉。按每mg干粉加入10yL裂解液（7M脲，2M硫脲，4% CHAPS，1% CA，0. 3%蛋白酶抑制 劑，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C攪拌抽提15min后加入14mM的DTT ;4°C再攪 樣20min，然后35, 000g尚心lOmin，上清即為蛋白抽提液。將蛋白提取液進行等電聚焦后， 進行SDS-PAGE電泳。電泳緩沖液用Tris-Glycine-SDS緩沖液，溫度設為17°C;先用2. 5W/ 膠預電泳30min后，再用5W/膠電泳至溴酚藍到玻璃板下緣為止。電泳結束后，取下凝膠進 行銀染。分析在侵染后各時間點的豐度與對照相比均超過4倍的蛋白點，取一個分子量為 40. 27千道爾頓，等電點為6. 51的蛋白點即為TaMAG1166蛋白。該序列編碼447個氨基酸， 如 SEQ ID NO:2 所示.
[0027] 實施例2:編碼TaMAG1166蛋白的cDNA序列的獲得。
[0028] 用英俊公司的Trizol試劑盒提取抗病小麥種質望水白穗部的總RNA，采用 Promega公司的反轉錄試劑盒進行反轉錄，合成單鏈cDNA。以cDNA作為模板，P1-F : 5'-GAGGAACTATGCTTCAACCCGC-3' （SEQIDN0.3)和 卟R:5'-TTCGCCCATCCAAAGTCTGG-3' (SEQ ID NO. 4)為引物，進行PCR擴增，擴增體系為25 yL，包括5ng模板，P1引物各 5pmol, dATP, dITP，dCTP 和 dGTP 各 5nmol, 37. 3nmol MgCl2, 0? 5 單位的 DNA 聚合酶，lx PCR 緩沖液。擴增的程序是：94°C變性3分鐘；30個循環，94°C變性20秒，58 °C退火30秒，72 °C 延伸1分鐘；最后72°C延伸5分鐘。通過PCR擴增，獲得了包含開放讀碼框的1341bp的 核苷酸序列，將該核苷酸與T-載體在16°C連接30min，連接體系為10yL，包括T-載體 lyL，PCR產物4yL，連接酶lyL，連接酶緩沖液lyL，ddH20 3 yL。連接產物通過42°C熱 擊40秒，轉化到大腸桿菌細胞中，送至華大基因公司測序，所得序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0029] 實施例3:轉TaMAGl 166基因小麥的赤霉病抗性得到提高
[0030] 以望水白開花期的穗部cDNA作為模板，利用引物P2進行PCR擴增，P2引物對如 T:P2-F :5'-AGTCTCTAGATTATTTGCCGACATGTCCTTGG-3'（SEQIDN0.5);P2-R:5'-ATATTCTA GACCCAAACATCAATCTCCTTCTCG-3'（SEQ ID NO. 6)。將擴增得到的PCR產物用限制性內切酶 Xbal進行酶切后，與經過同樣限制性內切酶進行酶切的PBI121表達載體進行連接，獲得 由CaMV35S啟動子啟動的TaMAG1166超量表達的質粒載體。構建好的載體通過熱擊法轉化 到DH5 a大腸桿菌菌株中，通過含有50 yg/mL的卡那霉素的LB培養基進行篩選，獲得陽 性克隆。參照1993年Weeks發表在Plant Physiol第102期1077 - 1084頁上的文章中 的材料與方法，以幼胚短暫培養產生的可以較高頻率再生出可育植株的愈傷組織為受體， 采用基因槍法將Ubiqutin啟動子控制下的TaMAG1166基因導入小麥材料揚麥158中，將 基因槍轉化后的愈傷放置于含有30mg/L G418的1/2MS培養基上進行篩選，剪取獲得的再 生苗葉片，提取DNA進行PCR檢測，獲得TaMAG1166超量表達的轉基因小麥（圖1)。鑒 定T3代轉基因小麥和非轉基因小麥赤霉病抗性。結果表明，以未進行轉化的小麥材料揚麥 158為對照，轉基因植株赤霉病抗性得到提高（表1)。離體鑒定：利用返青至拔節期的T3 代轉基因小麥葉片和非轉基因葉片接種F. grminearum，接種方法和抗病能力評價方法參照 (Chen et al. 2009)。在接種點接種6 y 1濃度為每毫升1 X 106個赤霉菌分生孢子的菌液， 所用的孢子液為F15, F609, F7136及F. grminearum tri5_GFP菌株的分生孢子混合物。接 種5天后觀察赤霉菌菌絲的侵染情況。結果表明，轉基因植株對赤霉菌的抗性增強，葉片上 赤霉菌菌絲生長變慢（圖2)。
[0031]表 1
【主權項】
1. 一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166,其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
2. 權利要求1所述一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166的編碼基因。
3. 根據權利要求2所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
4. 含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體。
5. 根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于出發載體為任何一種可以引導外 源基因在植物中超量表達的載體。
6. 根據權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述的重組表達載體為將權利要 求2或3所述的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAGl 166編碼基因插入PBI121表 達載體Xbal酶切位點所得。
7. 含有權利要求2或3所述基因的微生物細胞。
8. 權利要求2所述的基因在提高小麥抗赤霉病中的應用。
9. 權利要求4~6中任一項所述的重組表達載體在提高小麥抗赤霉病中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166及其編碼基因和應用。一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。編碼該小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋TaMAG1166的基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通過基因工程的方法將本發明提供的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166編碼基因轉入小麥中,可以提高小麥的赤霉病抗性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內源基因,因此,該基因的超量表達不會影響植物的食品安全性,可在作物育種中應用。
【IPC分類】C12N15-82, C07K14-415, C12N1-21, C12N15-29, A01H5-00
【公開號】CN104628838
【申請號】CN201510056181
【發明人】馬正強, 賈海燕, 劉世蓉, 徐文綺
【申請人】南京農業大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月3日