專利名稱：腸炎沙門氏菌的檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測家禽和其蛋中的腸炎沙門氏菌的方法。更具體地說，本發明涉及用于檢測腸炎沙門氏菌的方法，包括在將從懷疑含有腸炎沙門氏菌的家禽獲得的生物學樣品與腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的片段或腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的片段接觸，其中所述的片段特異性地識別存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開。
沙門氏菌的可能的毒力因子包括傘毛蛋白結構和脂多糖，傘毛結構是參與侵入真核細胞的基因產物。另一個因子是鞭毛，它授予細菌的運動特性，所以對細菌形成菌落有作用。
根據每年報道的大量的腸炎沙門氏菌病例，顯然需要對感染了腸炎沙門氏菌的蛋禽進行檢測的可靠的方法。如由Williams，J.E.，和A.D.Whittemore，鳥類疾病，20728(1976)公開的那些用于分離腸炎沙門氏菌的生物學技術是費力，費時和昂貴的。當由于樣品中存在的其他沙門氏菌血清型的生長超過腸炎沙門氏菌時產生假陰性。另外，這些方法不能識別感染了腸炎沙門氏菌的所有鳥類，因為沙門氏菌的排泄是間歇的。
有一些現有的血清學方法，例如血清平板測試(SPF)，膠乳凝集素測試(LAT)和酶聯免疫吸附測試(ELISA)，這些方法是快速的并且易于操作，已經發現在感染的雞血清中有相對高水平的抗腸炎沙門氏菌的抗體，使得抗體檢測成為現實。大多數ELISAs利用了脂多糖(LPS)或鞭毛抗原以檢測抗腸炎沙門氏菌的抗體。但是在近來的報道中這些抗原的利用已經產生了假陽性結果，使得將沙門氏菌血清型區分開變得困難。參見Christopher，J.等人臨床微生物雜志34792-797(1996)；van Zijderveld，Fred，臨床微生物雜志362560-2566(1992)；Barrow，P.A.，流行和感染109361-369(1992)；和Barrow，P.A.，食品微生物雜志2155-68(1994)。因此尋求進一步的方法。
本發明的另一個實施方案包括檢測腸炎沙門氏菌的方法，該方法包括在足于使存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體與抗原片段之一或兩者之間形成免疫復合物的條件下，將所述的從懷疑感染了腸炎沙門氏菌的家禽獲得的生物學樣品與腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的抗原性片段和腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段的結合物接觸和檢測所述的復合物的形成；其中所述的各個片段特異性地識別存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將抗腸炎沙門氏菌的抗體與抗其他沙門氏菌區的抗體分開。
本發明進一步涉及診斷試劑盒，包括腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的抗原性片段，腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段或其兩者，當與從懷疑感染了腸炎沙門氏菌的家禽獲得的生物學樣品結合時，其中所述的片段特異性地識別存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將抗腸炎沙門氏菌的抗體與抗其他沙門氏菌區的抗體分開。
圖2A列出了腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的氨基酸序列，圖2B列出了稱為C128的片段的氨基酸序列。
圖3是說明經測試證實對腸炎沙門氏菌有反應的傘毛蛋白SEF14的8個亞片段的圖。
圖4代表腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白抗原的全長以及從實施例2描述的全長序列獲得的片段。
圖5列出了圖4描述的全長腸炎沙門氏菌鞭毛蛋白的氨基酸序列，以及由270堿基對片段編碼的氨基酸序列和如實施例2描述分離的四個亞片段的各個的氨基酸序列。
發明的詳細描述抗原片段的測定A.傘毛抗原的抗原性片段第一次在1994年描述了命名為SEF14的傘毛蛋白(Thorns，C.J.等人，臨床微生物雜志282409-2414)。證實命名為sefA的編碼SEF14的基因的分布只限于屬于沙門氏菌血清型D的血清型。僅僅在腸炎沙門氏菌，都柏林沙門氏菌，布雷丹沙門氏菌和莫斯科沙門氏菌中檢測到SEF14抗原表達為表面結構，但是腸炎沙門氏菌是從家禽分離的唯一的血清型，并且SEF14的傘毛由所有的腸炎沙門氏菌菌株表達。已知在腸炎沙門氏菌感染之后產生了抗SEF14的抗體。SefA基因的完整序列是已知的并且在文獻中(Thorns，C.J.等人，臨床微生物雜志4(34)792-797(1996))和GenBank(入藏號L03833)公開。

圖1提供了SefA基因的DNA序列，并且標記為SEQ ID NO1。SEF14的氨基酸序列在圖2A提供。該序列鑒別為SEQ ID NO2。
為了測定SEF14的部分是否特異性地識別腸炎沙門氏菌，用從GenBank序列數據設計的引物從基因組DNA擴增SefA基因。將獲得的擴增片段克隆到表達載體。選擇載體以便SefA基因表達為融合蛋白。優選的融合配體是日本血吸蟲的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)。
用來自于試驗感染腸炎沙門氏菌和其它沙門氏菌血清型的雞血清進行免疫印跡測試獲得的重組GST-SEF14融合蛋白的反應性。GST-SEF14由所有腸炎沙門氏菌感染的血清識別，并且用來自于森夫頓堡沙門氏菌，阿姆斯特丹沙門氏菌，爪哇沙門氏菌，雞白痢沙門氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，會聚沙門氏菌和奧蘭寧堡沙門氏菌也獲得了弱反應譜帶。與哈特沙門氏菌，蒙特維的沙門氏菌，副鼠傷寒沙門氏菌，依米克沙門氏菌和感染前的血清沒有發現反應。從這些數據顯示SEF14融合蛋白與引起這些交叉反應的其他沙門氏菌血清型共有一些共同的表位。
為了將特異于腸炎沙門氏菌的SEF14的部分片段定位，如圖3顯示的SEF14的165個氨基酸的8個亞片段表達為與GST的融合蛋白。通過免疫印跡測試測試了各個片段的反應性。含有SEF14的三個片段，只有全長SEF14，即F165(165aa)由來自于腸炎沙門氏菌感染的所有血清識別。其他兩個片段，N150(150aa)和N136(136aa)沒有被一些腸炎沙門氏菌血清識別，提示不能被識別可能是由aa151和aa165之間的C-末端的一些表位缺失產生的。
含有SEF14的C-末端的四個片段中，有兩個片段C145(145aa，aa121-165)和C128(128aa；aa38-165)與所有的腸炎沙門氏菌血清型反應。其他兩個片段，C95(95aa)和C88(88aa)沒有被一些腸炎沙門氏菌血清檢測到，這表明aa37和aa70之間的表位與抗體結合相關。C128片段的氨基酸序列在圖2B列出并且本文標記為SEQ ID NO3。
通過親水性作圖Kyte-Doolittle和抗原性指數Jameson-Wolf計算機為基礎的程序可以分析SEF14氨基酸殘基的親水性和抗原性。這些程序有助于從序列的知識預測蛋白質的性質。氨基酸41-53，144-153和159-165的區域是親水性，據信它們代表抗原表位。從SEF14缺失這些區域導致具有降低的抗原性的多肽。
也用來自于試驗感染了各種沙門氏菌血清型的雞的血清對SEF亞片段的特異性進行測試。亞片段C128不與來自于除了腸炎沙門氏菌的沙門氏菌的血清型的血清反應。亞片段C145與來自于感染了森夫頓堡沙門氏菌，爪哇沙門氏菌，會聚沙門氏菌，阿姆斯特丹沙門氏菌，和副鼠傷寒沙門氏菌的血清反應弱。F165的aa1-36的N-末端的缺失使得亞片段C128比F165或C145更特異。當測試F165片段時，觀察到交叉反應，當測試C145時觀測的微弱的交叉反應。相反，當測試C128時，沒有看到交叉反應。這些結果表明由aa1-36結合的區域含有至少由不同沙門氏菌血清型共享的一個抗原表位決定基。這些研究詳細描述于下面的實施例1中。根據前述，本發明的范圍內令人滿意的片段是基本上由SEF14的C145片段的抗原性亞片段組成的，該片段特異性識別來自于家禽的生物學樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開。這樣的亞片段包括C128亞片段，它基本上由SEF14氨基酸序列的37-165位氨基酸組成，進一步包括特異性識別來自于家禽的生物學樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開的亞片段。對應于，或等同于C145片段的這些亞片段之一，并且包括至少C145片段的亞片段的序列的一個氨基酸進行了保守的氨基酸替代的多肽也包括在本發明的范圍內，條件是具有所述替代的序列特異性地識別來自于家禽的生物學樣品的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開。
利用ELISA和來自于用沙門氏菌和腸細菌超免疫接種的豚鼠的血清，和來自于試驗感染了沙門氏菌的雞的血清研究C128亞片段的特異性和敏感性。對于來自于豚鼠的血清，感染了腸炎沙門氏菌的OD值至少是比用除了都柏林沙門氏菌以外的其他血清高2倍，感染了都柏林沙門氏菌的血清具有類似的OD值，因為SEF14鞭毛蛋白與都柏林沙門氏菌具有交叉反應性。按照能夠使用C128用于被感染了腸炎沙門氏菌的家禽的鑒別的診斷，與都柏林沙門氏菌的交叉反應性不是難題，因為都柏林沙門氏菌沒有感染，所以不能從小雞分離。對于從小雞獲得的血清，來自感染了腸炎沙門氏菌的小雞的所有的血清顯示比來自感染了其他的沙門氏菌血清型的小雞的血清獲得的至少高2倍。這些數據顯示ELISA中的C128的反應性與免疫印跡的反應性相同。陽性的反應的截止OD值是正常血清的平均OD的三倍。
F165的C128的亞片段是檢測家禽的腸炎沙門氏菌的有用的工具。
B.鞭毛蛋白抗原的抗原片段在圖5顯示腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白區域的氨基酸序列(命名為13076和保藏于ATCC入藏號為U12963的腸炎沙門氏菌菌株的754-1024位核苷酸)識別號為SEQ ID NO4。擴增編碼鞭毛蛋白區域的DNA片段并克隆到表達載體。選擇載體以致想要的鞭毛蛋白基因產品以融合蛋白質的方式表達。首選的融合配體是日本血吸蟲的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)。表達獲得了GST-鞭毛蛋白重組蛋白質。在圖5提供了鞭毛蛋白的90個氨基酸的片段的氨基酸序列。該序列本文標記為SEQ ID NO5。
該重組蛋白質由都柏林沙門氏菌識別也由腸炎沙門氏菌識別，但是不被其他測試的任何沙門氏菌識別。
為了測定是否較小的序列可用于特定地識別家禽樣品中腸炎沙門氏菌，將重組蛋白質的鞭毛蛋白的序列與其他的沙門氏菌的鞭毛蛋白區域的序列比較，識別了蛋白質內的顯示與其他的序列有最大變化的特異的區域。鞭毛蛋白區域的四個亞片段表達為融合蛋白質，大小范圍為27.2kD至31.6kD，測試每個片段的反應性。證實每個片段特定地探測和區分感染了腸炎沙門氏菌的家禽的樣品與未感染了腸炎沙門氏菌的家禽的樣品。在圖5顯示了這些四個亞片段并且本文識別為SEQ ID NOS6-9。
圖5舉例說明的90個氨基酸的片段和四個亞片段中的每一個因此均可用于本發明的方法。任何這些序列的抗原片段或對應于這些序列之一的氨基酸序列也是有用的，所述的氨基酸序列包含在序列中至少一個氨基酸進行了保守的氨基酸取代，條件是具有所述的取代的序列特定地識別來自家禽的生物學的樣品中腸炎沙門氏菌的抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他的沙門氏菌區分開。腸炎沙門氏菌感染的檢測腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白和鞭毛蛋白的抗原片段可用于檢測來自家禽的樣品中的腸炎沙門氏菌的感染。首選的樣品是來自家禽蛋的血清樣品或蛋黃樣品。在存在于樣品的腸炎沙門氏菌抗體和抗原片段形成免疫學的復合物的條件下將樣品與本發明的腸炎沙門氏菌傘毛蛋白或鞭毛蛋白的抗原片段接觸一段時間。采用直接的檢測方法或間接的檢測方法可以測定所述復合物的形成。根據進行測定。根據所選擇的測定技術，如果使用，抗原片段，存在于樣品的腸炎沙門氏菌抗體或第二抗體用可檢測的標記物進行標記。從熒光化合物，放射性的元素，能夠產生反應可檢測的化合物的酶，或黃金可以選擇合適的可檢測的標記物。
利用直接的檢測方法，例如根據標準技術由ELISA測定抗原—抗體復合物。直接的檢測分析可以使用標記的抗原片段或標記的抗腸炎沙門氏菌抗體。利用標準標記技術可以進行抗體或抗原片段的標記。可檢測的標記物可以是熒光化合物，放射性的元素，能夠產生可檢測的反應產物的酶，或黃金。例如用放射性的同位素可以標記腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白或鞭毛蛋白的選定的抗原片段。然后根據本發明，在足于使得存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體與抗原片段之間形成免疫復合物條件下將樣品與腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白或鞭毛蛋白的放射性標記的抗原片段接觸一段時間，這樣形成的抗體—抗原復合物用放射性的標記物標記。然后采用免疫印跡法可以測定形成的復合物。或者用直接可檢測的標記物例如熒光化合物或黃金對存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體進行標記或將其綴合到通常用于比色的或熒光檢測的酶，如堿性磷酸酶。然后將未標記的腸炎沙門氏菌傘毛蛋白或鞭毛蛋白的抗原片段包被到微滴板并且與含有標記的腸炎沙門氏菌抗體的生物學的樣品接觸，這樣再對形成的抗體—抗原復合物用可檢測的標記物進行標記。例如采用標準的測定或其他的敏感的檢測系統進行對形成的標記的抗原—抗體復合物的檢測。
利用間接的檢測方法，根據本發明的標準技術采用ELISA或免疫印跡法可以測定抗原—抗體復合物。將腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白或鞭毛蛋白的抗原片段包被到微滴板，以提供用于俘獲存在于樣品中的抗腸炎沙門氏菌抗體的固相。或者，在用于免疫印跡法的溶液中可以提供抗原片段。在足于使得存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體與抗原片段之間形成免疫復合物條件下將片段與生物學的樣品接觸。然后利用綴合到可檢測的標記物的第二的抗血清例如熒光標記的抗體，酶綴合的抗體，包括辣根過氧化物酶綴合的抗體或堿性的磷酸酶—綴合的抗體，放射性的微量元素標記的抗體或黃金—標記的抗體可以檢測形成的抗體—抗原復合物。
與這些測定技術不同的另一條途徑是，根據標準技術產生抗本發明的腸炎沙門氏菌的抗原片段的單克隆抗體，然后將單克隆抗體用于包被微滴板的孔，然后將板與被懷疑含有腸炎沙門氏菌的生物學的樣品接觸，樣品中的抗原結合到單克隆抗體，利用如上所述的可檢測的標記物可以檢測。
用于本發明的優選的測定方法是如上所述的ELISA。第二優選的分析方法是側向流動形式測定方法，其可以以快速測試試劑盒形式提供。用于其他目的的這樣的商品試劑盒使得經由施加到含有抗原或者在本例中的抗原片段的試條的預定孔而吸收液體至膜上，然后將孔插入到抗原包被的膜上具有窗口的裝置中。
將樣品加入到孔以便流經膜，使得存在于樣品中的任何抗體與膜上的抗原交互作用。也將用可檢測的標記物如黃金標記的第二抗體導入到膜并且通過以樣品潤濕膜進行固定，并且結合樣品中的任何一抗。通過從窗口看得到的黃金沉淀到膜，根據膜上譜帶的出現觀察到獲得的陽性結果。通過將產生的抗想要的抗原片段的單克隆抗體包被到膜上也可以修飾側向流動形式測定方法。
Western印跡，點印跡和石英晶體技術也可用于檢測抗原或單克隆抗體的目的。
利用C128傘毛片段的測試方法和利用鞭毛蛋白的測定方法，可獨立地用于檢測家禽和它們的蛋的腸炎沙門氏菌感染。將傘毛蛋白和鞭毛蛋白片段合并使用也是實用的。抗SEF14的可檢測的抗體顯示早期感染，而通常在感染的后期檢測到抗鞭毛蛋白的抗體，因為抗鞭毛的抗體后來產生但是較長地存在。因此通過用傘毛蛋白和鞭毛蛋白的每一抗原片段測試樣品，可以從它的開始階段到成熟的階段檢測感染的存在，如此保證沒有感染就檢測不到。診斷試劑盒本發明進一步包括診斷試劑盒，可用于檢測和將家禽的樣品中的腸炎沙門氏菌感染區分開。該試劑盒包括如上所述的腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白或鞭毛蛋白的抗原片段，或包括腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的抗原片段和鞭毛蛋白的抗原片段。試劑盒進一步地包括標記物。合適的標記物包括可以附加到待測試的生物學樣品中的抗原片段或抗體的標記物如酶，黃金，熒光化合物，或放射性的元素。或者，以標記的第二抗體的形式提供了標記物以用于間接的檢測方法，例如酶聯抗體，包括辣根過氧化物酶綴合的抗體或堿性磷酸酶標記的抗體，黃金標記的抗體，熒光標記的抗體，或放射性微量元素標記的抗體。
在一個優選的實施方案中，試劑盒包括如上所述的側向流動形式分析方法中的必要的元件。
本發明進一步描述于下列的實施例，提供這些實施例用于解說的目的，不是有意地限制本發明。
實施例1細菌菌株由新加坡Primary Production Department提供了腸炎沙門氏菌菌株2/93噬菌體型4，119/95噬菌體型4，330/96噬菌體型11a和131/97噬菌體型37，40/97噬菌體型1，和296/96噬菌體型9b，和由美國農業部提供了分離株94/6510。所有的這些菌株均是公眾可得的。這些菌株用于小雞的實驗感染。血清樣品血清組1用細菌的不同菌株接種豚鼠以獲得特異于下列各項的血清腸炎沙門氏菌(組D)，都柏林沙門氏菌(組C)，肯塔基州沙門氏菌(組C3)，海德堡沙門氏菌(組B)，S.newport(組C3)，哥本哈根鼠傷寒沙門氏菌(組B)，豬霍亂沙門氏菌，鴨沙門氏菌(組E1)，S.cerro(組K)，大腸桿菌，氣單胞菌，多殺巴斯德氏菌，肺炎克雷白氏菌，奇異變形菌，Yersinia enterococci，Citrofreundii，宋內氏志賀氏菌，粘質沙雷氏菌和未感染的豚鼠血清。
血清組2用來自新加坡總醫院獲得的沙門氏菌屬各種的血清型感染小雞都柏林沙門氏菌(組D)，鼠傷寒沙門氏菌(組B)，鴨沙門氏菌(組E1)，雞瘟沙門氏菌(組D)，爪哇沙門氏菌(組B)，副傷寒沙門氏菌A(組A)，S.haardt(組C3)，哈特沙門氏菌(組C2)，和大腸桿菌。
血清組3在隔夜的肉湯制備上面列出的六個腸炎沙門氏菌菌株，將肉湯稀釋到1×108菌落形成單位(cfu)。進一步地依次稀釋該肉湯，產生107和105濃度的六個培養物。將十二個十周齡的小雞劃分為六個組，每個組二個，并且每個組的一個小雞用1毫升的105細菌肉湯接種，每個組的第二小雞用107細菌肉湯接種。在間隔7天獲得了來自每個小雞的血清，監測雞群從接種前到接種后二個星期脫落的沙門氏菌。
血清組4腸炎沙門氏菌陰性血清的四十個樣品是從無特異的病原體的小雞獲得的，小雞年齡范圍為1天齡小雞到十個星期齡的小雞。特定地，四十個樣品包括10個1天齡小雞，十四個四星期大的小雞，和十六個十星期大的小雞。
血清組5由新加坡Primary Production Department(PPD)從田間的小雞收集二十五個血清樣品。在馬來西亞從農場小雞收集這些樣品，其中已經識別到腸炎沙門氏菌感染。重組的腸炎沙門氏菌抗原sefA基因的核苷酸序列可通過Genbank(登記號L03833)獲得。如下所述設計和合成傘毛蛋白SEF14的C128片段的寡核苷酸引物。在5′末端設計具有Bam H1限制位點的引物作為正向引物，在3′末端設計具有EcoR1限制位點的引物作為反向引物。
正向引物5′TGC AGC TCA GAA TAC AAC ATC A 3′(從堿基112開始)反向引物5′GTT TTG ATA CTG CTG AAC GTA(在堿基495終止)本文將正向和反向引物分別標記為SEQ ID NOS10和11。
將Beckman OLIGO 1000M DNA合成儀用于合成。利用從腸炎沙門氏菌菌株ATCC13076提取的基因組DNA，通過PCR擴增DNA片段。將擴增的DNA克隆到pGEX-4T-3表達載體(從Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典獲得的)。將含有插入物的克隆測序以確定閱讀框的正確性。在大腸桿菌菌株JM105表達融合到GST的蛋白質，該菌株是從Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典獲得的，目錄號為27-1550-01。對于融合蛋白的純化，按照制造商的說明，將細菌細胞沉淀進行GST親和柱純化(Pharmacia Biotech)。為了獲得更高的純度，將蛋白質上樣到SDS-PAGE凝膠，用考馬斯亮藍染色1分鐘觀察到蛋白質譜帶并在去離子水中脫色。切下譜帶在去離子水中洗脫。通過這樣的凝膠純化獲得的蛋白質用作為ELISA測試的抗原。免疫印跡根據常規方式，但進行一些修改以進行Western印跡分析。將純化的融合蛋白與含有終濃度為0.1mol/L DTT的樣品緩沖液混合。將該混合物在100℃變性3分鐘并且SDS-PAGE分離。將在凝膠上分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜，在20伏特整夜電泳。用5％脫脂乳封閉該膜并且剝離成條。
以1∶400稀釋血清樣品，各添加到每個條，在室溫下保溫1小時，接著孵育兔抗雞IgG過氧化物酶綴合物1小時，然后用3′3′-二氨基聯苯胺四鹽酸(DAB)底物顯色。發現所有的傘毛蛋白片段反應陽性的。ELISA利用常規的方式進行ELISA。在碳酸鹽緩沖液pH9.6以每孔50納克/100毫升將純化的蛋白質包被到96-孔平底板(NUNC)。在用1％BSA封閉之后，將稀釋1∶200的血清樣品加入并且在37℃孵育15分鐘，接著在37℃與二級IgG過氧化物酶綴合物孵育15分鐘，最后加入底物OPD。結果表示為ELISA閱讀器(Bio-dot)記錄的在492納米的光密度(OD)。
分析C128抗原片段的遺傳圖與腸炎沙門氏菌感染的特異性和敏感性。陽性反應的截止值是未感染的小雞血清的OD值的3倍。測試該片段抗組2，證實腸炎沙門氏菌是陽性的，對于組3顯示所有的血清反應性是陽性的，對于組4，其中顯示所有的血清是陰性的。
實施例2所使用的細菌菌株和血清組與實施例1相同，如上所述，不同的是血清組2的小雞比實施例1描述的受更少的沙門氏菌血清型感染。重組腸炎沙門氏菌抗原采用聚合酶鏈反應(PCR)技術擴增腸炎沙門氏菌的ATCC13076編碼區的DNA的754-1024bp核苷酸。擴增的DNA克隆到pGEX-2T表達載體(公眾從Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典獲得)。為了純化GST-鞭毛蛋白，根據制造商的說明將細菌細胞沉淀進行GST親和柱純化(Pharmacia Biotech)。在該步驟回收大多數的GST-鞭毛蛋白。為了獲得較高的純度，該蛋白質上樣到聚丙烯酰胺凝膠。切下譜帶并且在含有0.1％SDS的去離子水洗脫。ELISA程序用50納克/100微升/孔重組蛋白質，在0.1M重碳酸鈉緩沖液(pH9.6)中包被Immulon微滴板(從Dynatech實驗室公司Chantilly，Va.可得)。在37℃培養該平板4小時，然后冷凍直到進一步的使用。用ELISA洗滌溶液(磷酸緩沖鹽水，0.05％Tween 20[PBST])洗滌平板4次，用1％牛血清白蛋白(BSA)部分V(Sigma)在磷酸緩沖鹽水(pH7.4)中，37℃飽和過量地結合位點1小時。在四次洗滌之后，將1％BSA-PBS緩沖液中的100微升的測試血清樣品(1∶200稀釋)加入到每個孔，在37℃平板孵育10分鐘。在隨后洗滌孔之后，將100微升的與辣根過氧化物酶(KPL)綴合的抗雞免疫球蛋白加入到每個孔，在37℃將平板孵育10分鐘。再一次洗滌孔并且加入100微升的底物溶液(2′2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)+H2O2)。使顏色反應在室溫下進行10分鐘，自動的ELISA平板閱讀器分別記錄405nm(ABTS)處每個孔的吸光度。腸炎沙門氏菌部分蛋白質的作圖為了評價是否如圖5中SEQ ID NO5所示的獲得的部分蛋白質是最小可能用于檢測家禽或其蛋中腸炎沙門氏菌的存在的片段，利用上面的相同方法將引物(下文表中列出)和獲得的片段克隆到pGEX-2T載體中。將獲得的四個部分蛋白質片段命名為FLP-A，FLP-B，FLP-C和FLP-D。同樣采用親和層析和凝膠切下純化這些部分片段。將這些部分蛋白質片段定量分析，隨后以每孔50納克進行包被。將雞血清用于ELISA中進行這些部分蛋白質片段的定性。從未感染的雞獲得的的血清產生陰性結果，而從腸炎沙門氏菌感染的雞獲得的血清產生陽性結果。
表1 所使用的引物的核苷酸序列
在本文將上面列出的引物分別標記為SEQ ID NOS12-19。數據分析對用于這些測試中的陰性血清計算平均讀數并且計算標準偏差。計算標準偏差范圍，其中將陰性血清的平均值加入到一個，兩個，三個，四個或五個標準偏差。發現陰性參照血清的平均值+2的標準偏差其值足于包括所有的陰性，并且獲得的所有已知的陽性血清的值高于上面的值。ELISA的截留值(檢測極限)定義為陰性參照血清的平均值+2倍標準偏差，該值能夠區分開陽性血清和野外感染的血清。
還計算了陽性/陰性的比例，這些數字作為相對于陰性參照值的反應的相對指示強度。
由t-檢驗(Sigma斜率程序)從統計學上分析所搜集的幾組數據的差異。所獲得的值表示在兩組看到的差異是顯著差異。低于0.01的P值被認為具有統計學意義的差異。腸炎沙門氏菌鞭毛融合蛋白的鑒定和特異性由Western印跡分析免疫學方法鑒定凝膠純化的GST-腸炎沙門氏菌抗原。用來自組1血清的豚鼠制備的血清測試融合蛋白。在測試的10個沙門氏菌血清型中，僅僅腸炎沙門氏菌和相同血清組的都柏林沙門氏菌顯示反應性。組1中其它血清型和其他生物體的血清沒有顯示反應性。所有的血清以1∶50的稀釋進行篩選。然后經抗從實驗感染的和未感染的雞獲得的血清而篩選融合蛋白。組3的所有血清反應陽性，組4的血清沒有顯示反應。開發利用GST-腸炎沙門氏菌融合蛋白的檢測腸炎沙門氏菌的ELISA在ELISA包被緩沖液中稀釋凝膠純化的GST-腸炎沙門氏菌鞭毛蛋白抗原片段融合蛋白并且以每孔50納克用作為微滴板上的包被抗原包被過夜。用組1的豚鼠的血清對包被抗原進行定性。利用雞血清進行隨后的定性。腸炎沙門氏菌感染的雞的血清具有最高的吸光率，計算出比陰性參照具有高出4.59倍的陽性/陰性比例。
然后測試組3的非感染的雞血清(在感染之前從雞獲得的血清作為prebleed)抗包被的抗原。幾乎所有的血清產生基底的讀數。5個不同的噬菌體類型的組3的感染的家禽血清產生100％的陽性結果。因此，該測試能夠檢測不同噬菌體類型的腸炎沙門氏菌。
從用哈特沙門氏菌，肺炎沙門氏菌，哈達爾沙門氏菌，傷寒沙門氏菌和爪哇沙門氏菌試驗感染的家禽獲得的組2的血清用測試抗原獲得陰性結果。這些數據證實與其他沙門氏菌血清型沒有交叉反應。與商品IDEXX腸炎沙門氏菌測試試劑盒進行比較利用IDEXX商品測試試劑盒(IDEXX實驗室公司，Westbrook，ME)和本發明的抗原對組5血清進行評價。利用IDEXX試劑盒，檢測了3/28個血清，利用本發明的抗原，14/28樣品被鑒定為血清學陽性。因此本發明的抗原顯示檢測率為78.6％，大于用商品測試試劑盒獲得的值。ELISA結果作圖的片段進一步對腸炎沙門氏菌融合蛋白作圖以評估仍能檢測和區分感染的和未感染的血清的最小區域。對在圖5顯示為片段A-D和具有分子量(包括GST)31.6kD，30.4kD，29kD，和27.2kD的總共4個片段進行克隆并且用選定的陽性和陰性血清進行篩選。來自于用腸炎沙門氏菌實驗感染的雞的8個血清樣品和SPF(沒有特異性病原體)血清的8個樣品用于對各個片段的敏感性進行定性。測定了片段的陽性/陰性(P/N)的比例。各個片段的平均P/N比例如下片段A3.23片段B2.95片段C3.02片段D2.97這些數據反映出與P/N比例是3.01的原始融合抗原類似的反應方式。
用存在于組2的血清樣品中的其他沙門氏菌血清型測試該片段的特異性。沒有片段與除了腸炎沙門氏菌以外的血清型反應。結果顯示于下面的表2
表2片段與血清型特異性血清的反應性
sefA的核苷酸序列ATTTTGTAATATGCGTAAATCAGCATCTGCAGTAGCAGTTCTTGCTTTAATTGCATGTGGCAGTGCCCACGCAGCTGGCTTTGTTGGTAACAAAGCAGAGGTTCAGGCAGCGGTTACTATTGCAGCTCAGAATACAACATCAGCCAACTGGAGTCAGGATCCTGGCTTTACAGGGCCTGCTGTTGCTGCTGCTCAGAAAGTTGGTACTCTCAGCATTACTGCTACTGGTCCACATAACTCAGTATCTATTGCAGGTAAAGGGGCTTCGGTATCTGGTGGTGTAGCCACTGTCCCGTTCGTTGATGGACAAGGACAGCCTGTTTTCCGTGGGCGTATTCAGGGAGCCAATATTAATGACCAAGCAAATACTGGAATTGACGGGCTTGCAGGTTGGCGAGTTGCCAGCTCTCAAGAAACGCTAAATGTCCCTGTCACAACCTTTGGTAAATCGACCCTGCCAGCAGGTACTTTCACTGCGACCTTCTACGTTCAGCAGTATCAAAAC(SEQ ID NO1)SEF14的氨基酸序列1MRKSASAVAVLALIACGSAHAAGFVGNKAEVQAAVTIAAQNTTSANWSQDPGFTGPAVAAGQKVGTLSITATGPHNSVSIAGKGASVSGGVATVPFVDGQGQPVFRGRIQGANINDQANTGIDGLAGWRVASSQETLNVPVTTFGKSTLPAGTFTATFYVQQYQN165SEF14的C128片段的氨基酸序列Amino acid sequenca for the C128 fragment of SEF14AAQNTTSANWSQDPGFTGPAVAAGQKVGTLSITATGPHNSVSIAGKGASVSGGVATVPFVDGQGQPVFRGRIQGANINDQANTGIDGLAGWRVASSQETLNVPVTTFGKSTLPAGTFTATFYVQQYQN(SEQ ID NO3)腸炎沙門氏菌鞭毛蛋白抗原的氨基酸序列LTQNNLNKSQSSLSSAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTSNIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGANDGETTTIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGYDTYAAGADKYRVDINSGAVVTDAAAPDKVYVNAANGQLTTDDAENNTAVDLFKTTKSTAGTAEAKAIRGAIKGGKEGDTFDYKGVTFTIDTKTGDDGNGKVSTTINGEKVTLTVADIATGATDVNAATLQSSKNVYTSVVNGQFTFDDKTKNESAKLSDLEANNAVKGESKITVNGAEYTANATGDKITLAGKTMFIDKTASGVSTLINEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAITNLGNTVTNLNSARSRIEDADYATEVSNMSKAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLLLR(SEQ ID NO4)腸炎沙門氏菌鞭毛蛋白抗原的90個氨基酸的片段TAEAKAIRGAIKGGKEGDTFDYKGVTFTIDTKTGDDGNGKVTTINGEKVTLTVADIATGATDVNAATLQSSKNVYTSVVNGQFTFDDKT(SEQ ID NO5)片段A69個氨基酸(aa 258-327 of SEQ ID NO4)KEGDTFDYKGVTFTIDTKTGDDGNGKVSTTINGEKVTLTVADIATGATDVNAATLQSSKNVYTSVVNGQ(SEQ ID NO6)片段B40個氨基酸(aa 276-316 of SEQ ID NO4)KTGDDGNGKVSTTINGEKVTLTVADIATGATDVNAATLQS(SEQ ID NO7)片段C27個氨基酸(aa 279-306 of SEQ ID NO4)DGNGKVSTTINGEKVTLTVADIATGAT(SEQ ID NO8)片段D11個氨基酸(aa 285-296 of SEQ ID NO4)STTINGEKVTL(SEQ ID NO9)
權利要求
1.在從家禽獲得的生物學樣品中檢測腸炎沙門氏菌的方法，該方法包括在足于使存在于所述的樣品中的腸炎沙門氏菌抗體與所述的片段之間形成免疫復合物的條件下，將所述的生物學樣品與腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的抗原性片段或腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段接觸，和檢測所述的復合物的形成；其中所述的片段特異性地識別存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的樣品包括血清或蛋黃。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的樣品與腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的片段接觸。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的片段是以融合多肽而提供，其中將另一個多肽融合到所述的片段。
5.根據權利要求3所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO2的21-165位氨基酸亞片段，其抗原部分，或對應于SEQ IDNO2的21-165位氨基酸亞片段并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
6.根據權利要求3所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO2的38-165位氨基酸，或其抗原部分，或對應于SEQ ID NO2的38-165位氨基酸并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述的樣品與腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的片段接觸。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述的片段是以融合多肽而提供，其中將另一個多肽融合到所述的片段。
9.根據權利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO5的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
10.根據權利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO6的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
11.根據權利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO7的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
12.根據權利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO8的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
13.根據權利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO9的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
14.根據權利要求1所述的方法，其中所述的片段用可檢測的標記物進行標記。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述的標記物包括熒光化合物，放射性元素，能夠產生與可檢測化合物反應的酶或金。
16.根據權利要求1所述的方法，其中所述的樣品已經與可檢測的標記物接觸，該標記物與樣品中存在的抗腸炎沙門氏菌抗體結合。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述的標記物包括熒光化合物，放射性元素，能夠產生與可檢測化合物反應的酶或金。
18.分離的沙門氏菌傘毛蛋白的片段，該片段基本上由SEQ IDNO3的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
19.分離的沙門氏菌鞭毛蛋白的片段，該片段基本上由SEQ IDNO6的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
20.分離的沙門氏菌鞭毛蛋白的片段，該片段基本上由SEQ IDNO7的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
21.分離的沙門氏菌鞭毛蛋白的片段，該片段基本上由SEQ IDNO8的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
22.分離的沙門氏菌鞭毛蛋白的片段，該片段基本上由SEQ IDNO9的氨基酸序列，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
23.一種試劑盒，包括腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白或鞭毛蛋白的片段，所述片段特異性地識別在懷疑感染了腸炎沙門氏菌的家禽獲得的生物學樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌抗體與其他沙門氏菌抗體區分開。
24.一種試劑盒，包括腸炎沙門氏菌傘毛蛋白片段和腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的片段，每個片段均特異性地識別在懷疑感染了腸炎沙門氏菌的家禽獲得的生物學樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌抗體與其他沙門氏菌抗體區分開。
25.根據權利要求24所述的試劑盒，進一步包括可檢測的標記物。
26.在從家禽獲得的生物學樣品中檢測腸炎沙門氏菌的方法，該方法包括在足于使存在于所述的樣品中的腸炎沙門氏菌抗體與所述的片段之一或者兩者之間形成免疫復合物的條件下，將所述的生物學樣品與腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的抗原性片段和腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段接觸，和檢測這樣的一個或多個復合物的形成；其中每個所述的片段特異性地識別存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開。
27.在從家禽獲得的生物學樣品中檢測腸炎沙門氏菌的方法，該方法包括在足于使存在于所述的樣品中的腸炎沙門氏菌抗體與所述的片段之間形成免疫復合物的條件下，將所述的生物學樣品的第一部分與腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的抗原性片段接觸，和檢測這樣的一個復合物的形成；其中所述的片段特異性地識別存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開；和在足于使存在于所述的樣品中的腸炎沙門氏菌抗體與所述的片段之間形成免疫復合物的條件下，將所述的生物學樣品的第二部分與腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段接觸，和檢測這樣的一個復合物的形成；其中所述的片段特異性地識別存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開。
28.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述的樣品包括血清或蛋黃。
29.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述的片段是以融合多肽而提供，其中將另一個多肽融合到所述的片段。
30.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述的腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白片段基本上由SEQ ID NO2的121-165位氨基酸亞片段，其抗原部分，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
31.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述的腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的片段基本上由SEQ ID NO3的氨基酸序列，其抗原片段，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
32.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述的腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的片段基本上由SEQ ID NO5的氨基酸序列，其抗原片段，或對應于所述的序列并且包含在所述序列中至少一個氨基酸的保守氨基酸取代的序列組成。
33.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述的片段用可檢測的標記物進行標記。
34.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述的標記物包括熒光化合物，放射性元素，能夠產生與可檢測化合物反應的酶或金。
全文摘要
在家禽和其蛋中檢測腸炎沙門氏菌的方法,包括將從懷疑含有腸炎沙門氏菌的家禽獲得的生物學樣品與腸炎沙門氏菌的傘毛蛋白的片段或腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白的片段接觸,所述的片段特異性地識別存在于樣品中的腸炎沙門氏菌抗體并且將腸炎沙門氏菌與其他沙門氏菌區分開。
文檔編號C07K14/255GK1361828SQ99816757
公開日2002年7月31日 申請日期1999年6月22日 優先權日1999年6月22日
發明者況慧星, 劉偉, 淑淼·沙倫·劉, 群映·希爾達·羅 申請人:分子農業生物學院