一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白 TaMAG1166及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌（FusariumgraminearumSchwabe)引起的一種世界范 圍內的病害。該病害導致小麥產量大幅度降低并嚴重影響小麥的品質。雖然可以通過生物 防治和化學防治的方法來控制該病害，但利用生物技術來培育抗赤霉病品種才是最經濟有 效的方法。
[0003] 水解羥基肉桂酰輔酶A醋類蛋白（Hydroxycinnamoyl CoA quinatetransferase, HQT)，能夠控制主要酷類復合物如木質素及綠原酸等的生物合成和 流轉（Hoffmann et al. (2003)。綠原酸是在植物苯丙烷類代謝過程中，咖啡酸和奎尼酸脂 化而產生的酚類化合物，其大量積聚能夠提高酚化物的水平，在植物中扮演抗氧化劑的角 色。綠原酸對病原真菌，病毒都有毒性，可以抑制多種病原菌的繁殖。木質素是苯丙氨酸衍 生的芳香族亞基聚合體，木質素的大量合成可以引起細胞木質化程度的提高，阻止大分子 物質的入侵，因此，在植物中，木質素的存在可以作為微生物侵襲的阻障，增強植物細胞壁 抗真菌穿透的能力。本發明的TaMAG1166蛋白是來源于小麥的水解羥基肉桂酰輔酶A酯類 蛋白，在本發明提出之前，關于水解羥基肉桂酰輔酶A酯類相關蛋白及其編碼基因在小麥 抗赤霉病方面的應用目前尚未有報道。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A 酯類蛋白TaMAG1166。
[0005] 本發明的另一目的是提供該小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166的編 碼基因。
[0006] 本發明的又一目的是提供編碼基因的應用。
[0007] 本發明的目的可以通過以下技術方案實現：
[0008] 一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166,氨基酸序列如SEQ ID N0:2 所示。該蛋白包含443個氨基酸，等電點為6. 51。
[0009] 所述的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166編碼基因。
[0010] 所述的權利要求1所述的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAGl 166編碼基 因，優選核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 含有小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166編碼基因的重組表達載體。
[0012] 所述的重組表達載體，優選出發載體為任何一種可以引導外源基因在植物中超 量表達的載體。
[0013] 所述的重組表達載體，進一步優選將所述的含小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋 白TaMAG1166編碼基因插入PBI121表達載體Xbal酶切位點所得。
[0014] 含有本發明所述基因的微生物細胞。
[0015]本發明所述的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166在品種改良中的應 用；優選所述的基因在提高小麥抗赤霉病中的應用。
[0016]本發明所述的重組表達載體在品種改良中的應用；優選在提高小麥抗赤霉病中的 應用。
[0017] 利用任何一種可以引導外源基因在植物中超量表達的載體，將本發明所提供的小 麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白基因TaMAGl 166導入植物細胞，可獲得改變植物赤霉病 抗性的轉基因細胞系及轉基因植株。為了便于對轉基因植物或轉基因植物細胞進行篩選， 可以對載體進行加工，如加入抗生素標記基因（如：潮霉素、卡那霉素和慶大霉素），加入抗 生素標記基因之后的載體用于轉化，可以在轉化后的植物培養基中加入抗生素，抑制非轉 基因細胞系和植株的生長，有助于快速和有效的獲得轉基因植株。為了便于觀察外源基因 的表達，可以在載體中啟動子和外源基因之間加入報告基因（⑶S基因、GFP和熒火蟲熒光 素酶報告基因），構建報告基因和外源基因融合表達的載體，該載體用于遺傳轉化，可以通 過觀察報告基因的表達與否和表達量高低，推測外源基因在植物體內表達情況。為了轉基 因植物釋放的安全性，也可以構建載體時不攜帶任何篩選標記基因，而在苗期進行PCR檢 測。含有本發明的TaMAG1166表達載體可通過使用基因槍法、農桿菌介導法、花粉管通道， 電擊，顯微注射，Ti質粒，Ri質粒或植物病毒等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并 將轉化后的植物細胞培育成完整的植株。被轉化的植株材料既可以是雙子葉植物，也可以 是單子葉植物，如：水稻、棉花、小麥、大豆、煙草、擬南芥、大麥、高粱、玉米、黃瓜、番茄、楊 樹、草坪草、苜蓿等。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發明提供了一種新的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白TaMAG1166及其 編碼基因。通過基因工程的方法將本發明提供的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白 TaMAG1166編碼基因轉入小麥中，可以提高小麥的赤霉病抗性。由于該基因是糧食作物小 麥本身存在的內源基因，因此，該基因的超量表達不會影響植物的食品安全性，可在作物 育種中應用。
【附圖說明】
[0020] 圖1轉基因小麥的PCR檢測。
[0021] 其中B、C為不同的轉基因株系，揚麥158表示進行轉基因實驗時的受體材料，為 進行小麥遺傳轉化的常用基因型，陽性對照為攜帶有小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類蛋白 TaMAGl 166編碼基因的表達載體。
[0022] 圖2轉基因小麥的赤霉病抗性的離體葉片鑒定
[0023] 其中A為轉基因實驗受體材料揚麥158的葉片，B為攜帶有小麥水解羥基肉桂酰 輔酶A酯類蛋白TaMAGl 166基因植株的葉片。
【具體實施方式】
[0024] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解， 實施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0025] 實施例1 :TaMAG1166蛋白的獲得。
[0026] 在抗赤霉病材料望水白開花期，將赤霉菌孢子液用噴霧器噴灑到穗部，所用孢子 液為江蘇省范圍內強致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子混合液，接種后立 即將穗子套上塑料袋，保持濕度，以保證赤霉菌發病。在接種后6小時、12小時和24小時 后分別取麥穗，同時用水接種做為對照，取材后立即用液氮冷凍。取700mg凍存的麥穗，加 入70 11^的？￥?于液氮中磨成粉末，加入51^10%三氯醋酸/丙酮振蕩混勻、-201：沉淀1小 時；4°C 15,000g離心15min，沉淀重新懸浮于5mL冷丙酮中，-