一種結核感染細胞免疫檢測抗原組合物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種結核感染特異T細胞免疫檢測抗原及其應用。具體地說就是一種 結核分枝桿菌抗原及其表位肽組合物，用于結核感染細胞免疫檢測，屬于結核病檢測領域。
【背景技術】
[0002] 結核病是由結核分枝桿菌感染引起的人畜共患的慢性傳染病。根據世界衛生組織 的統計，目前全球有超過1/3的人口感染了結核分枝桿菌，每年有200萬人因結核病死亡。 我國是全球22個結核病流行嚴重的國家之一、同時也是全球27個耐多藥結核病流行嚴重 的國家之一。我國第五次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，中國結核病年新發病人數約 為130萬，占全球發病人數的14. 3%，位居全球第二位；15歲及以上人群肺結核的患病率為 459/10萬。結核分枝桿菌除感染人外，還感染50多種哺乳動物和20多種禽類；易感性因 動物種類和個體不同而異，家畜中牛是最敏感動物。結核病的流行不僅影響養殖業的發展， 更重要的是由于交叉感染，而使人類的健康受到嚴重威脅。因此，結核病已經成為一個嚴重 的社會經濟問題，對我國公民健康、社會安定和經濟發展帶來嚴重的危害。
[0003] 結核病的早期診斷對結核病的控制至關重要，而結核病防治的最大挑戰之一就是 缺乏早期、快速、敏感和特異的診斷工具。目前所采用的結核感染的診斷方法仍然存在著較 大的局限性。經典的結核菌素試驗（TST)用于結核病診斷雖然已達一個世紀，但其受卡介 苗接種和大多數非結核分枝桿菌感染的干擾，特異性和敏感性均不理想；細菌學培養作為 診斷的金標準用于結核病也存在著培養周期過長、陽性率較低、且依賴于標本采集質量等 問題；而影像學、血清學等方法，因為較高的假陰性或假陽性，用于結核病診斷的參考價值 受限。現有結核病檢測試劑靈敏度、特異度均有待提高。
[0004] 抗結核病的保護性免疫機制目前仍不完全清楚，細胞免疫尤其是循環及感染部 位的T淋巴細胞應答被認為起著重要作用。因此能否有效地激發機體的T細胞，尤其是 CD4+T細胞免疫反應是機體成功對抗結核感染的關鍵。被病原菌致敏的T淋巴細胞，再次 受到同種抗原刺激后會釋放y干擾素，高水平的y干擾素反應可以提示該病原菌的感 染。近年來，隨著免疫學和基因組學的發展，出現了以T細胞為基礎的體外 Y干擾素反 應測定法（IGRA)，可用于結核病輔助診斷和結核感染篩查。目前已經有以結核分枝桿菌 基因組RD1區編碼的結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10為刺激物的商品化IGRA試劑，如 QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT. TBtest，用于檢測外周血中結核特異性釋放y干擾 素的T淋巴細胞，呈現較高的靈敏性和特異性。
[0005] 抗原表位是多肽抗原的一部分，是抗原性的核心基礎；抗原通過抗原表位與相應 的淋巴細胞表面受體結合從而致敏淋巴細胞、引起免疫應答，即免疫反應的特異性是針對 抗原表位，而不是針對整個抗原，抗原表位在抗原誘導免疫應答的過程中起著決定性作用。
[0006] 基于T細胞分泌Y干擾素的體外檢測技術，主要以完整抗原作為相應的刺激源， 抗原成分組成較為復雜、靈敏度和特異性有待提高，且相應試劑由于國外公司的專利保護， 使得我國在引進相關產品應用時成本較高，不適合目前情況下在我國大范圍應用。本發明 是在國家傳染病重大專項資助下，對結核菌蛋白抗原及其表位充分分析、驗證和比較研宄 的基礎上產生，擁有完全的自主知識產權，基于本發明的檢測試劑可廣泛用于結核病的輔 助診斷、流行病學監測與感染篩查等相關領域。

【發明內容】

[0007] 本發明在現有的T細胞y干擾素釋放試驗技術的基礎上，應用RD1區基因 Rv3873、Rv3874、Rv3875所編碼的Rv3873抗原、CFP-10抗原、ESAT-6抗原和/或其各自所 包含的抗原表位肽，形成一個抗原組合物，并結合ELISA方法對結核病例和健康志愿者體 內結核特異性T細胞進行檢測，從而評價該抗原組合物用于結核檢測的靈敏度和特異性。
[0008] RV3873基因作為分枝桿菌核心基因組中的基因在分枝桿菌屬中高度保守，其表 達產物具有較高的T細胞免疫原性；Rv3874、Rv3875基因的表達產物CFP-10和ESAT-6屬 于ESAT-6蛋白家族，均具有較強的免疫原性，是重要的結核分枝桿菌免疫保護性抗原；且 Rv3873、CFP-10、ESAT-6抗原均存在于大多數分枝桿菌尤其是致病性結核分枝桿菌中，而卡 介苗（BCG)及絕大多數環境分枝桿菌均缺失此類抗原。本發明在現有檢測試劑常用抗原 ESAT-6和CFP-10的基礎上，發現Rv3873抗原亦可用于結核感染特異性檢測，且使用相應的 抗原表位肽替代完整的多肽抗原作為檢測標志物，提供了一種包括3種抗原衍生的表位肽 庫組合物，并與這3種抗原分別組成的單抗原衍生表位肽庫或至少2種抗原組成的衍生表 位肽庫在結核病例及健康志愿者中的反應情況進行比較。
[0009] 本發明的第一方面提供了一種用于結核感染細胞免疫檢測抗原組合物，由以下至 少1組抗原，優選至少2組抗原，最優選全部3組抗原組成：
[0010] (1)結核分枝桿菌CFP-10抗原和/或其包含的一種或多種抗原表位肽；
[0011] (2)結核分枝桿菌ESAT-6抗原和/或其包含的一種或多種抗原表位肽；
[0012] (3)結核分枝桿菌RV3873抗原和/或其包含的一種或多種抗原表位肽。
[0013] 所述結核分枝桿菌CFP-10抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 所述結核分枝桿菌ESAT-6抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0015] 所述結核分枝桿菌Rv3873抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。
[0016] 所述結核分枝桿菌CFP-10抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO:4 ~59。
[0017] 所述結核分枝桿菌ESAT-6抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列選自SEQID N0:60 ~122〇
[0018] 所述結核分枝桿菌Rv3873抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 123 ~180。
[0019] 在一個特定的實施方案中，上述抗原組合物由以下至少1組抗原，優選至少2組抗 原，最優選全部3組抗原組成：
[0020] (1)結核分枝桿菌CFP-10抗原和其包含的全部抗原表位肽；
[0021] (2)結核分枝桿菌ESAT-6抗原和其包含的全部抗原表位肽；
[0022] (3)結核分枝桿菌Rv3873抗原和其包含的全部抗原表位肽。
[0023] 在另一個特定的實施方案中，上述抗原組合物由以下至少1組抗原，優選至少2組 抗原，最優選全部3組抗原組成：
[0024] (1)結核分枝桿菌CFP-10抗原包含的全部抗原表位肽；
[0025] (2)結核分枝桿菌ESAT-6抗原包含的全部抗原表位肽；
[0026] (3)結核分枝桿菌Rv3873抗原包含的全部抗原表位肽。
[0027] 抗原組合物中的表位肽可以是上述表位肽的氨基酸序列經過取代、缺失或添加1 個氨基酸或幾個氨基酸且具有相同抗原性的衍生表位肽或其類似物。
[0028] 在最優選的實施方案中，所述抗原組合物由氨基酸序列為SEQ ID NO. 4~180的 表位肽組成。
[0029] 本發明還提供了編碼所述抗原組合物的DNA分子，以及含有該DNA分子的重組表 達載體、表達盒、轉基因細胞系和重組菌。
[0030] 本發明的第二方面提供了所述抗原組合物在制備用于體外檢測結核感染引起的 特異性T細胞免疫反應的檢測試劑中的應用，其特征在于人或動物的淋巴細胞經過所述抗 原組合物的刺激后，檢測結核特異性T細胞分泌的細胞因子。
[0031] 在特定的實施方案中，所述結核特異性T細胞分泌的細胞因子選自y干擾素 (IFN-Y)、白細胞介素2(IL_2)和腫瘤壞死因子a (TNF-a)，優選IFN-Y;所述結核特異 性T細胞分泌的細胞因子的檢測方法選自酶聯免疫斑點試驗（ELISP0T)、酶聯免疫吸附試 驗（ELISA)、免疫層析試驗、細胞因子內染色和T細胞增殖試驗，優選ELISA;所述淋巴細胞 來源于外周血、腦脊液、胸水或腹水，優選外周血。
[0032] 本發明還提供了所述抗原組合物在制備結核檢測試劑中的應用，并提供了一種結 核檢測試劑盒，其基本組成如下：
[0033] 本