專利名稱：一種鑒別銀杏葉制劑中原花青素的方法
技術領域：
本發明涉及用于分析和鑒別分析物或待分析樣本中含有原花青素的方法，具體為銀杏葉制劑中是否有摻假其他來源原花青素的鑒別方法。
背景技術：
銀杏是目前世界上存活的最古老的樹種之一，其制劑、保健食品已經成為當今世界市場上最熱門的植物產品之一。銀杏葉提取物的藥用價值很高，具有拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗過敏、擴張血管、保護心腦血管、改善外周血液循環、降低血清膽固
醇及輔助抗癌等多種藥理學活性。銀杏內酯和黃酮是產生上述藥理學活性的主要成分，也是銀杏葉提取物的主要有效成分和質量控制指標。近年研究發現了銀杏中含原花青素，其同樣具有廣泛的藥理學活性，是銀杏葉制劑產生療效的又一主要成分。原花青素是一類由若干個兒茶素類化合物聚合而成，具有黃烷-3-醇結構的植物多酹類化合物。原花青素在自然界中有多種亞型，包括Propelargonidin (單體為阿夫兒茶精和表阿夫兒茶精)、Procyanidin (單體為兒茶素和表兒茶素)、Prodelphinidin(單體為沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素)、Profisetinidin (單體為非瑟酮醇和表非瑟酮醇)、Prorobinetinidin (單體為洋槐兒茶精和表洋槐兒茶精)。不同植物中的原花青素，其單體組成及比例都是不同的。大部分植物原花青素以兒茶素和表兒茶素組成的Procyanidin為主。而銀杏原花青素則主要由沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素組成，即Prodelphinidin,其比例高達85%。到目前為止,Prodelphinidin僅發現存在于美國山核桃(Carya illionensis)的髓心及銀杏葉中。用于分析原花青素的方法有很多，曾有學者應用正相-高效液相色譜法將可可、草莓的原花青素按聚合度大小進行分離，這是一種有效的分析原花青素組成的手段。但目前，銀杏原花青素的研究仍處于起步階段，對銀杏葉制劑中原花青素的分析，包括定性和定量分析，均沒有文獻報道。由于現在國家銀杏葉制劑產品的檢測標準較低，造成了有不法商人用別的低價產品摻入銀杏中制劑產品中，制備出檢測合格的銀杏葉制劑假貨，危害到人民群眾的用藥安全，危險性極大。目前對銀杏黃酮的檢測已有專屬方法，但其要求較高，應用受限。而銀杏葉制劑中原花青素的真假鑒別未見相關報道，因此在檢測方面是一個空白。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于分析銀杏葉制劑中原花青素的方法，該方法能去除絕大多數雜質的干擾，快速將銀杏葉原花青素按聚合度的大小進行分離，并根據不同來源原花青素圖譜的不同，用于鑒別銀杏制劑中有沒有摻假。本發明人在對銀杏葉制劑中原花青素研究時發現，雖然多種植物中都含有原花青素，但由于植物來源不同，其中的原花青素含量不同，種類也不同，也表現出不同的功效。目前雖然對原花青素的相關研究較多，但都集中于單一來源的原花青素檢測，對不同來源的原花青素沒有進行有效的比較，特別是對于兩種或多種不同來源的原花青素檢測沒有研究。對原花青素檢測則主要集中于含量，因此如市場上有低價格的原花青素產品如葡萄籽原花青素摻假于銀杏葉原花青素中，目前沒有方法檢測出。而由于不同成分功效不同，這種摻假行為對產品的危害極大。因此一種簡單、反應靈敏、快速的對原花青素摻假的檢測方法對保證人民用藥安全意義重大。本發明人在長期研究中發現，銀杏葉中的原花青素和其它植物來源的原花青素不同，如目前市場上低價的葡萄籽原花青素每個聚合度均只出一個峰，而銀杏原花青素從二聚體開始，均有2 3個特征峰。如有效的加以利用，可成為鑒別銀杏葉中是否摻假其它原花青素的關鍵點。為實現上述發明目的，本發明提供了以下一種解決方法，主要包括以下內容
I.銀杏葉制劑樣品前處理
由于銀杏葉制劑中雜質成分會影響原花青素的測定，因此需要對銀杏葉制劑進行前處理。前處理主要有三步1、將銀杏葉制劑制成水溶液并上樣于30-60目的聚酰胺樹脂；11、去除20%丙酮溶液洗脫部位；111、收集80%丙酮溶液洗脫部位并干燥后用適量甲醇使其完全溶解。根據銀杏葉制劑來源不同，固體制劑和液體制劑的上述前處理方法分述如下
(I)固體制劑將銀杏葉制劑粉碎后，用20%丙酮溶液超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性
輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位的洗脫液；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位的洗脫液；將80%丙酮部位洗脫液回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機相，回收水相至干；殘渣用適量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。(2)液體制劑將銀杏葉制劑直接上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20 %丙酮溶液洗脫，棄去該部位的洗脫液；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，80%丙酮部位的洗脫液；將80%丙酮部位洗脫液回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁 酯萃取2次，棄去有機相，回收水相至干；殘渣用適量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。2.正相-高效液相色譜去(NP-HPLC)分離上述甲醇溶解液，并用HPLC進行檢測，其中NP-HPLC色譜條件如下
(1)固定相為phenomenex 二兀醇柱(250X4. 6 mm, 5 μ m)；
(2)流動相為(A)乙腈，(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V);流動相梯度為O 10min 0 12%B ；10 10. 01 min 12 15%B ； 10. 01 30 min 15 45%B ；30 35 min 45%B ;35 40 min 45 0%B ；
(3)流速為I. O ml/min ；
(4)檢測波長突光激發波長276nm ;發射波長316 nm ；
(5)進樣量為20UL03.色譜圖對比
將上述方法所得的色譜圖，與純銀杏葉提取物色譜圖進行對比，如有摻假情況，則色譜圖與純銀杏葉提取物色譜圖會有明顯不同。
通過上述方法可用于檢測銀杏葉制劑中原花青素是否有摻假，并且反應非常靈敏，極少量的原花青素摻假即可用本發明方法檢測出，能檢測出銀杏葉提取物中摻O. 5%以上的其它來源原花青素，也就是O. 5%以上的原花青素摻假就可通過本發明方法加以檢測鑒別。本發明不僅可用于銀杏葉提取物制劑中原花青素是否有摻假，還可用于含銀杏葉提取物的食品、保健品、醫藥品和/或化妝品，如銀杏葉片、銀杏葉注射液、銀杏葉膠囊保健品等等；涉及的摻假原花青素的來源包括葡萄籽\松樹片、蘋果、山楂、花生、番荔枝、野草毒、越橘、酸果曼、蓮房等等。通過本發明中的方法檢測銀杏葉制劑中的原花青素，受外界干擾少。本發明中對分析用樣本的前處理方法，可以去除絕大多數雜質的干擾。采用本發明的方法對純銀杏葉提取物、銀杏葉片、銀杏葉膠囊、銀杏葉注射劑進行檢測，結果發現圖譜形狀一致，在所有圖譜中均可見原花青素二聚體的兩個明顯特征峰、三聚體和四聚體特征峰。而其它檢測方法則因存在大量的雜質，不能有效辨別其中的部分特征峰。說明本發明的方法特異性高，制劑中的其它成分不影響本發明方法的測定。
本發明人首先對純銀杏葉原花青素進行了檢測，具體結果見實施例I。本發明中高效液相色譜法測定方法參見《中國藥典》2010年版I部附錄VI D高效液相色譜法，具體儀器條件等參見具體檢測過程及實施例。本發明適用于各種劑型的銀杏葉制劑中原花青素的分析和鑒別，前處理方法簡單、操作步驟少；分析方法快速、準確；鑒別真偽方法容易、判斷指標清晰明確。因此，本發明的方法對銀杏葉各種劑型的制劑、含銀杏葉提取物的食品、保健品、醫藥品和/或化妝品中原花青素的快速分析和鑒別，是合適的方法。借鑒并改良上述分析方法，使其適用并應用于銀杏葉制劑中原花青素的分析，對于銀杏葉制劑標準的提高及產業化的進一步發展意義重大。


圖I為實施例I :銀杏葉原花青素(A)和葡萄籽原花青素(B)的NP-HPLC色譜2為實施例2 :銀杏葉片劑中原花青素的NP-HPLC色譜圖(A)樣I :未經任何前處理的樣本；(B)樣2 :經聚酰胺純化，未經乙酸丁酯萃取的樣本；(C)樣3 :經本發明方法完全前處理的樣本
圖3為實施例3 :銀杏葉膠囊劑中原花青素的NP-HPLC色譜4為實施例4 :銀杏葉注射劑中原花青素的NP-HPLC色譜5為實施例5 :摻假銀杏葉制劑中原花青素的NP-HPLC色譜圖(A)摻入O. 5%葡萄籽原花青素；(B)摻入I. 0%葡萄籽原花青素；(C)摻入2. 0%葡萄籽原花青素；(D)摻入4. 0%葡萄籽原花青素；(E)未摻假。
具體實施例方式 本發明結合具體實施例進一步說明如下
實施例I銀杏葉原花青素檢測及與葡萄籽原花青素的對比
取自制的銀杏原花青素提取物(原花青素含量為95%)和葡萄籽原花青素提取物(原花青素含量為96%)，分別溶于甲醇，過濾后，進行HPLC檢測
設備Aglient 1200型高效液相色譜儀；Diamonsil C18色譜柱5 μ m 4. 6X 1 50mm色譜條件
(1)固定相為phenomenex 二兀醇柱(250X4. 6 mm, 5 μ m)；
(2)流動相為(A)乙腈，(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V);流動相梯度為O 10min 0 12 %B ; 10 10. 01 min : 12 15 %B ; 10. 01 30 min : 15 45 %B ;30 35 min 45 %B ; 35 40 min :45 O %B ；
(3)流速為I. O ml/min ；
(4)檢測波長突光激發波長276nm ;發射波長316 nm ；
(5)進樣量為20UL0 結果見圖1，從HPLC色譜圖中可以發現，葡萄籽原花青素每個聚合度均只出一個峰，而銀杏原花青素從二聚體開始，均有2 3個特征峰，其原因是構成銀杏的原花青素組成與葡萄籽的原花青素組成不同。實施例2銀杏葉片劑中原花青素的分析
樣品來源銀杏葉片(廠家浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號20100709)
樣I :取片劑2片，研磨至細粉，用甲醇溶解，過濾，即得。樣2 :取片劑2片，研磨至細粉，用16ml 20%丙酮溶液、超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至干；殘渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。樣3 :取片劑2片，研磨至細粉，用16ml 20%丙酮溶液、超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機相，回收水相至干；殘渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。上述3個樣本，分別用實施例I中的色譜條件進行原花青素的分離，結果見圖2。從HPLC色譜圖中可以發現，經過前處理的銀杏葉片劑(樣3)中，原花青素二聚體在14min左右和15min左右有兩個明顯的特征峰，同時三聚體和四聚體的特征峰也可分辨出來；未經任何前處理的樣1，由于存在大量的雜質，因此幾乎未出現原花青素的特征峰；經聚酰胺樹脂純化、未經有機溶劑萃取的樣2，在去除了大量的雜質后，可以分辨出原花青素二聚體的兩個特征峰，但由于仍存在較多的雜質，因此，三聚體較難辨別。實施例3銀杏葉膠囊劑中原花青素的分析
樣品來源天保寧膠囊(保健品，杭州康恩貝制藥有限公司生產，批號20110516)
取膠囊劑2片，打開膠囊，倒出內容物，研磨至細粉，用16ml 20%丙酮溶液、超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料。將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機相，回收水相至干；殘渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。用實施例I中的色譜條件進行原花青素的分離，結果見圖3。從HPLC色譜圖可清楚的分辨中原花青素二聚體的兩個明顯的特征峰，以及三聚體和四聚體的特征峰。
實施例4銀杏葉注射劑中原花青素的分析
樣品來源銀杏葉注射劑(德國威瑪舒培博士藥廠生產，批號20110423)
取銀杏葉注射劑一支，直接上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機相，回收水相至干；殘渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。用實施例I中的色譜條件進行原花青素的分離，結果見圖4。由HPLC色譜圖同樣可清楚的分辨中原花青素二聚體的兩個明顯的特征峰，以及三聚體和四聚體的特征峰。實施例5摻假銀杏葉制劑中原花青素的分析
在銀杏葉提取物中模擬摻假葡萄籽提取物，并進行了相關檢測。稱取自制4份銀杏提取物，分別為I. 99g、l. 98g、l. 96g、l. 92g ;依次加入葡萄籽提取物O. 01g、0. 02g、0. 04g、O. 08g，即摻假量分別為O. 5%、1. 0%、2. 0%、4. 0%。將上述四份摻假制劑分別用200ml 20%丙酮溶液、超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機相，回收水相至干；殘渣用甲醇溶解，即得甲醇溶解液。用實施例I中的色譜條件進行原花青素的分離，結果見圖5。由HPLC色譜圖可得，摻入葡萄籽原花青素的銀杏提取物HPLC特征峰發生了明顯的改變①二聚體兩個峰的特征發生改變14min左右的峰為Procyanidin的二聚體峰，15min左右的峰為Prodelphinidin特有的二聚體峰，因此加入葡萄籽原花青素后，前峰較后峰的出峰強度更加明顯、峰高更高、峰面積更大！②17min左右的Procyanidin三聚體峰，在未摻假制劑中，出峰不是很明顯，但加入葡萄籽原花青素后，該峰出峰強度明顯增加上述兩種改變的趨勢與葡萄籽原花青素加入量成正比。利用特征峰的變化和趨勢，可以鑒別真偽，可以非常容易的鑒別出銀杏葉制劑中是否有摻假。上述摻假原花青素的來源還可包括松樹片、蘋果、山楂、花生、番荔枝、野草莓、越橘、酸果蔓、蓮房等。摻假后均可見最后所得色譜圖的明顯改變。
權利要求
1.一種鑒別銀杏葉制劑中原花青素的方法，鑒別銀杏葉制劑中是否摻假原花青素，包括以下步驟1)銀杏葉制劑的前處理1、將銀杏葉制劑制成水溶液并上樣于30-60目的聚酰胺樹脂；11、去除20%的丙酮溶液洗脫部位；111、收集80%的丙酮溶液洗膠部位并干燥后用適量甲醇使其完全溶解，獲得甲醇溶解液；2)正相-高效液相色譜法分離上述甲醇溶解液，其中正相-高效液相色譜條件如下固定相為phenomenex 二元醇柱,250X4. 6 mm, 5μ m ;流動相為乙腈-甲醇/水/乙酸，其中乙腈為A，甲醇/水/乙酸為B，A+B=100%,甲醇/水/乙酸的體積比V/V/V為95/3/2 ;流動相梯度為O 10 min 0 12 %B ；10 10. 01min 12 15%B ； 10. 01 30 min : 15 45 %B ；30 35 min 45 %B ；35 40 min 45 O%B ;流速為I. O ml/min ;檢測波長熒光激發波長276 nm ;發射波長316 nm ;進樣量為20μ L ;3)色譜圖對比將上述方法所得的色譜圖，與純銀杏葉提取物色譜圖進行對比，如有摻假情況，則色譜圖與純銀杏葉提取物色譜圖會有明顯不同。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征是所述銀杏葉制劑為固體制劑，將銀杏葉固體制劑粉碎后，用20%丙酮溶液超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20 %丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機相，回收水相至干；殘渣用甲醇溶解，即得銀杏葉制劑甲醇溶解液。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征是所述銀杏葉制劑為液體制劑，將銀杏葉制劑直接上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位的洗脫液；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，80%丙酮部位的洗脫液；將80%丙酮部位洗脫液回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機相，回收水相至干；殘渣用適量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。
4.根據權利要求I或2或3所述的方法，其可用于含銀杏葉提取物的食品、保健品、醫藥品和化妝品中摻假原花青素的檢測。
5.根據權利要求I或2或3所述的方法，其特征是摻假原花青素的來源包括葡萄籽\松樹片、蘋果、山楂、花生、番蒸枝、野草莓、越橘、酸果蔓、蓮房。
全文摘要
本發明提供一種鑒別銀杏葉制劑、含銀杏葉提取物的食品、保健品、醫藥品和/或化妝品等樣本中是否含其他來源原花青素的分析鑒別方法，采用聚酰胺樹脂純化、有機溶劑萃取等方法前處理待檢樣品和標準品，以固定相為phenomenex二元醇柱，250×4.6mm，5μm；(A)乙腈-(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V)為流動相；采用梯度洗脫，分別建立待檢銀杏葉制劑溶液樣品和標準銀杏葉制劑溶液標準品的正相-高效液相色譜圖，對比分析色譜圖。該鑒別方法，靈敏度高，分離度和重現性好，鑒別特征明顯，能夠準確鑒別銀杏葉中摻0.5%以上的其它來源原花青素。
文檔編號G01N30/14GK102818863SQ20121018404
公開日2012年12月12日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者葉劍鋒, 喬洪翔, 方玲, 王如偉, 盛衛國, 閔會, 馬麗萍, 姚建標 申請人:浙江康恩貝制藥股份有限公司, 浙江現代中藥與天然藥物研究院有限公司