一種重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的純化及高效復性液對其復性的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是生物醫藥及生物工程下游蛋白純化領域，更具體的涉及了一種重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的純化及高效復性液對其復性的工藝。
【背景技術】
[0002]革蘭氏陰性細菌外膜蛋白對細菌抵抗有害物質或環境起著重要作用，它能夠保護細胞免受或減少多種有害物質的影響，如蛋白酶、抗生素、毒素和噬菌體等，并且對維持革蘭氏陰性細菌在高滲透壓、酸性等脅迫條件下的生存起著重要作用。此外，外膜蛋白形成的非特異性的離子通道對革蘭氏陰性細菌吸收營養物質和排泄自身代謝廢物也起著關鍵作用。外膜蛋白也被稱為膜孔蛋白，是外膜的主要組成成分，大腸桿菌重要的外膜蛋白有OmpC、OmpF和PhoE等，它們橫跨脂質雙分子層。在宿主體內，外膜蛋白的種類與濃度的變化均能令巨噬細胞的形態及功能發生改變；在體外，外膜蛋白具有與補體系統之間相互作用的能力。它既可作為佐劑，又可作為免疫刺激原得到應用，因而可應用于高效價抗體和疫苗的研發。雞大腸桿菌外膜蛋白分子量為35?45KD的蛋白質，具有蛋白質通性，對熱穩定，2-8°C可保存較長時間，20°C可長期保存其活性，易被核酸酶中和，可被蛋白酶滅活。基因工程重組雞大腸桿菌外面膜蛋白C是無毒、無害、無殘留的生物制品，對抑制病毒的復制和提高機體免疫力方面有一定的功效，因此，有望將其應用在禽類養殖業上，以期解決目前我國養殖業中存在的部分問題，為我國禽類健康保駕護航，為食品安全提供綠色保障。
[0003]大腸桿菌是目前最為被廣泛用來表達外源蛋白的表達系統，然而大腸桿菌大量表達重組蛋白質常常導致其聚集體并形成蛋白沉淀一包涵體。包涵體蛋白沒有生物活性，需要復雜的溶解，復性，純化來的得到有功能的產品。
[0004]目前蛋白質復性通常有兩種方法。一是稀釋法，稀釋溶有蛋白的變性液，溶液中變性劑濃度足夠低時，蛋白開始復性；而是透析法，用透析、超濾等手段除去變性劑。稀釋法操作液體量太大，同時蛋白質濃度太小，為后續的提純蛋白增加困難，增加生產成本。透析法對設備要求較高，增加了設備的投入，同時操作時間較長，可能導致蛋白質沉淀。目前，包涵體的復性的回收率大概為15 — 25 %，大部分寶貴的目的蛋白因為不能復性而不能利用。復性率較低的原因是，在重組蛋白的復性過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子，或環境不適而無法形成正確的次級鍵等。
[0005]因此，如果能找到一種既能提高蛋白復性率，而且能有效降低復性成本的方法成為基因重組蛋白藥物生產的一個關鍵性難題。

【發明內容】

[0006]為了克服現有的外膜蛋白包涵體在生產中包涵體復性方法需要復雜的操作步驟，周期長，而且回收率低的缺點，提供一種重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的純化及高效復性液對其復性的方法。
[0007]本發明一種重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的純化及高效復性液對其復性的方法，包括以下步驟:
[0008](I)包涵體蛋白的提取:4°C，4000?6000rpm，10?20min，離心收集菌體，PBS洗滌菌體，4°C，6000?8000rpm，10?20min，將菌體超聲破碎，功率400瓦，超聲5秒，間歇25秒，工作時間20?35分鐘，所述菌體為重組雞大腸桿菌；然后4°C，8000?lOOOOrpm，10?20min高速冷凍離心得到雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體蛋白質；
[0009](2)包涵體蛋白質的純化:首先按質量體積比1:10?1:30將包涵體重懸于第一洗滌液中，所述洗滌液為:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO41OmmoI/L,KH2P042mmol/L，0.2%?1.4%的 tritonX-100，pH 8.0 ?8.5 ；4°C,8000 ?lOOOOrpm，10 ?20min高速冷凍離心；然后按質量體積比1:10?1:30將包涵體重懸于第二洗滌液種，所述第二洗滌液為:1?3mol/L尿素；4°C，8000?lOOOOrpm，10?20min高速冷凍離心；接著按質量體積比1:20?1:50將包涵體重懸于第三洗滌液中，所述第三洗滌液為:0.6?2mol/L NaCl,4°C,8000?lOOOOrpm，10?20min高速冷凍離心；最后按質量體積比1:30?1:50將包涵體重懸于0.5?2%十二烷基硫酸鈉(Sodium lauryl sulfate，簡稱SLS)，4°C，8000?lOOOOrpm，20?30min高速冷凍離心，收集沉淀；
[0010](3)包涵體蛋白質的溶解與復性，按質量體積比為1:10?I:40將步驟⑵得到的沉淀用變性劑重懸，所述變性劑為:5?7mol/L鹽酸胍，I?2mmol/L EDTA，20?50mmol/L Tris-Base，6 ?10mmol/L DTT (即 DL-Dith1threitol，中文名:二硫蘇糖醇)，pH 8.0 ?8.5 ;室溫放置至沉淀逐漸溶解；4°C，8000?lOOOOrpm，10?20min高速冷凍離心，收集上清液；4°C條件下，使變性液逐滴加入復性緩沖液中，所述復性緩沖液為:0.2?0.8mol/L精氛酸，0.5 ?2mmo1 /T, EDTA, 0.3 ?0.9mmol/L氧化型谷脫甘狀，60 ?100mmol/L Tris-Base,15?30%甘油，pH 8.0?8.5，同時攪拌24?48h。
[0011]所述步驟(3)中變性液加入復性緩沖液中方式為滴加，變性液與復性緩沖液的體積比為1:20?I:50o
[0012]本發明具有如下有益效果:
[0013]本發明能夠顯著提高復性率，并且設備要求簡單。本方法適當改變包涵體洗滌液的比例、組分和洗滌方法來純化包涵體；通過適當改變復性緩沖液的復性劑、離子強度和復性方法等，提高了重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的復性率，簡化了復性的步驟，節約了時間，從而大大降低了重組蛋白的生產的費用。對大規模工業生產具有指導意義。
[0014]該重組雞大腸桿菌外膜蛋白純化方法簡便易行，無需進行過柱處理。本發明的包涵體蛋白的三步洗滌純化工藝方法，使菌體蛋白與包涵體得到很好的分離，再通過復性溶液及點滴加樣一次復性的工藝方法，使蛋白質的復性率大大提高，同時簡化復性工藝及所需設備，從而大大提高目的蛋白的收獲率，降低重組雞大腸桿菌外膜蛋白的生產成本。
【具體實施方式】
[0015]為了實現上述目的，設計一種重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的純化及高