專利名稱：一種低聚原花青素及其提取方法
技術領域：
本發明涉及一種低聚原花青素及其提取的方法，特別涉及到在避光、脫氧及低溫 條件下，經溶劑提取和柱層析得到的高活力原花青素的方法以及由所述方法得到的低聚原
花青素產品。
背景技術：
1、原花青素的功能原花青素是越橘、葡萄籽等果實中大量存在的一種黃烷醇類多酚類化合物。也是 越橘中最重要的功能成分。其中主要呈色物質由飛燕草色素(delphinidir^De)、矢車菊 色素(cyanidin ；Cy)、牽牛花色素(petunidin ；Pet)、芍藥花色素(peonidin ；Peo)和錦葵 色素(malvidin ；Mal)五種色素所衍生的眾多花色素苷和乙酰化花色素苷所組成，花色素 苷種類和含量視越橘品種而異。越橘原花青素結構上主要由黃烷醇中的單體(+)_兒茶素 [(+)-catechin, C], (_)_表兒茶素[(-)-印icatechin，EC]和(_) _表兒茶素沒食子酸酯 [(-)-epicatechin-3-0-gallate,EC G]聚合而成，其平均聚合度最高達十五聚體[7]。通常 將二至四聚體稱為低聚體(procyanidolic oligomers, 0PC)，將五聚體以上的稱為高聚體 (procyaLnido 1 icpo 1 ymers,PPC)。PC各單元間連接主要有C4-C6和C4-C8 二種方式，由于 單體的構象或鍵合位置的不同，可有多種異構體，且各聚合體和同聚異構體之間極性相近， 因此原花青素的拆分和結構表征一直比較困難[1]。原花青素不僅是越橘的主要功能成分，其他多種重要的保健植物品種，如銀杏 (葉)、葡萄(子)、黑加侖、黑豆、密蒙花(刺槐素)、高粱紅素、蘿卜紅、紅米素、玫瑰茄紅、 桑椹紅、可可殼、茶葉(酚)，其主要功效成分也是OPC或其衍生物。1950年，Masquelier 從松樹皮中提取出大量的0PC，并在法國將松樹皮提取物(其中含有約85%的0PC)注冊為 藥物，其商品名為Pycnogenl，用于提高血管的抵抗力，降低毛細血管的脆性和通透性[2]。 在隨后的實際應用中，歐洲的醫生們發現，OPC對諸如花粉過敏、關節炎、胃潰瘍等疾病同樣 也具有明顯的療效[3]。在德國，用葡萄籽原花青素制成的專利產品已用于治療微循環疾 病，包括眼睛與外周毛細血管通透性疾病及靜脈與淋巴功能不全W]。法國的Bonaure等發 明了以原花青素低聚體或單體為活性物(>1%)的治療牙周病的制劑并獲專利保護[5]。 法國利用葡萄籽原花青素制成了血管保護劑和抗炎劑W]。德國研制出用于治療酒精中毒 的原花青素制劑并獲專利保護[7]。在羅馬尼亞，一種商品名為Elldotelon原花青素制劑 已上市并用于治療毛細血管疾病[8]。法國、意大利也已將原花青素開發研制成化妝品，可 較好地防護紫外線對皮膚的傷害作用[9，10]。日本開發出用作藥品、食品和化妝品抗氧化 劑的原花青素，并獲專利保護。1996年日本厚生省批準把葡萄籽提取物列入《天然食品劑 名單中》，并以商品“Gravinal”投入市場[11]。在美國，葡萄籽原花青素作為健康食品的原 料直接制成膠囊等劑型，成為天然植物藥十大暢銷品之一。由于葡萄籽原花青素具有極強 的抗氧化性成分，因此在歐美被廣泛用于各種普通食品如蛋糕、奶酪等，既可作為營養強化 劑，又可作為天然防腐劑使用。越橘原花青素是各類花青素中品質較高的一種，據報道它具有抗氧化、抗炎癥、促進視紫紅質合成、提高免疫力、抗癌等多種生理功能[12，13]。原花青素發揮生物活性的主要機制包括以下5個方面1)抗氧化作用。1951年，法國Jacques Masquelier首次發現了 OPC的抗氧化性能。 原花青素具有很強的抗氧化活性，原因在于原花青素分子中具有多電子的羥基，8個酚羥基 均與雙鍵共軛，為氫原子的給予體，且芳環上的共軛雙鍵使電子在分子中得到穩定。Maffei 等對葡萄籽提取物原花青素(GSPE)研究顯示，高分子量成分兒茶素寡聚物在0. I-IOmmol/ L時能防止細胞膜中維生素E損失，顯著減少膜脂質過氧化，明顯推遲溶血的發生時間，能 顯著劑量依賴性地在羥基自由基誘導卵磷脂過氧化的自動氧化相中使維生素E再生，且延 緩其消耗，是維生素E的生理再生劑。研究同時證明葡萄籽原花青素抑制卵磷脂(PLC)過 氧化的作用明顯強于對照兒茶素，IC50分別為2. 5 μ mol/L和50 μ mol/L.抑制PLC誘導 期和增殖期中共軛雙烯形成和增長活性IC50分別為0. 1 μ mol/L和0. 5 μ mol/L,明顯強 于陽性對照組α-維生素E，其IC50 (50%自由基失活所需的濃度)分別為1. 5 μ mol/L和 1. 25 μ mol/L,該原花青素還可非競爭性地抑制促進過氧離子形成的黃嘌呤氧化酶IC50為 2.4ymol/L，強于對照的別嘌呤醇[14]。Lotito等以脂質體為模型研究原花青素的抗脂質 過氧化作用，當脂質的氧化作用起始于水相時，原花青素的單體、二聚體、三聚體的抗氧化 作用最大。當氧化發生在脂質區時，原花青素高分子量的多聚體抗氧能力最強，而Cu介導 的低密度脂蛋白氧化中，不同分子量的原花青素的抗氧化能力卻沒有顯著差異[15]。Koga 等研究一次給予CSPEQ5m/kg)對禁食大鼠血漿抗氧化水平影響時，發現攝GSPE可提高血 漿對氧化應激的抵抗力[16]。原花青素的抗氧化活性與其結構有密切相關性，不同聚合度 和構型的原花青素的抗氧化能力也不同。2)清除自由基。原花青素清除自由基的能力與其分子結構、聚合度以及與 培酸酯化的程度有關。而單從原花青素的分子結構來看(以二聚體為例)，每分子 ProcyanidinB-3 (有8個酚羥基)最多可以捕獲8個氧自由基，而分子Ve (有1個酚羥基) 僅能捕獲1個自由基，每分子Vc (有2個共軛羥基)能撲獲2個氧自由基。所以原花青素不 僅能夠清除自由基，而且能幫助保存和再生Vc，Ve，同時它也能夠通過制造彈性蛋白和膠原 纖維加固毛細血管壁，從而進一步防御自由基的侵蝕。據文獻報道原花青素在體內的保留 時間長達72h。而Vc的保留時間僅3h。這將大大增強其抗氧化清除自由基的能力。Bagchi 等[17]研究表明，原花青素具有很高的生物利用性，在抗自由基能力及保護因自由基引起 的脂質過氧化和抗DNA損傷能力顯著高于維生素C、維生素E和β胡蘿卜素。Castillo等 [18]研究表明在清除自由基、抗氧化活性能力上，原花青素>蘆丁>兒茶素>洋蕪荽苷 >抗壞血酸。Saint-Cricq De等[19]用3種方法測定原花青素的清除自由基活性，證實其 自由基清除能力依賴于其化學結構和立體結構。采用高壓和低壓液相色譜分離各寡聚體， 即使濃度很低，仍有較高活性，能有效地清除自由基，發現這些多酚類化合物清除自由基的 能力與它們的化學性質和立體化學結構密切相關。幻抗致突變、抗癌作用。癌癥及許多慢性退行性疾病是由多基因突變所致。而 原花青素在抗突變方面有一定的作用。體外實驗證明原花青素對Trp R2(食品中致突變 劑)的抑制率達94%，可抑制啤酒酵母線粒體自發性突變和細胞核由刀豆氨酸敏感到耐 刀豆氨酸的自發性突變[20]。而其抗放射線誘變能力依次為原花青素>蘆丁>二甲基亞 砜(DMSO) >抗壞血酸>丙基硫氧嘧啶(PTU) >洋蕪荽苷[18]。原花青具有抑制TPA( —種皮膚癌促進劑)活性，且抗癌變能力為三聚體>二聚體>單體。原花青素作用于人乳腺 癌MDA-MB468的有絲分裂信號傳導，細胞周期涌控及凋亡過程，引起腫瘤細胞生長抑制，程 序性死亡或分化，在乳腺癌治療上很有前景。Huynh等[21]發現從松樹皮中提取的原花青 素能選擇性誘導人類乳腺癌細胞凋亡，即用原花青素處理的人體乳腺癌細胞中測得的凋亡 數，比未處理的同種細胞高得多；而在正常人乳腺細胞樣品中，原花青素并不明顯改變凋亡 細胞的數量。Agarwal等[22]研究了原花青素對人前列腺癌DUI45細胞的作用，他們發現 用原花青素(10-/L)處理的細胞與溶酶組比較，DUI45細胞生長明顯受到抑制，呈現出劑量 和時間依賴性.并且DUI4S能以劑量依賴性的方式誘導Gl期的細胞靜止。在其它的人體前 列腺癌細胞系中.也可觀察到原花青素抑制癌細胞生長及誘導癌細胞凋亡的作用。這些研 究結果說明原花青素有很強的抗前列腺癌發生的作用，這可能與其調節有絲分裂、細胞周 期，誘導Gl期的細胞靜止、抑制細胞生長及誘導癌細胞凋亡等作用有關。綜上所述，原花青 素對多種癌細胞如皮膚癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞等都具有不同程度的抑制作用。4)心血管保護作用。原花青素具有保護血管的作用是因為其具有酶抑制活性，可 對膠原酶、彈性酶、透明質酸酶和β-葡萄糖醛酸甙酶等破壞膠原蛋白、彈性蛋白、透明質 酸等構成血管內壁重要組成成分的酶產生強大的抑制作用，可通過捕獲活性氧及調控上述 酶的活性以防止它們對血管物質的破壞，也可通過抑制透明質酸酶和β-葡萄糖醛酸甙酶 的活性以保護透明質酸的完整，使之維持高聚體形成的大分子。Fitzpatrick等研究證明 原花青素對血管具有舒張效應。Royer等臨床研究證實口服單次量150mg原花青素可使已 曲張了的靜脈提高張力。Maffei等[14]研究了原花青素對缺血性心室攣縮和缺血性心律 失常的預防。原花青素對微血管也有保護作用，所以它在治療眼科疾病方面也有一定療效。 Boissin和Corbe等分別研究了原花青素對視覺的影響，結果表明，服原花青素者眼球在 強光照射后的視覺性能比對照組有明顯改善，表明原花青素可能使視網膜得到較好營養。5)改善視力的功能。越橘原花青素被廣泛用于改善近視、遠視、視疲勞、夜盲癥、白 內障及視網膜炎等眼科疾病，是天然產物眼科用藥中的主要品種。在第二次世界大戰中，英 法飛行員在夜間飛行前，常服用越橘以增強暗視能力。日本醫師葉山隆一采用原花青素制 品對310人進行臨床觀察，其中視疲勞30人，近視100人，遠視100人，老花眼50人，黃斑 變異性癥30人，每日服用原花青素(早、中、晚各服25毫克)連續三個月，效果明顯視疲 勞、遠視有效率為100%;近視、老花眼為70%;黃斑變異性癥為99% (顯效為13% )。劉春 民等將越橘花青素用于青少年近視和視覺疲勞癥，取得了較好的效果。對深圳市3 名 18歲青少年進行一個月的雙盲法試驗，結果表明1)花青素能夠有效緩解或消除因視覺疲 勞而引起的視物模糊(77.2% )、眼球發脹(84.9% )、眼痛(93. )、畏光(50. 6)眼干澀 (87. 3% )和眼球酸累感(81. 9% )等癥狀。2、花青素能夠有效改善近視易感期、早期近視 和輕度近視的遠視力狀況，有效率達77. 12% (P < 0. 05)。但這種改善一般介于2 3行 (對數視力表)。這可能與患者存在視覺疲勞，服用花青素后可改善或緩解眼部疲勞有關。 3)花青素對治療前后近視眼球屈光度的影響無顯著性差異(P > 0. 05) [23]。原花青素改善視覺的機制包括多個方面，如提高黑暗適應性[M]、促進視紫紅 質再生[25二6]、改變瞬態折射[27]等。已有研究發現，花青素能夠有效改善人眼黃斑 恢復時間尤其是暗環境中的辨認能力，推測花青素能夠增加眼底微循環的血流，加速物質 代謝交換，增強對毛細血管的保護作用，進而改善黃斑恢復時間和夜間視覺。繼1968年Bastide P等報道了 25 % w/w的花青素提取物對視紫紅質合成的促進作用之后，2003年 HitoshiMatsumoto利用青蛙視桿細胞外層ROS膜，檢測了四種花青素對視紫紅質再生的促 進作用。結果表明，3-糖苷-矢車菊素能刺激再生作用，但花翠素卻沒有促進作用。同時 在ROS膜中沒有觀察到上述花青素對cGMP-磷酸二酯酶活力的明顯影響，表明花青素在桿 細胞光感受器中的主要作用是促進視紫紅質的再生。最近研究表明即使在漂白后，視蛋白 也保留了一定的激活光轉導通路的能力，促使胞內Ca2+濃度下降，從而減弱了視桿細胞 的光敏感性。因此，對視紫紅質再生的促進作用將加快視桿細胞光敏感性的恢復過程，這可 以解釋越橘對暗視能力的提升作用。2、原花青素的質量標準多酚含量是衡量花青素品質的重要指標，高品質的葡萄籽提取物要求其多酚含量 >95%。由于原花青素中低聚體(二、三、四聚體)的生物活性較好口8]，因此OPCs的含 量是產品質量的又一關鍵指標。以葡萄籽提取物為例，國際市場上優質產品的成分比例為 多酚/原花青素/OPCs/單體=1/0. 82/0. 81/0. 18，而目前國內最高的水平為多酚/原花 青素/OPCs/單體=0. 98/0. 84/0. 46/0. 12。一般來說，OPCs/原花青素的比值越高，質量 也越好。就檢測手段而言，多酚含量的測定方法主要有4種，即對照品UV法，香草醛法、UV 經驗值法和GAE法(Folin-Ciocalteu法)。原花青素含量的測定方法主要有3種，差值法 (用香草醛法測定總多酚含量，用UV法測定單體含量，取其差值)、BateS-Smith法、波特法。 OPCs的測定方法主要是HPLC法，即以OPCs標準品為對照品，利用反相HPLC準確測定花青 素樣品中單體、二、三、四聚體的含量。隨著多酚化合物市場的發展，成分標準化的必要性日 益提高，美國已建立了花青素前體物標準化研究會和綠茶提取物中的EGCg標準。現在作為 多酚化合物的分析方法，綠茶一般采用酒石酸鐵比色法。其他多酚化合物常用福林丹尼斯 法，該法是AOAC (美國分析化學家協會)規定的方法。由于缺乏各酚化合物公定的分析方 法，常用此法作為替代方法。為掌握個別成分含量，可用采用HPLC法。HPLC法需要使用相 當數量的標準品來測定每種成分，在操作上相對繁瑣，但對于定量測定多酚化合物的分子 量分布和對每種成分個別定量是必須的。3、越橘原花青素提取物的生產情況越橘是杜鵑花科越橘屬植物，在不同的產地分別被稱為藍莓、藍靛、山桑子等。越 橘常年生長在凍土中，果實呈藍色，并披一層白色果粉，果肉細膩，果味酸甜，風味獨特。其 果實營養成分豐富，營養價值極高，是罕見的珍稀野果，被譽為“漿果之王” [1]。目前國際市場上松樹皮和葡萄籽原花青素產品中，總多酚的含量能達到95%水 平，而OPCs的含量則相對較低。國內外越橘提取物產品中原花青素的含量一般在5 % -95 % 范圍，隨產品的品質而有所不同。其中，使用制備型HPLC精制，能將原花青素單體的純度提 升到相當高的程度，但是其成本也非常昂貴，尚不能滿足規模化生產的要求。國內規模化生 產的越橘提取物中，花青素含量一般在5-70%之間，其質控指標主要為總多酚含量，尚不能 對單體和低聚體的含量進行有效質控。根據國內外報道，越橘原花青素的提取工藝主要有1)水提取法先用水將水溶 性成分提取出來，再用有機溶劑進行萃取分離，最后蒸餾回收有機溶劑，得到原花青素提取 物。2)樹脂吸附法將花青素提取液用離子交換樹脂除去糖類和有機酸。3)膜分離法利 用各種類型的超濾膜和反滲透膜將色素以過濾的方式制得。4)重結晶法。使用上述各種方法得到的花青素含量可以達到98%左右，但是其中聚合度在5以下的低聚原花青素的含量 通常不超過50%，由于低聚原花青素在自然放置條件下不穩定，因此得到較高含量的低聚 原花青素產品難度很大。我國越橘原花青素提取物的生產單位較多，集中在黑龍江大興安嶺、吉林、遼寧、 四川、天津等區域，有的生產規模很大，并已經具備較好的設備基礎。但是產品的研發相對 薄弱，很多研究集中在探索色素的組成、結構特點、化學性質和生物學功能等，關于低聚體 規模純化工藝的研究成果相對較少。國內生產工藝以傳統的溶劑提取法結合樹脂柱吸附分 離為主，有的結合了較新的超臨界萃取法。其產品基本上只能控制總花青(色)素，由于概 念和檢測方法上的差異，不同公司宣傳的產品純度差異很大，從25%到98%的都有，但實 際上都是越橘花青素粗提物，高品質的低聚原花青素產品仍然少見。本發明針對原花青素提取中存在的問題，提供了一種更優的從越橘中提取低聚原 花青素的方法。研究表明，在黑暗、脫氧(及低溫)條件下，采用甲基丙烯酸酯樹脂層析能夠 得到高含量的小分子原花青素。該工藝為生產高品質越橘活性提取物，擴大我國越橘提取 物在食品、化妝品、醫藥領域的發展空間提供了重要參考。對于其它多種含有OPC的天然植 物，如葡萄(籽)、銀杏(葉)、黑加侖、黑豆、密蒙花(刺槐素)、高粱紅素、蘿卜紅、紅米素、 玫瑰茄紅、桑椹紅、可可殼、茶葉(酚)，檳榔、石榴皮、仙鶴草等，通過使用此種方法均有助 于提高低聚合度OPC的產量。

發明內容
在本發明的一個方面中，提供一種從含有OPC的植物原料中提取低聚原花青素的 方法，所述方法特征在于在低溫環境下進行，并且在提純過程中保持無氧或低氧以及避光 環境。在本發明的一個方面中，提供一種從含有OPC的植物原料中提取低聚原花青素的 方法，所述方法包括在低溫環境下進行下列步驟(a)萃取步驟取含有OPC的植物原料用有機溶劑浸提，收集上清過濾、濃縮，將濃 縮液加入非極性溶劑進行萃取；(b)提純步驟將步驟(a)中得到的濃縮萃取液通過大孔樹脂進行純化，并且保持 該提純過程中的無氧或低氧環境以及避光環境；將純化產物進行濃縮、凍干即得到所需產品。在一個實施方案中，所述(b)步驟具體為將步驟(a)中得到的濃縮萃取液上大孔 樹脂柱至大孔樹脂吸附飽和，再用脫氧水沖洗所述樹脂柱至沖洗液無明顯顏色；接著將所 述大孔樹脂柱用洗脫溶劑進行沖洗，將洗脫產物進行濃縮，將濃縮液凍干后即得到成品，其 中在將濃縮萃取液上柱前先將所述柱子用脫氧水處理以排除柱中氧氣，形成無氧環境，并 且在洗脫過程中，在洗脫溶劑中一直保持通入氮氣以維持脫氧環境。在一個實施方案中，所述含有OPC的植物原料可以是但不限于越橘果實。對于其 它多種含有OPC的天然植物，如葡萄(籽)、銀杏(葉)、黑加侖、黑豆、密蒙花(刺槐素)、高 梁紅素、蘿卜紅、紅米素、玫瑰茄紅、桑椹紅、可可殼、茶葉(酚)，檳榔、石榴皮、仙鶴草等，通 過使用此種方法均有助于提高低聚合度OPC的產量。在一個實施方案中，將(b)步驟中提純用的柱層析通路用不透光的材料如錫箔紙等包裹或將所述步驟在暗室中操作，以形成避光環境。在一個實施方案中，所述(a)萃取步驟也在避光環境下進行。在一個實施方案中，本發明提取低聚原花青素的過程在0-25°C的環境溫度下進 行，優選在4-16°C的環境溫度下，更優選在4°C的環境溫度下進行。在一個實施方案中，本發明所使用的大孔樹脂為甲基丙烯酸酯樹脂，包括HP-2MG 樹脂或XAD樹脂。在一個實施方案中，在柱洗脫過程中保持酸性環境。在一個實施方案中，使用PH =3-6的洗脫溶劑對樹脂柱進行洗脫。在一個實施方案中，本發明所使用的浸提溶劑可以為甲醇、乙醇或丙酮，尤其優選 70% (ν/ν)的丙酮，并且優選預冷的丙酮。在一個實施方案中，本發明所使用的非極性溶劑為石油醚和氯仿。在一個實施方案中，本發明所使用的洗脫溶劑為乙醇。在一個實施方案中，本發明 所使用的洗脫溶劑為10% -50% -75% -95%的乙醇。在一個實施方案中，本發明的上柱溫度為4-10°C，必要時可以使用室溫，但不超過 30 "C。在一個實施方案中，所述液料比(浸提溶劑與原料的比率)可以為1 1，2 1， 3 1,4 1,5 1，優選1 1到3 1，最優選液料比3 1。在一個實施方案中，所述液料比為丙酮與越橘果渣的比率，優選為70%丙酮與越 橘果渣的比率。在一個實施方案中，所述(a)步驟中的浸提時間是1小時。在一個實施方案中，所述脫氧水為pH 3. 0的脫氧蒸餾水。在本發明另一個方面，提供由上述方法獲得的原花青素產品，其特征為，富含原花 青素低聚體，提取物置于自然條件下會發生自氧化現象。在一個實施方案中，其中所述原花青素產品的主要成分均為4聚體以下的成分。在一個實施方案中，其中所述原花青素產品的花青素含量達98 % (w/w)，4聚體以 下的原花青素(含單體)含量高達90% (w/w)以上。在本發明的另一個方面中，提供由上述方法得到的原花青素產品用于清除超氧陰 離子自由基CV ·，羥基自由基HO ·的應用。本發明優選實施方案詳述特別地，本發明提供一種從越橘果實中提取低聚原花青素的方法，具體內容如下。以下操作過程均在4_16°C的環境溫度下進行，優選在4°C下進行。取洗凈的越橘 果，用勻漿攪拌機將其打成漿，4000rpm離心30min，果汁留作他用，取果渣用預冷的有機溶 劑(一般為70% ν/ν的丙酮)浸提1小時，果渣與浸提溶劑的重量比為1 3，溫度在室溫 下，4000rpm離心30min，收集上清過濾、真空濃縮至有機溶劑全部蒸出(回收的有機溶劑可 重復利用)，濃縮液加入體積比為4 1的混合非極性溶劑(石油醚和氯仿)，等體積萃取 2 3次。將甲基丙烯酸酯大孔樹脂用濕法裝柱，預處理后備用(預處理步驟見后)。在將上 述濃縮萃取液上柱前，先將柱子用脫氧水(在蒸餾水中通入氮氣5-20分鐘可以除去溶液中 的氧)走1 2個體積，以排除柱中氧氣，形成無氧環境，同時將整個柱層析通路(蠕動泵，乳膠管，玻璃鋼柱等)用錫箔紙包裹，形成無光環境。將濃縮萃取液上柱至大孔樹脂吸附飽 和，再用酸性脫氧水洗脫至沖洗液無明顯顏色(0PC酸性條件下為紅色，洗脫至無明顯紅色 時說明OPC已經基本吸附在樹脂柱上)。然后再分別用10% -50% -75% -95%的有機溶劑 (乙醇)進行沖洗，將各濃度洗脫有機溶劑均調整PH為3 6。在洗脫過程中，在洗脫溶劑 (乙醇)中一直保持通入氮氣，以維持脫氧環境。將洗脫溶劑以0. 5 4個柱體積/小時的 速度過柱。收集過柱后的液體。流出液顏色很淺時，停止洗脫溶劑過柱。記錄各洗脫產物 體積。將收集到的10%、50%、75(%、95(%的洗脫產物用旋轉蒸發儀在40 701進行濃縮， 將得到的濃縮液凍干后得到成品。樹脂的預處理步驟本發明中使用的大孔樹脂是甲基丙烯酸酯樹脂，包括XAD樹脂或HP-2MG樹脂，樹 脂提前過100-200目篩，用95%乙醇浸泡過夜，再用水洗至無乳白色；用4%的鹽酸溶液浸 泡4小時，用水沖洗；用4%的堿溶液浸泡4小時，再用水沖洗；用pH = 5的磷酸氫二鈉-檸 檬酸緩沖液洗，再用水沖洗至PH在5-6之間；裝柱、壓實備用。


圖1 用本發明方法提取得到的越橘原花青素產品的RP-HPLC圖。圖2 不同浸提溶劑對原花青素提取率的影響。圖3 不同丙酮濃度對原花青素提取效果的影響。圖4 不同環境溫度對原花青素提取效果的影響。圖5 不同液料比對原花青素提取效果的影響。圖6 不同浸提時間對原花青素提取效果的影響。圖7 抗氧化劑種類及其濃度對超氧陰離子自由基清除率的影響。圖8 抗氧化劑種類及其濃度對羥基自由基清除率的影響。圖9 =OPC樣品抗氧化活力隨著時間的衰減。圖10 不同條件下得到的原花青素產品比較。A用本發明實施例1方法制備的越橘低聚原花青素產品。所述產品在自然光下呈 現紫紅色金屬光澤，有結晶顆粒。B.未施加脫氧、避光、控溫條件，用HP-2MG樹脂制備的越橘原花青素產品，顏色紫
m
T^ OC.日本KND株式會社提純的越橘原花青素產品(目前常見的市售產品)，花青素 含量25%，呈粉末狀。
具體實施例方式實施例1提取越橘中的原花青素的環境溫度)本實施例1中的操作過程均在4°C的環境溫度(采用空氣調節器控溫)下進行。將大興安嶺篤斯越橘壓榨去汁后，稱取果渣100g，加入預冷)的70% ν/ν丙 酮300ml提取lh，4000rpm離心30min，收集上清過濾的濾液，真空濃縮，然后將濃縮液上柱 (柱子填料選用HP-2MG樹脂，4°C )，其中在柱子上樣前用通入氮氣的脫氧水(蒸餾水)沖洗 1 2個柱體積。將濃縮液上柱至HP-2MG樹脂吸附飽和，上樣完畢，再用pH = 3. 0的脫氧
9蒸餾水洗脫至沖洗液無明顯紅色(0PC在酸性條件下為紅色，洗脫至無明顯紅色時說明OPC 已經基本吸附在樹脂柱上)。然后用pH = 3. 0的10% -50% -75% -95%乙醇分別進行沖 洗所述層析柱，將洗脫溶劑以0. 5個柱體積/小時的速度過柱。洗脫期間在洗脫溶劑中一 直通入氮氣，以保持體系的穩定性。收集過柱后的洗脫液體。當流出液顏色很淺時，停止洗 脫，記錄各洗脫產物體積。將收集到的50%和75%餾分用旋轉蒸發儀(RE-52A旋轉真空 干燥儀，上海亞榮生化儀器廠)在40°C進行真空濃縮。將濃縮液凍干得紫紅色具有金屬光 澤的產品，經檢測，所述產品中總多酚含量達98%，4聚體以下的原花青素(含單體)含量 高達90%。在上述柱層析過程中，通過在暗室中操作，使樣品在層析過程中處于避光狀態。樹脂的預處理步驟將所述HP-2MG樹脂樹脂提前過100-200目篩，用95%乙醇浸 泡過夜，再用水洗至無乳白色；用4%的鹽酸溶液浸泡4小時，用水沖洗；用4%的堿溶液浸 泡4小時，再用水沖洗；用pH = 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液洗，再用水沖洗至pH在5-6 之間；裝柱、壓實備用。A) HPLC色譜分離結果HPLC色譜條件采用Alltima Cw反相色譜柱Q50mmX 4. 6mm，5 μ m)柱溫25°C ；流動相為2%甲酸 水溶液和2%甲酸甲醇溶液，經0. 45 μ m的微孔濾膜過濾后分2個梯度進行洗脫1 5min 時梯度變化為從95 5 IlJ 95 5，而5 50min時從95 5到0 100.流速lml/min ； 檢測波長278nm ；進樣量20 μ 1，葡萄籽標準品進樣量為100 μ 1.質譜條件用注射器以1μ Ι/min的速度持續進樣，離子檢測方式為單反應離子檢測(SRM)； 離子極性為正離子(positive)；離子化方式為電噴霧離子化(ESI)；毛細管電壓為2. OkV; 離子源溫度為200°C ；掃描范圍m/z 75-2000 ；碰撞能量35. 0V.由實施例1制備的越橘原花青素提取物經色譜柱分離后結果見圖1，各峰出峰時 間及相對含量見表1，以峰面積計算，最主要的8個洗脫峰均為4聚體以下，其面積積分含 量達到90 %。與95 %葡萄籽原花青素提取物相比，出峰數量和出峰時間均存在較大差異， HPLC分離結果表明二種產品在成分上明顯不同。表1花青素洗脫峰的HPLC保留時間和質核比
權利要求
1.一種從含有OPC植物原料中提取低聚原花青素的方法，所述方法特征在于在低溫環 境下進行，并且在提純過程中保持無氧或低氧以及避光環境。
2.權利要求1的方法，所述方法包括在低溫環境下進行下列步驟(a)萃取步驟取含有OPC的植物原料用有機溶劑浸提，收集上清過濾、濃縮，將濃縮液 加入非極性溶劑進行萃取；(b)提純步驟將步驟(a)中得到的濃縮萃取液通過大孔樹脂進行純化，并且保持該提 純過程中的無氧或低氧環境以及避光環境；將純化產物進行濃縮、凍干即得到所需產品。
3.權利要求2的方法，其中所述(b)步驟具體為將步驟(a)中得到的濃縮萃取液上大 孔樹脂柱至大孔樹脂吸附飽和，再用脫氧水沖洗所述樹脂柱至沖洗液無明顯顏色；接著將 所述大孔樹脂柱用洗脫溶劑進行沖洗，將洗脫產物進行濃縮，將濃縮液凍干后即得到成品， 其中在將濃縮萃取液上柱前先將所述柱子用脫氧水處理以排除柱中氧氣，形成無氧環境， 并且在洗脫過程中，在洗脫溶劑中一直保持通入氮氣以維持脫氧環境。
4.權利要求1或2的方法，其中所述含有OPC的植物原料是越橘果實，葡萄(籽)、銀 杏(葉)、黑加侖、黑豆、密蒙花(刺槐素)、高粱紅素、蘿卜紅、紅米素、玫瑰茄纖、桑椹紅、可 可殼、茶葉(酚)，檳榔、石榴皮、或仙鶴草。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中將(b)步驟中提純用的柱層析通路用不透光的材 料包裹或將所述步驟在暗室中操作，以形成避光環境。
6.權利要求2的方法，其中所述(a)萃取步驟也在避光環境下進行。
7.權利要求1或2的方法，所述提取低聚原花青素的過程在0-25°C的環境溫度下進行。
8.權利要求7的方法，所述環境溫度為4-16°C。
9.權利要求2的方法，其中所用的大孔樹脂為甲基丙烯酸酯樹脂。
10.權利要求9的方法，其中所用的甲基丙烯酸酯樹脂為HP-2MG樹脂或XAD樹脂。
11.權利要求2的方法，其中在柱洗脫過程中保持酸性環境。
12.權利要求2的方法，其中(a)步驟中所使用的浸提溶劑為70%(ν/ν)的丙酮。
13.權利要求2的方法，其中(a)步驟中所述浸提溶劑與原料的比率為3 1。
14.權利要求2的方法，其中所述(a)步驟中的浸提時間是1小時。
15.一種由權利要求1-14任一項方法得到的原花青素產品，其特征為，富含原花青素 低聚體，提取物置于自然條件下會發生自氧化現象。
16.權利要求15的原花青素產品，其中所述原花青素產品的主要成分均為4聚體以下 的成分。
17.權利要求16的原花青素產品，其中所述原花青素產品的花青素含量達98%(w/w), 4聚體以下的原花青素(含單體)含量高達90% (w/w)以上。
18.權利要求16-17中任一項的原花青素產品用于清除超氧陰離子自由基O2-·，羥基 自由基HO ·的應用。
全文摘要
本發明提供一種從含有OPC的植物原料中提取低聚原花青素的方法，所述方法的特征在于，在提純過程中保持無氧或低氧以及低溫條件，并且使用避光環境；本發明還提供由所述方法得到的原花青素，其特征為富含原花青素低聚體，提取物置于自然條件下會發生自氧化現象；本發明還提供由上述方法得到的原花青素產品用于清除超氧陰離子自由基O2-，羥基自由基HO·的應用。
文檔編號C07D311/62GK102086185SQ20091024169
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月2日 優先權日2009年12月2日
發明者劉翠, 孫波, 董先智, 陳少云 申請人:中國科學院生物物理研究所, 丹東晨星越橘科技發展有限公司