專利名稱：3,4－二羥基肉桂酸鈉在制備抗腫瘤藥物中的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及將3,4-二羥基肉桂酸改造成其鈉鹽后作為治療腫瘤藥物的新用途。
惡性腫瘤嚴重威脅人類健康和生命。目前臨床應用的化療藥物毒性較大，對實體瘤效果較差，接受化療的病人絕大多數最終都死于腫瘤細胞轉移。因此，尋找低毒性而能抑制腫瘤生長和轉移的藥物是腫瘤化療研究的重要任務。本發明涉及的已知結構化合物3,4-二羥基肉桂酸(又名咖啡酸)廣泛分布于多種蔬菜、水果和植物中。文獻報道3,4-二羥基肉桂酸是一種具有選擇性的耐藥腫瘤細胞MCF-7/Dox的化學增敏劑[Anticancer Res,1997,17:1913-1917]，對腫瘤細胞的侵襲具有抑制作用[Biol Pharm Bull,1997,20:345-348]。但是3,4-二羥基肉桂酸溶解性差，而其鈉鹽顯示出良好的水溶性。迄今未見關于3,4-二羥基肉桂酸鈉在動物體內試驗的抗腫瘤作用的報道。
本發明涉及的化合物3,4-二羥基肉桂酸鈉，其動物實驗毒性很小，具有抑制腫瘤細胞分泌明膠酶的作用，抑制腫瘤的生長和轉移，能協同增強化療藥物的抗腫瘤作用。
本發明目的是將3,4-二羥基肉桂酸改造成其鈉鹽，以期取得較好的效果。
本
發明內容
和要點是1)制備3,4-二羥基肉桂酸鈉將18克3,4-二羥基肉桂酸溶于200ml水中，緩緩加入碳酸鈉水溶液(5.3g/20ml)，再用20ml水洗滌后一起并入，室溫攪拌2小時，過濾，冷干，得到3,4-二羥基肉桂酸鈉制品，其結構如下式所示 式中R=H時為3,4-二羥基肉桂酸R=Na時為水溶性好的3,4-二羥基肉桂酸鈉鹽2)利用藍四唑法，檢測3,4-二羥基肉桂酸鈉對體外培養的人腫瘤細胞增殖的抑制作用。將細胞與藥物共同培養72小時，加入藍四唑試劑，反應4小時，除去培養基，加入二甲基亞砜，然后在540nm處測定吸光度以判斷藥物活性。結果表明，3,4-二羥基肉桂酸鈉對人腫瘤細胞的半數抑制濃度(IC50)為150-250μg/ml(表1)。
表1 3,4-二羥基肉桂酸鈉對人腫瘤細胞的增殖抑制作用
3)3,4-二羥基肉桂酸鈉對腫瘤細胞分泌明膠酶的抑制作用。取對數生長期的HT-1080細胞，培養24h后棄去培養上清，換無血清RPMI-1640培養基，同時加3,4-二羥基肉桂酸鈉及對照溶媒，繼續培養24h后收集無血清培養上清，與加樣緩沖液混勻上樣，進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后，以蒸餾水漂洗凝膠數次后，移入2.5％Triton-100溶液中，低速搖動以洗脫SDS，用蒸餾水漂洗后，加入明膠酶緩沖液在37℃恒溫搖床中溫育，再次用蒸餾水漂洗，放入0.1％考馬斯亮藍染色液染色，后在脫色液中脫色，至對照出現明顯清晰的負染條帶。根據負染條帶的寬度和亮度反映明膠酶的活性，對負染條帶掃描以對藥物作用進行半定量分析，結果表明3,4-二羥基肉桂酸鈉能抑制HT-1080分泌72kDa和92kDa兩種明膠酶。
表3 3,4-二羥基肉桂酸鈉對HT-1080細胞分泌明膠酶的抑制作用(抑制率％)
4)3,4-二羥基肉桂酸鈉對小鼠移植性腫瘤生長的抑制作用。在小鼠皮下接種小鼠肝癌22，結腸癌26，腹腔給藥，按腫瘤重量計算，3,4-二羥基肉桂酸鈉對兩種移植瘤模型均能有效抑制腫瘤生長(表3、4)。
表3 3,4-二羥基肉桂酸鈉對小鼠肝癌22生長的抑制作用
P＜0.01，與對照組相比，n=10,ip×10，各組均無動物死亡。
表4 3,4-二羥基肉桂酸鈉對小鼠結腸癌26生長的抑制作用
*P＜0.01，與對照組相比，n=10,ip×10，各組均無動物死亡。
5)3,4-二羥基肉桂酸鈉對腫瘤轉移灶形成的抑制作用。在小鼠Lewis肺癌自發性轉移模型上腹腔注射3,4-二羥基肉桂酸鈉，結果表明可抑制肺轉移灶的形成(表5)。
表5 3,4-二羥基肉桂酸鈉對小鼠Lewis肺癌生長的抑制作用
*P＜0.05，與對照組相比，n=10,ip×14，各組均無動物死亡。
6)3,4-二羥基肉桂酸鈉與絲裂霉素C顯示協同的抗腫瘤作用。在小鼠皮下接種小鼠肝癌22，腹腔給藥，合并用藥組給藥間隔1h。連續給藥10天。按腫瘤重量計算，3,4-二羥基肉桂酸鈉與絲裂霉素C有顯著的協同作用(表6)。
表6 3,4-二羥基肉桂酸鈉(CA)與絲裂霉素C(MMC)抗腫瘤的協同作用
*P＜0.05，與對照組相比，n=10,ip×10，各組均無動物死亡。
▲與0.5mg/kgMMC組相比，抑瘤率p＜0.01。
本發明的優點和積極效果是開拓了3,4-二羥基肉桂酸鈉作為抗腫瘤藥物的新用途，該化合物毒性低，它能抑制腫瘤細胞分泌明膠酶，能抑制腫瘤的生長和轉移，與化療藥物有協同抗腫瘤作用，有望成為一個有特點的具有開發前景的抗腫瘤化合物。
權利要求
1.3,4-二羥基肉桂酸鈉在制備抗腫瘤藥物中的新用途，其特征是所說的藥物是將3,4-二羥基肉桂酸結構中羧基上的H由Na取代，形成水溶性好的鈉鹽后，可對腫瘤細胞生長及轉移的形成產生抑制作用。
2.如權利要求1所述的3,4-二羥基肉桂酸鈉在制備抗腫瘤藥物中的新用途，其特征是體外實驗采用藍四唑法在540nm處測定吸光度以判斷所述藥物對腫瘤細胞的生理活性。
3.如權利要求1所述的3,4-二羥基肉桂酸鈉在制備抗腫瘤藥物中的新用途，其特征是體外實驗通過酶譜分析方法，將藥物與腫瘤細胞共同培養后，收集無血清培養上清，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、加入明膠酶緩沖液孵育、以考馬斯亮藍染色液染色再脫色及對負染酶帶的掃描分析，判斷所述藥物對腫瘤細胞分泌明膠酶的抑制作用。
4.如權利要求1所述的3,4-二羥基肉桂酸鈉在制備抗腫瘤藥物中的新用途，其特征是動物體內實驗經小鼠皮下接種相關腫瘤細胞和腹腔給藥，可觀察到所述藥物對腫瘤生長及轉移灶形成的抑制作用。
5.如權利要求1所述的3,4-二羥基肉桂酸鈉在制備抗腫瘤藥物中的新用途，其特征是動物體內實驗經小鼠皮下接種相關腫瘤細胞和腹腔給藥，可觀察到所述藥物與化療藥物絲裂霉素C的協同抗腫瘤作用。
全文摘要
本發明涉及結構為3,4－二羥基肉桂酸鈉(咖啡酸鈉)的抗腫瘤藥理新作用,該化合物對惡性腫瘤細胞增殖具有抑制作用,它能抑制腫瘤細胞分泌明膠酶,動物實驗表明它能抑制小鼠移植性肝癌,結腸癌和肺癌的生長,它能降低惡性腫瘤肺轉移發生率和轉移灶的數目,該化合物毒性低,能抑制腫瘤的生長和轉移,顯示了與化療藥物絲裂霉素C的協同抗腫瘤作用,有望成為一個有特點的具有開發前景的抗腫瘤化合物。
文檔編號A61K31/185GK1320424SQ01109638
公開日2001年11月7日 申請日期2001年3月14日 優先權日2001年3月14日
發明者徐峰, 甄永蘇, 宋丹青, 張勝華 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所