醇溶劑，并濃縮 提取液體。
[0041] 4?微波輔助提取原花青素
[0042] 1)在550W微波條件下進行微波處理，時間為lOmin，微波設置短時間多次破碎 方式，每次微波時間為〇. 5s，間隔時間為0. 5s。期間如反應液溫度超過設定的報警溫度 (45°C)則微波停止。
[0043] 2)離心處理：將經過微波處理過的提取液在3000r/min下離心lOmin。
[0044] 5?真空濃縮
[0045] 1)取離心后的上清液，在35°C下真空濃縮。
[0046] 2)將得到的濃縮上清用0. 45yM的濾膜進行過濾、濃縮。
[0047] 6.制備葡萄原花青素凍干粉
[0048] 1)將得到的濃縮上清用0? 22yM過濾除菌。
[0049]2)除菌后進行凍干處理，凍干溫度為_25°C，真空度為lOOPa，凍干時間為28小時， 即得到葡萄果原花青素成分凍干粉。將凍干粉分裝成lml/支。
[0050] 7.原花青素含量的測定
[0051] 1)測定原理：原花青素和兒茶素類單體的A環化學活性較高，在酸性條件下，其上 的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發生縮合反應，產物在濃酸作用下形成有色的正碳離子， 樣品的濃度與產生的顏色呈正相關，在500nm波長下測定其吸收光度。
[0052] 2)測定方法：香草醛-硫酸法測定
[0053]A?標準曲線的建立：配制0? 025~0? 25ii mol/ml兒茶素標準品甲醇溶液，依次加 入0. 5ml不同濃度標準品溶液、2. 5ml的1%香草醛-甲醇溶液及2. 5ml的30%H2S04-甲 醇溶液，混勻后于30°C水浴避光反應15min后于500nm處測定吸光值。以吸光值A為橫坐 標，原花青素濃度為縱坐標繪制標準曲線。
[0054] B.樣液含量測定：將實施例1制得的原花青素濃縮液稀釋到0. 05~0. 25ii mol/ ml，精密移取0. 5ml待測液，加入2. 5ml香草醛-甲醇溶液和及2. 5ml的30%H2S04-甲醇 溶液，混勻后于30°C水浴避光反應15min。空白對照為無水甲醇。
[0055] C?原花青素含量的計算方式：
[0056]原花青素（％ ) = (CXNXV+M)X100%
[0057] C一稀釋后提取液中原花青素濃度（mg/ml);
[0058]N-提取液稀釋倍數；
[0059] V-提取液體積，ml;
[0060]M-葡萄質量，mg。
[0061] 結果表明：按照本發明的提取方法，并根據上述原花青素含量的計算公式可以得 到葡萄果和葡萄皮中的原花青素提取率，其含量為42. 67%，相對現有的技術方法，其提取 率相對大大地提高。
[0062] 8?原花青素的鑒定
[0063] 1)鑒定原理：原花青素本身屬于多酚類物質的一種，因而可以用鑒定多酚的方 式，即使用薄層層析來鑒定原花青素。薄層層析法（吸附色譜），吸附性薄層色譜法是將吸 附劑在光潔的表面上均勻地鋪成薄層，而后在在上面點上樣品，以流動相開展，這樣樣品組 分不斷地被吸附劑吸附，而被流動相溶解，解吸而向前移動。由于吸附劑對不同組分有不同 的吸附能力，流動相也有不同的解吸能力，因而流動相在向前移動的過程中，不同組分的物 質將被分開。如果各組分本身有顏色則薄層板干燥后會出現一些列高低不同的斑點，如果 本身沒有顏色，則可用各種顯色方法使之顯色。
[0064] 2)測定方法：制備所需的層析板，將實施例1制備的原花青素濃縮液在薄層上展 開。
[0065] 3)測定結果：在薄層層板上會出現一個淡黃色色斑，向其噴顯色劑，出現藍色，證 明所分離得到的提取產物為多酚類原花青素。
[0066] 實施例2
[0067]具體的制備方法與實施例1基本相同，不同的是：
[0068] 步驟2中甲醇、乙醇和水溶液按體積比為0.5:1:2配制成混合溶液，步驟3中 在-0. 30mPa的條件下進行負壓凍溶。步驟4中微波輔助提取原花青素時，首先，在550W 微波條件下進行微波處理，時間為15min，微波設置短時間多次破碎方式，每次微波時間為 〇.8s，間隔時間為0.5s。期間如反應液溫度超過設定的報警溫度（45°C)則微波停止。最 后,離心處理時將經過微波處理過的提取液在2000r/min下離心20min。
[0069] 將實施例2制得的原花青素用于以下動物實驗
[0070] 取昆明種小鼠50只（每只體重在15g~20g)，隨機分成5組：空白對照組、模型 對照組、原花青素高、中、低三個劑量組，分別記為A、B、C、D、E組。對C、D、E組分別灌服用 150、100、50mg/kg體重的原花青素，A組給予同體積蒸餾水。4周后處死動物，用生化的方 法測定局部的S0D和HYP含量，其具體結果如下：
[0071]
【主權項】
1. 一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 準備葡萄皮和葡萄果肉：將葡萄果剔除葡萄籽得到葡萄皮和葡萄果肉； (2) 萃取原花青素：按體積比為（0. 5-2) : (0. 5-2) : (0. 5-2)配置甲醇、乙醇和水溶液成 混合溶液，將混合溶液與步驟（1)準備的葡萄皮和葡萄果肉混合，反應12-36小時； (3) 步驟（2)反應后，將反應物進行固液分離得到提取液，在（-0. 30MPa)-(-0.05MPa) 的條件下，對提取液用水凍溶，并濃縮； (4) 微波提取原花青素：在400-650W微波條件下對提取液處理6-15min，離心； (5) 濃縮：將步驟（4)離心后的上清液進行濃縮，得到濃縮的原花青素提取液。
2. 根據權利要求1所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，將 步驟（1)中所述葡萄皮和葡萄果肉搗碎。
3. 根據權利要求1所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，步 驟（2)中所述甲醇、乙醇和水的體積比為1:1:1，所述混合溶液與步驟（1)準備的葡萄皮和 葡萄果肉混合后反應24小時。
4. 根據權利要求1所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，步 驟（3)中將所述固液分離得到提取液在-0. lOMPa下用0°C以下的水凍溶；步驟（4)中在 550W微波條件下對所述提取液處理。
5. 根據權利要求1所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，步 驟（4)中所述對提取液處理采用短時間多次微波處理的方式，每次微波時間為0.3-0. 8S， 時間間隔為〇. 3-0. 8S。
6. 根據權利要求5所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，步 驟（4)中每次微波時間為0. 5S，時間間隔為0. 5S，提取液溫度超過40-50°C則反應停止；所 述微波處理過的提取液在2000-4000r/min下離心5_20min。
7. -種將權利要求1所述的方法制得的葡萄果中原花青素提取物制成原花青素凍干 粉的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 過濾：收集濃縮的原花青素提取液，用孔徑小于0. 45 y M的濾膜過濾； (2) 濃縮：濃縮上清液； (3) 過濾：將濃縮的上清液采用孔徑小于0. 22 y M的濾膜過濾； (4) 凍干處理：凍干溫度為（_20°C )-(_35°C )，真空度為50-200Pa，凍干時間為24-36 小時，即得到原花青素凍干粉。
8. 權利要求7所述的方法制得的原花青素凍干粉在抗衰老護膚品中應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于：所述抗衰老護膚品為面膜、爽膚水、面霜、乳 液、眼霜、洗面乳。
10. 如權利要求8所述的應用，其特征在于：所述原花青素凍干粉在抗衰老護膚品中的 添加量為1-1000 y g/ml。
【專利摘要】本發明公開了一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，包括以下步驟：(1)準備葡萄皮和葡萄果肉：將葡萄果剔除葡萄籽得到葡萄皮和葡萄果肉；(2)萃取原花青素：配置甲醇、乙醇和水溶液成混合溶液，將混合溶液與步驟(1)準備的葡萄皮和葡萄果肉混合，反應；(3)將反應物進行固液分離得到提取液，在負壓的條件下，對提取液用水凍溶，并濃縮；(4)微波提取原花青素：在550W微波條件下對提取液處理，離心；(5)濃縮：將離心后的上清液進行濃縮，得到濃縮的原花青素提取液。本發明提取效率更高，提取的原花青素化合物具有抗衰老等功效，應用于抗衰老美容行業中。
【IPC分類】C07D311-62, A61K8-49, A61Q19-08
【公開號】CN104628698
【申請號】CN201510074121
【發明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 池詩源, 王小燕
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月11日