抗菌肽wy-21及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學技術領域，特別是涉及抗菌肽WY-21及其應用。
【背景技術】
[0002] 抗生素濫用造成耐藥性細菌的產生，也會造成抗生素在畜產品中殘留，帶來食品 安全問題。由于耐藥性問題的嚴重化，越來越多的抗生素對病原菌喪失了殺傷作用。同時 長期使用抗生素會破壞影響腸道的穩態，引起腸道菌群紊亂，從而破壞機體的先天免疫。因 此，尋找安全、高效的抗菌藥物成為了研宄熱點。
[0003] 抗菌肽，又叫抗微生物肽（Antimicrobial Peptides，AMP)，是機體先天免疫的重 要組成成分，是許多生物體抵抗外來致病菌侵襲的第一道屏障。抗菌肽具有廣譜抗菌殺菌 活性，且主要通過破壞細菌細胞膜發揮作用，不容易產生耐藥性。同時抗菌肽還具有多樣的 生物學功能：刺激細胞增殖，激活免疫系統，抗病毒，抗肥胖，抗炎癥反應。由于其獨特作用 機制與廣泛生物學功能引起了科學界的關注，將其作為設計新型抗菌、抗感染制劑的分子 模板。所以說抗菌肽是研發新型高效抗生素替代品的重要突破。
[0004] a -螺旋抗菌肽是分布最廣泛的抗菌肽，當形成a螺旋結構時通常親水性殘基和 疏水性殘基分別位于螺旋的兩側，因此呈現結構依賴性的兩親結構。螺旋抗菌肽在水相中 一般不具有明顯的結構特征，但在富含脂類的細胞膜環境下形成典型的a螺旋結構。此類 抗菌肽主要通過破壞細菌細胞膜發揮殺菌作用，導致膜上電解質或其他信號物質的逐級降 解等，細菌不易產生耐藥性。然而，天然的抗菌肽部分存在免疫原性、抗菌活性低，穩定性 差，細胞毒性強，溶血率高等問題限制了其作為抗菌藥物的推廣應用。因此，尋找分子量小、 抗菌活性強、安全性高、穩定性好的抗菌肽是實現抗菌肽部分替代抗生素的關鍵因素。

【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種安全高效的抗菌肽WY-21及其應用。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明提供了一種抗菌肽WY-21，其全序列為：纈氨 酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨 酸-纈氨酸-賴氨酸-谷氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨 酸-賴氨酸-精氨酸。為序列表N01所示。
[0007] 作為本發明的抗菌肽WY-21的改進：所述的抗菌肽WY-21為人工設計合成的a螺 旋陽離子多肽，包含21個氨基酸殘基，分子量為2624. 2Da，等電點為10. 79,凈電荷為+8。
[0008] 本發明還同時公開了上述抗菌肽WY-21的用途：制備治療革蘭氏陰性菌或者革蘭 氏陽性菌感染的廣譜抗菌藥物。
[0009] 本發明還同時公開了上述抗菌肽WY-21的用途：制備發揮免疫調控作用從而降低 炎癥的藥物。
[0010] 備注說明：革蘭氏陰性菌包括 E. coli ATCC25922、E. coli K 88、E. coli K 12、 E. coli EPEC 078:K80、E. coli EPEC 0144:K26、E. coli EPEC 044:K74、S. choleraesuis CMCC50020, S.typhimurium CMCC50013, S.enteritidis CMCC5004U P.aeruginosa CMCC27853 ;革蘭氏陽性菌包括 S. aureus ATCC25923、S?印idermidis ATCC12228。
[0011] 本發明的抗菌肽WY-21的使用方法和用量可參照常規抗菌肽（特別是對革蘭氏陰 性菌或者革蘭氏陽性菌感染具有廣譜抗菌性能的抗菌肽）的使用方法和用量，例如可參照 多肽PG-1和CP-1等。
[0012] 本發明所設計合成的抗菌肽WY-21為a螺旋陽離子多肽，具有肽鏈長度較短、穩 定性較好、人工合成方便的特點。將抗菌肽WY-21的氨基酸序列經NCBI蛋白數據庫搜尋比 對，未發現有相同的多肽。抗菌肽WY-21具有凈電荷高、抗菌譜廣、殺菌作用強等優點，同時 具有溶血活性低和細胞毒性小、能發揮免疫調控作用從而降低炎癥等特點。
【附圖說明】
[0013] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0014] 圖1是不同溶度的抗菌肽WY-21對豬紅細胞的溶血率對比圖，以上結果為6次獨 立重復實驗平均值。
[0015] 圖2是不同溶度抗菌肽WY-21對豬PMBCs的細胞毒性對比圖，LDH表示乳酸脫氫 酶，以上結果為6次獨立重復實驗平均值。
[0016] 圖3是對照組、WY-21組、LPS組、LPS+WY-21組對LPS引起的巨噬細胞炎癥的緩解 作用對比圖。
[0017] 圖4是不同溶度的抗菌肽PG-1對豬紅細胞的溶血率對比圖。
[0018] 圖5是CP-1對LPS引發的巨噬細胞炎癥的緩解作用圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面的實施例進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容不僅僅局限于 此。
[0020] 實施例1、抗菌肽WY-21的制備
[0021] 抗菌肽WY-21的制備利用固相化學合成法，根據
【發明內容】
中所述的氨基酸序列， 用自動多肽合成儀從C端到N端逐一進行合成。通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。純化的 抗菌肽WY-21用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，純度高于95%。用基質輔助激光解析 電離飛行時間質譜（MALDI-T0F)測定其分子量，與理論分子量基本一致，用自動氨基酸測 序儀測定氨基酸序列結構。
[0022] 人工合成的抗菌肽WY-21包含21個氨基酸殘基，分子量為2624. 2Da，其全序列為： 纈氨酸_賴氨酸_苯丙氨酸-苯丙氨酸_精氨酸_賴氨酸_亮氨酸_賴氨酸-賴氨酸-絲 氨酸-纈氨酸_賴氨酸_谷氨酸_賴氨酸_異亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸_谷氨酸_苯丙氨 酸-賴氨酸-精氨酸。為序列表N01所示。
[0023] 抗菌肽WY-21的理化參數如表1所示。
[0024] 表1、抗菌肽WY-21的理化參數
[0025]
【主權項】
1. 抗菌肽WY-21，其特征在于：其全序列為：纈氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精 氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸-賴氨酸-谷氨酸-賴氨酸-異 亮氨酸_甘氨酸_賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸。
2. 根據權利要求1所述的抗菌肽WY-21，其特征在于：所述抗菌肽WY-21為人工設計合 成的活性多肽，包含21個氨基酸殘基，分子量為2624. 2Da，等電點為10. 79,凈電荷為+8。
3. 如權利要求1或2所述的抗菌肽WY-21的用途，其特征在于：制備治療革蘭氏陰性 菌或者革蘭氏陽性菌感染的廣譜抗菌藥物。
4. 如權利要求1或2所述的抗菌肽WY-21的用途，其特征在于：制備發揮免疫調控作 用從而降低炎癥的藥物。
【專利摘要】本發明公開了一種抗菌肽WY-21，其全序列為：纈氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸-賴氨酸-谷氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸。該抗菌肽WY-21的用途是：制備治療革蘭氏陰性菌或者革蘭氏陽性菌感染的廣譜抗菌藥物；制備發揮免疫調控作用從而降低炎癥的藥物。
【IPC分類】A61K38-16, A61P31-04, C07K14-00
【公開號】CN104628829
【申請號】CN201510065017
【發明人】汪以真, 易宏波
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月6日