專利名稱：新穎的核受體配體的制作方法
技術領域：
本發明涉及類視色素X受體的配體和用于治療和/或預防疾病的藥物組合物，這些疾病通過某種遺傳信息的類視色素(retinoid)X受體配體(RXRL)-依賴性轉錄調節得以緩和。
背景技術：
利用根據本發明的藥物組合物加以治療和/或預防的疾病牽涉與生活方式有關的疾病。從治療與生活方式有關的疾病的觀點來看，對研制用于治療各種血管損害的藥物存在迫切需要，這些損害是引起與生活方式有關的疾病發作的原因。在存在血管損害時，普遍出現缺血性心臟病，也稱為冠脈硬化。據認為，世界上全部死亡人數的約百分之五十可歸因于該疾病。缺血性心臟病在大多數發達國家是死亡的主要原因，在日本是第二大死因。另外，據估計，缺血性心臟病的發生率在發展中國家也將迅速上升。缺血性心臟病的主要原因似乎包括遺傳因素、飲食習慣、應激反應、糖尿病和高血壓。已知缺血性心臟病與包括飲食在內的生活方式密切相關。高脂血癥和高胰島素血癥是由高熱量飲食的過量攝入所誘發的，二者促進在膽甾醇中富含的低密度脂蛋白在動脈壁上的沉積。所沉積的低密度脂蛋白的變性引起動脈壁損傷；白細胞與動脈壁中的損傷反應，浸潤之，以修復損害，導致慢性炎癥。因此，對動脈硬化的機理理解如下響應動脈壁的損傷，白細胞試圖修復損傷，引起過分的炎癥，后者具有增厚動脈壁的作用，導致硬化性損害。
已知用于預防缺血性心臟病的藥物的典型實例是羥甲基戊二酰-輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑。這些HMG-CoA還原酶抑制劑抑制甲羥戊酸的生物合成，所述甲羥戊酸的生物合成在膽甾醇的生物合成中是速率決定性步驟，該HMG-CoA還原酶抑制劑減少肝內合成的膽甾醇的量，因此降低低密度脂蛋白中的膽甾醇含量，低密度脂蛋白在肝內合成，并被釋放到血清中。也就是說，這些藥物的主要功能在于抑制膽甾醇的生物合成，降低血清中的膽甾醇含量，從而減少低密度脂蛋白從血清中結合到動脈壁上，因濃度而異。即，這些藥物僅發揮間接的和預防性作用。這些HMG-CoA還原酶抑制劑對與慢性炎癥有關的硬化性損害不表現作用，有巨噬細胞和淋巴細胞參與的慢性炎癥增厚動脈壁。因此，對治愈動脈的慢性炎癥來說不可能達到任何直接治療效果。動脈硬化的理想藥物和/或預防性治療是這樣的藥物，它顯示降低血清膽甾醇水平的作用，與此同時，對由膽甾醇在動脈壁上的沉積所誘發的慢性炎癥顯示治療和/或預防作用。如果存在這樣的藥物，那么預期它將充當缺血性心臟病的理想藥物和/或預防性治療。
與冠狀動脈相似，腦動脈也經常發生損害。當腦血管損害開始后，誘發諸如腦內出血或腦梗塞等腦血管損害。一旦發生腦血管損害，盡管可以避免死亡，但經常導致嚴重的后果，例如運動機能紊亂或智力機能紊亂。在人口老齡化的社會，臥床不起者或老年性癡呆患者的增加引發嚴重的社會問題，因此從減輕醫療費用的社會負擔觀點來看，也迫切需要防止這些問題。在日本，由腦血管性癡呆(也就是由腦血管損害引起的腦的部分變性和/或壞死)導致的癡呆患者人數幾乎達到癡呆患者總數的50％。
與冠狀動脈不同，腦動脈表面覆蓋有內皮細胞，它們彼此緊密重疊在接觸表面上。這種覆蓋的狀態被稱為緊密接合。在腦動脈的內皮中，內皮細胞緊密地排列，沒有任何空隙。因此，低密度脂蛋白不象在心臟中那樣結合到動脈壁中。換句話說，膽甾醇不會在腦動脈中誘發動脈硬化。不過，當高血壓引起動脈擴大并且導致腦動脈損傷時，血漿組分能夠穿透動脈壁。響應這種損傷，白細胞浸潤動脈壁，與心臟中冠狀動脈的情況相同，修復反應過度。其結果是，腦動脈壁增厚，由此導致血液循環機能紊亂；或者作為慢性炎癥的結果，動脈壁變脆，不能經受血壓，由此形成動脈瘤。當動脈瘤破裂時，引起出血，也就是腦中風。因此可以看到，與冠狀動脈硬化相似，響應于修復動脈中的小傷口，白細胞浸潤誘發慢性炎癥，引起腦血管損害。
為了預防腦血管損害，已經專門采用降壓藥。這些降壓藥的作用在于降低血壓，保護血管免受過高的壓力，從而預防血管損傷。換句話說，采用降壓藥作為預防性治療，以避免腦血管(自然)修復的消極影響。在日本，有一類腦血管性癡呆藥物被稱為腦血管舒張藥，并且已經有采用腦血管舒張藥的實踐，所述血管舒張藥例如艾地苯醌、鹽酸二苯美侖、鹽酸茚氯嗪、尼麥角林和丙戊茶堿。不過，臨床再評價試驗已經闡明，這些藥物在對腦血管損害消極后果的治療作用上與安慰劑沒有顯著差別。因此，這些藥物不再被指示用于腦血管損害消極后果的治療。因此，可以得出結論，目前不存在腦血管損害消極后果的藥物。如果有的話，具有降壓作用以及對腦動脈慢性炎癥具有治療作用的藥物預期將充當腦血管損害的理想藥物。
上文已經揭示，諸如動脈硬化和動脈瘤等血管損害是由動脈損傷的修復所誘發的。除了諸如變性低密度脂蛋白等有害變性劑的化學刺激或高血壓的物理刺激以外，還已知在下列情況下動脈硬化是由動脈壁的損傷引起的向狹窄的動脈中插入氣囊或支架以擴大之，或者宿主T淋巴細胞經受對抗同種抗原的排斥反應，該同種抗原存在于被移植器官的動脈中。
作為引起動脈硬化的物理因素實例，可以引用的是向冠狀動脈的狹窄部分插入氣囊或支架以擴大變窄的部分(也就是經皮血管成形術)。由于它的方便和即時效果，自1996年以來，每年世界進行1,000,000例這種用物理方法擴大冠狀動脈的狹窄內腔的治療。由于通過施加物理力立即擴大動脈狹窄部分的內腔，動脈受到損傷，結果是響應這種損傷的白細胞浸潤過度修復反應的部位。已知在用氣囊導管擴大的情況下，被擴大部分的動脈壁增厚在6個月內在約40％患者中產生，而在用支架擴大的情況下，重構在6個月內在20至40％患者中產生。在重構的情況下，再一次進行經皮血管成形術或者進行冠狀動脈旁路術對挽救生命來說是必要的。也就是說，盡管經皮血管成形術在迅速擴大動脈內腔上是非常有效的，不過迄今尚未找到預防由動脈內腔擴大引起血管損傷所致動脈硬化的適當手段。
與器官移植有關的動脈硬化是由免疫學機理導致的動脈硬化之典型。最近，已經開發了T淋巴細胞特異性免疫抑制劑，例如環孢菌素和他克莫司(tacrolimus)，因此幾乎可以完全抑制被移植器官在移植一年內的急性排斥。不過在心、肝、腎或心肺移植中，5年內在約60％的病例中被移植的器官保持接受。相反，在約40％的病例中發生稱之為慢性排斥的現象。這種現象區別于在移植后一年內發生的急性排斥。盡管“慢性排斥”的名稱表示被移植的器官已經在免疫學上被排斥了，實際上它描述的是這樣一種情況，作為由動脈硬化引起的循環機能紊亂的結果，發生被移植器官的壞死和減少。慢性排斥是由損傷誘發的，這種損傷是作為被移植器官動脈內同種抗原的識別之后由宿主淋巴細胞的免疫攻擊的結果而發生的。然后，宿主白細胞響應由免疫攻擊導致的損傷，發生反應以修復損傷，從而誘發動脈硬化。已經闡明了慢性排斥與最初急性排斥的強度相關。也就是說，如果急性排斥強，那么作為被移植器官動脈受到更嚴重的免疫損傷的結果，隨后被移植器官在5年內喪失的風險也高。其原因是動脈硬化可能是由過度的修復反應誘發的。如果能夠開發一種調節動脈內過度慢性炎癥的手段，那么在器官移植的情況下可以使慢性排斥減半。因此，已經闡述了動脈硬化的發生背景。
根據本發明的藥物組合物目的在于治療I型糖尿病和II型糖尿病，它們是典型的代謝疾病。II型糖尿病是與生活方式有關的疾病，與肥胖的關系密切，后者進而取決于飲食習慣和遺傳因素。相比之下，I型糖尿病是這樣的疾病，出現于可利用的胰島素總量缺乏之時，發生于產生胰島素的β細胞被對抗朗格罕氏胰島β細胞的自體免疫反應破壞之時。因此，需要規律的胰島素注射給藥，以確保該疾病患者的存活。盡管上述這些疾病在病因上是彼此不同的，糖尿病并發癥是兩種類型共有的，其出現于疾病已經長時間存在之時。在治療由外周胰島素抗性引起的II型糖尿病時，飲食療法和鍛煉療法是主要的方式，藥物治療僅用作附屬手段。在藥物治療中，利用磺酰脲類藥物加速胰島素從朗格罕氏胰島分泌，并采用雙胍類藥物促進外周組織內的葡萄糖利用。不過，還沒有藥物能夠活化外周胰島素抗性，它是疾病發作的原因。最近開發的噻唑烷二酮二烯(TZD)化合物作為具有活化外周胰島素抗性的藥物已經引起人們的注意。
在核內已經發現幾十種受體，總稱為核受體總家系，已知它們是脂溶性激素和維生素的受體。在研究合成有機TZD化合物的機理功能的過程中，已經確定了如下事實(1)這些化合物的靶組織是脂肪細胞組織；(2)它們是特異性活化PPARγ的激動劑，后者是核受體總科的成員；和(3)它們在細胞培養水平下分化某些已經被調理的成纖維細胞為脂肪細胞。被TZD活化后，PPARγ與同為核受體的類視色素X受體(RXR)一起形成二聚體(雜二聚體)，與染色體的特異性位點(激素識別位點)結合，從而調節一定基因的轉錄。基于細胞與組織水平下的實驗，已經證實這種雜二聚體的轉錄調節有助于外周胰島素敏感性的增強。也就是說，TZD以劑量-依賴性方式活化脂肪細胞組織內的PPARγ，因此改善糖尿病中的代謝機能紊亂。由于已知沒有作用于基因并且調節基因信號表達的藥物，因此預期TZD會受到如此高度評價。
由于各種配體(例如脂肪酸、前列腺素、非甾體止痛/抗炎劑)都與PPARγ受體結合，因此TZD對PPARγ受體的特異性必然不高。由于現有的TZD化合物具有同時活化PPARα、因此增殖哺乳動物肝細胞過氧化物酶體、從而導致肝肥大的特有功能，因此懷疑這些TZD化合物可能與肝病有關。其中，曲格列酮(troglitazone)是第一次得到實際應用的TZD化合物，在正常劑量下導致約2％患者患上肝病，在極端情況下可能導致死亡。因此，從安全性的觀點來看，在使用這樣的化合物時需要多加注意。只要PPARγ激動劑廣泛活化外周胰島素抗性，這些激動劑必須被認為不僅可用于改善糖尿病中的代謝機能紊亂，而且可用于治療和/或預防糖尿病并發癥。不過，在TZD化合物的動物實驗結果和臨床數據的基礎上，不能得出這樣的結論，胰島素抗性綜合征和糖尿病并發癥的癥狀得以顯著改善。因此，考慮功能特異性、安全性和有用性，仍然存在TZD化合物改進的空間。
另一方面，受到關注的是與PPARγ一起形成雜二聚體的RXR配體對II型糖尿病的代謝機能紊亂發揮什么作用。這是因為PPARγ與RXR一起形成雜二聚體，因此調節涉及糖尿病發作的基因信號的表達。Ligand，USA的研究人員報道了提出解決該問題的新方向的第一項研究(《自然》(Nature)386407-410，1997)。根據他們的報道，作為前髓細胞性白血病和卡波濟氏內瘤藥物而處于研制階段的類視色素衍生物LG100268和LGD1069在細胞培養和動物實驗中顯示如下作用(1)這些衍生物同RXR配體一樣與PPARγ形成雜二聚體，因此調節基因轉錄；(2)當對遺傳性肥胖的糖尿病小鼠ob/ob與db/db口服給藥時，它們增強胰島素的敏感性，徹底降低血糖水平、血清中性脂肪水平和血清胰島素水平。研究人員進一步報道，類視色素衍生物與TZD化合物的聯合給藥可以達到改善代謝的顯著效果，各自的劑量小到單用不顯示藥物作用的程度，因此說明RXR的配體和PPARγ的配體將顯示體內協同作用。
為了加強全反式視黃酸(ATRA)的作用，減輕副作用，合成了研究人員所報道的類視色素衍生物。據說這些衍生物有效對抗皮膚癌，例如卡波濟氏肉瘤和前髓細胞性白血病。也就是說，這些衍生物還與ATRA受體(RAR)結合，發揮類視色素的活性，因此功能的特異性差。另外，這些類視色素衍生物具有明顯為ATRA所固有的毒性，使它們不可用作糖尿病的長期藥物。RXR-特異性配體則沒有這些問題，安全性高，發揮相當可觀的加強胰島素敏感性的作用，有指望作為糖尿病及其并發癥的藥物。
已知PPARγ受體不僅在脂肪細胞組織內被大量表達，后者是II型糖尿病的治療目標，而且在脾、腸道和腎上腺內也被大量表達。因此，目前的研究是向確定在這些器官內表達的PPARγ的作用發展。其中，最近已經發表了兩項值得注意的報道，內容關于在淋巴樣細胞內表達的PPARγ的角色(M.Ricote等，過氧物酶體增殖物-活化的受體-g是巨噬細胞活化作用的負調節器(The peroxisome proliferator-activated receptor-g is a negative regulator ofmacrophage activation.)《自然》39179-82，1998；和C.Jiang，A.T.Tiang和B.Seed，PPARγ激動劑抑制單核細胞炎性細胞因子的產生(PPARγagonistsinhibit production of monocyte inflammatory cytokines.)《自然》39182-86，1998)。這些研究集中于在活化巨噬細胞內表達的PPARγ觸發慢性炎癥的誘導作用。當巨噬細胞浸潤炎性部位并且經受活化時，炎性細胞因子強烈地合成。不過，向活化的巨噬細胞培養物中加入作為PPARγ的配體的非甾體止痛/抗炎劑能夠劑量-依賴性地抑制涉及該慢性炎癥的基因的轉錄。還已經闡明了PPARγ配體與轉錄促進因子AP-1、STAT和NF-kB部分地競爭，因此調節炎性細胞因子基因的表達。也就是說，諸如非甾體止痛/抗炎劑等PPARγ配體減少與巨噬細胞的活化作用有關的已被旺盛轉錄的炎性細胞因子信使RNA(IL-1β、TNFα、IL-6等)的產生，進而調節這些炎性細胞因子的產生。不幸的是，主要作用于脂肪細胞的現有TZD化合物簡直不調節活化的巨噬細胞產生炎性細胞因子。因此，在現階段不可能利用這些TZD化合物治療慢性炎癥。不過，有人已經提出PPARγ配體調節炎性細胞因子可能有助于慢性炎癥的治療，例如動脈硬化、糖尿病并發癥和類風濕性關節炎。不過，迄今關于RXR配體還沒有進行過研究，它也許能夠與PPARγ一起形成雜二聚體，從而調節涉及慢性炎癥發作的基因信號的表達。
據認為，非甾體止痛/抗炎劑的機理功能在于抑制前列腺素的產生，后者導致炎癥部位的疼痛和腫脹。不過，上述報道的作者提出，編碼炎性細胞因子的基因的轉錄抑制也涉及機理功能以及前列腺素生物合成的抑制作用。眾所周知，非甾體止痛/抗炎劑有效對抗類風濕性關節炎。類似于非甾體止痛/抗炎劑而經常用于治療慢性炎癥的糖皮質激素對大鼠佐劑性關節炎發揮治療和/或預防作用，后者是動脈硬化和類風濕性關節炎的實驗模型。不過，這些藥物不能長時間連續給藥，因為它們抑制消化道粘膜內前列腺素的生物合成，導致消化性潰瘍的較高發生率。PPARγ配體抑制蓄積在炎癥部位的活化巨噬細胞產生炎性細胞因子，但不抑制前列腺素的生物合成，如果可能的話，將無疑大大有助于慢性炎性狀態的治療，例如動脈硬化、糖尿病并發癥和類風濕性關節炎。不過在現階段，這樣一種假定仍然是有待證實的，因此它的有用性需要在實驗和臨床上加以確認。作為PPARr配體而合成的TZD化合物僅發揮微弱的抑制炎性細胞因子產生的作用，因此幾乎沒有實用價值。盡管TZD強烈地作用于白脂肪組織內的PPARγ，它對活化的巨噬細胞也僅顯示微弱的作用。因此，似乎現有的TZD化合物幾乎不能抑制炎性細胞因子的產生。而且，RXR配體與PPARγ形成雜二聚體對活化的巨噬細胞發揮什么作用，是完全未知的。也不清楚PPARγ與RXR在巨噬細胞內是否象在脂肪細胞組織內那樣形成雜二聚體，是否特異性地調節基因轉錄。如上所述，已知非甾體止痛/抗炎劑充當PPARγ的配體，在細胞培養水平下抑制引起慢性炎癥的細胞因子的產生。因此，RXR配體對產生炎性細胞因子的作用也已引起普遍關注。有計劃將對PPARγ和RXR的配體作為對抗慢性炎癥的抗炎劑進行廣泛研究。
為了治療慢性炎癥，例如類風濕性關節炎和自體免疫疾病，在實踐中已經采用一般用于治療急性炎癥的非甾體止痛/抗炎劑或糖皮質激素。也就是可以說迄今還沒有慢性炎癥的特效藥。非甾體止痛/抗炎劑面臨一個問題，長期使用經常誘發對消化系統的不良副作用，例如潰瘍，因為這些藥物抑制前列腺素的生物合成。另一方面，糖皮質激素具有大量副作用，包括由免疫抑制引起感染性疾病的頻繁發作、誘發代謝機能紊亂(例如糖尿病)和回縮現象，也就是說，與藥物給藥開始之前的狀態相比，藥物給藥的中止引發所治療狀態的惡化。因此，不能說慢性炎癥的現有療法顯著提高了患者的生命質量(QOL)。除了藥物療法的這些問題以外，由微脈管炎癥引起的糖尿病并發癥已經受到了關注。由于糖尿病并發癥屬于慢性炎癥的范疇，通過給藥發揮特異性改善慢性炎癥的作用的藥物很可能能夠預防和/或治療這些并發癥。為了治療慢性炎性狀態，例如類風濕性關節炎、動脈硬化、糖尿病性微血管病、結節性動脈外膜炎和動脈瘤，有必要開發能夠治療慢性炎癥而沒有作為頻繁發生不良副作用的結果的QOL的任何惡化的藥物。
在絕經后的婦女中，經常出現鈣代謝機能紊亂，骨質疏松癥是這群人中的嚴重問題。骨質疏松癥在形態學上的特征是小梁減少、Harbor管增大和骨髓腔增大，而密質骨變薄，骨沒有任何形態學改變。這些病理狀態涉及骨吸收與骨添加之間的關系紊亂。在絕經后婦女中觀察到的osteopolyporosis是典型的例子。一旦患有骨質疏松癥，由于骨強度顯著降低，患者即使受到輕微的壓迫也有骨折的傾向。治療骨質疏松癥的方法包括雌性激素、活性維生素D3或亞磷酸氫鹽藥物的口服給藥和降鈣素的注射。優選用于預防和/或治療骨質疏松癥的措施將是加強內源性活性維生素D3的效能。不過，由于缺乏可行的方法，直到現在還沒有開始關于此觀點的研究。
發明概要本發明是基于新穎的發現而作出，即，殼二孢氯素及其同系物(各自具有類萜側鏈(優選地攜帶約20個碳原子)連接在甲基苔黑醛(orcylaldehyde)的3-位上的結構)是類視色素X受體的配體，發明人以前已經報道過它是由真菌產生的脂溶性抗生素。確切地說，本發明依賴于意外的發現，即，由于具有醛基，殼二孢氯素及其同系物體外與血清蛋白的氨基反應生成席夫堿，從而不顯示類視色素的副作用。
殼二孢氯素及其同系物是類視色素X受體的配體，可用于治療和/或預防通過類視色素X受體配體-依賴性基因信號轉錄調節作用得以減輕的疾病或狀態(例如，由胰島素抗性表達所導致的疾病、高血壓、腦血管病、類風濕性關節炎、自體免疫疾病、鈣代謝機能紊亂、糖尿病并發癥、經皮經腔冠狀血管成形術繼發的動脈再狹窄、器官移植繼發的動脈硬化)。這些化合物還抑制朗格罕氏胰島β細胞變性和/或壞死，可用于使這些細胞維持胰島素的產生能力。因此，本發明提供含有這些化合物的藥物組合物、利用這些化合物的治療和/或預防方法、和這些化合物在治療和/或預防上述疾病中的用途。
附圖的簡要說明

圖1闡明根據本發明的化合物與血清蛋白之間生成席夫堿的反應。
圖2顯示口服化合物-14達40周的遺傳性肥胖的糖尿病小鼠C57BL/ksjdb/db的體重、血糖水平、血液胰島素水平和尿糖。
圖3顯示用高脂飲食飼養的白兔主動脈的動脈硬化，裸眼可見。
圖4顯示化合物-6在I期臨床試驗中引起禁食血糖水平的變化。
圖5顯示化合物-6在I期臨床試驗中降低血清總膽甾醇水平。
圖6顯示化合物-6在I期臨床試驗中對臨界性高血壓患者的降壓作用。
圖7顯示化合物-6在I期臨床試驗中對高血壓患者的降壓作用。
圖8顯示化合物-6在II期臨床試驗中隨時間推移改善口渴。
圖9顯示對大鼠口服給藥的化合物-1在血液中的濃度。
圖10顯示加入到牛血清中的根據本發明的游離形式的化合物減少，其中實心圓、空心圓和正方形分別代表化合物-14、5和6。
發明的公開發明人已經進行了研究，以找到治療和/或預防上述慢性疾病的有效手段，而這是不能用常規技術加以解決的，結果完成了本發明。
本發明涉及類視色素X受體的配體，選自殼二孢氯素及其同系物。本發明進一步涉及類視色素X受體配體(RXRL)，選自由殼二孢氯素及其同系物(也就是由絲狀真菌產生的氯柱枝菌素、4’-羥基-5’-氫殼二孢氯素、4’-乙酰氧基-5’-氫殼二孢氯素、二氫殼二孢氯素和氯尼菌素(chlomectin))、甲基苔黑醛部分的2-和/或4-位羥基的氫已被取代的類似物與衍生物組成的組。本發明進一步涉及藥物組合物，該組合物用于治療和/或預防通過基因信號轉錄的類視色素X受體配體-依賴性調節作用得以減輕的疾病或狀態，包含類視色素X受體配體以及藥學上可接受的添加劑。
I、殼二孢氯素及其同系物此處用在“殼二孢氯素及其同系物”中的術語“同系物”表示具有類似于殼二孢氯素結構的化合物，其中類萜側鏈連接在甲基苔黑醛的3-位上，該化合物能夠充當類視色素X受體的配體。殼二孢氯素及其同系物(在下文中有時稱之為本發明化合物)的典型例子包括下列化合物式(1)
殼二孢氯素及其同系物和衍生物發明人已經利用X-射線衍射學將殼二孢氯素的絕對結構鑒定為3-[5-[1(R)，2(S)，6(S)-三甲基-3-氧代環己基]-3-甲基-2，4-戊二烯基]-2，4-二羥基-5-氯-6-甲基苯甲醛。
式(1)化合物包括如下物質。
表1殼二孢氯素及其同系物和衍生物# R1R2R3R4R51-CHO H HCl H 殼二孢氯素(ASC)2-CHO H HCl -OAc LL-Z1272ξ3-CHO H HBr H 溴ASC4-CHO H HH H 脫氯ASC5-CHO H CH3CO- Cl H 乙酰ASC6-CHO H -CH3Cl H 4-O-甲基ASC7-CHO-CH3-CH3Cl H 2，4-二甲基ASC8-CHOCH3CO- -CH3Cl H 4-O-甲基-2-O-乙酰ASC9-CHO -CH3CH3CO- Cl H 2-O-甲基-4-O-乙酰ASC10-CHO -CH3HCl H 2-O-甲基ASC11-CHO H CH3CH2-Cl H 4-O-乙基ASC12-CHO H 烯丙基Cl H 4-O-烯丙基ASC13-CHO H 丁基 Cl H 4-O-丁基ASC14-CHO H -CH2COOHCl H 4-O-羧甲基ASC15-17 -CHO H -(CH2)nCOOH Cl H n＝2-418-CHO H -CH2COOCH3Cl H *19-CHO H 煙酰基Cl H 4-O-煙酰ASC20-CHO H 苯甲酰基 Cl H 4-O-苯甲酰ASC21-CHO H 異煙酰基 Cl H 4-O-異煙酰ASC式(2) 二氫殼二孢氯素及其同系物和衍生物式(2)化合物包括如下物質。表2二氫殼二孢氯素及其同系物和衍生物# R1R222 Cl H 氫ASC23 H H LL-Z-1272ε24 Cl -OH 4’-羥基-4’，5’-二氫ASC25 Cl -OAc氯尼菌素式(3) 氯柱枝菌素(化合物#26)式(4) 化合物#276-氯-5-羥基-7-甲基-2-[2-(1，2，6-三甲基-3-氧代環己基)乙烯基]-8-苯并二氫吡喃甲醛式(5) 化合物#288-氯-5-羥基-2，7-二甲基-2-[2-(1，2，6-三甲基-3-氧代環己基)乙烯基]-6-苯并二氫吡喃甲醛式(6) 殼二孢氯素類似物和衍生物(1)式(6)化合物包括如下物質。表3殼二孢氯素類似物和衍生物(1)# R1R229 Cl H30 Cl 烷基*31 Cl 酰基**32 H H33 H 烷基*34 H 酰基***烷基甲基**酰基乙酰基式(7) 殼二孢氯素類似物和衍生物(2)式(7)化合物包括如下物質。
表4殼二孢氯素類似物和衍生物(2)# R1R235 Cl H36 Cl 烷基*37 Cl 酰基**38 HH39 H 烷基*40 H 酰基***烷基甲基**酰基乙酰基這些化合物的化學結構特征在于類萜側鏈連接在甲基苔黑醛部分上，形成類似于類視色素的結構，如下所示。 殼二孢氯素 全反式視黃酸可以得到作為通過絲狀真菌的發酵作用而產生的代謝物的本發明的化合物或經過有機合成修飾的其衍生物。
自20世紀60年代中期以來，發明人已經篩選了脂溶性抗病毒抗生素，方法是用動物病毒感染從孵化雞胚獲得的初生成纖維細胞培養物，并使用被測試的化合物抑制所形成噬斑的形成的活性作為指征。在該方法期間，發現了新穎的名為殼二孢氯素的抗生素，是一種由真菌蠶豆殼二孢(Ascochyta viciae)產生的脂溶性抗生素(《抗生素雜志》(J.Antibiotics)21539-544，1968)。X-射線衍射學測定殼二孢氯素的化學結構顯示，它壓縮了甲基苔黑醛部分和與之連接的由15個碳原子組成的類異戊二烯鏈(《日本化學會公報》(Bull.Chem.Soc.Japan)442652-2660，1971)。迄今已有報道，殼二孢氯素及其類似物也由從除蠶豆殼二孢以外的真菌產生的，例如Nectriacoccinea、鐮孢屬(Fusarium sp.)、Cylindocarpon lucidium和輪枝孢屬(Verticillium sp.)。氯柱枝菌素、4’-羥基-5’-氫殼二孢氯素、4’-乙酰氧基-5’-氫殼二孢氯素、二氫殼二孢氯素等類似物是在產生殼二孢氯素的發酵中得到的副產物。
發明人已經進一步發現，取代這些化合物中的甲基苔黑醛部分的2-和/或4-位羥基中的氫所得化合物降低了殼二孢氯素對食欲的強抑制作用。這些衍生物相當于實施本發明的優選方式。優選的是，甲基苔黑醛部分的2-和/或4-位羥基是烷基化和/或酰基化的。這里所用的術語“烷基化”表示羥基的氫用烷基取代，另有注解除外。術語烷基表示直鏈、環狀或支鏈的飽和一價烴基。烷基可以具有任意數量的碳原子，只要所需的取代作用能夠實現，并且化合物的固有功能不受嚴重損害。優選的是，烷基具有1至10個、更優選為1至5個碳原子。這里所用的術語“酰基化”表示羥基的氫被RCO-取代，另有注解除外。R代表脂族或芳族烴基。R可以具有任意數量的碳原子，只要所需的取代作用能夠實現，并且化合物的固有功能不受嚴重損害。優選的是，R具有1至10個、更優選為1至10個碳原子。
當殼二孢氯素與碳酸鉀和烷基碘化合物在加熱下、在有機溶劑中反應時，例如在烷基碘過量的情況下，4-位羥基首先被烷基化，然后2-位羥基也被烷基化。另一方面，在殼二孢氯素及其同系物的甲基苔黑醛部分中，僅有4-位羥基被選擇性地酰基化，而2-位羥基與醛的羰基形成分子內氫鍵，因此不被酰基化。也就是說，從4-O-乙酰基殼二孢氯素開始，使之與烷基碘在碳酸鉀的存在下反應，可以得到4-O-乙酰基-2-O-烷基殼二孢氯素。用苛性堿水解該產物，可以得到2-O-烷基殼二孢氯素。與殼二孢氯素相比，4-O-烷基殼二孢氯素和2-O-烷基殼二孢氯素都顯示更低的口服毒性，和改進的對RXR的結合選擇性。因此，這些衍生物是優異的配體，即使在低濃度下其也是有效的。
II、本發明化合物的功能和作用本發明的每種化合物都表現與類視色素X受體選擇性結合和調節基因信號轉錄的活性。也就是說，與本發明化合物鍵合的類視色素X受體與細胞內與各自配體鍵合的核受體形成二聚體，然后結合DNA上的激素應答單元(HRE)，從而調節特殊基因的轉錄。而且，本發明化合物使得按下文實施例所述方法易于測定調節基因信號轉錄的活性成為可能。本發明化合物結合RAR的能力與它們結合RXR的能力相比，非常有特色的是，有些化合物比9-順式視黃酸(9-CRA)對RXR顯示更高的特異性，9-CRA是一種天然的RXR配體。關于充當報告基因的蟲熒光素酶基因的表達，本發明化合物(即殼二孢氯素、4-O-甲基殼二孢氯素、2-O-甲基殼二孢氯素、4-O-乙酰基殼二孢氯素等)在5×10-7M至1×10-5M的濃度下顯示峰活性，盡管低于9-CRA的峰濃度(10-7M)。本發明化合物對RXR比對RAR顯示更高的選擇性。
表5本發明化合物對基因信號表達的增強載體化合物 濃度(M)RXRRARRXR/RAR全反式視黃酸10-737 46 0.889-順式視黃酸10-757 36 1.58化合物-1 10-661 30 2.03化合物-6 5×10-655 35 1.57化合物-102×10-558 40 1.45化合物-14 10-547 38 1.23化合物-264×10-763 33 1.91
每個數值表示加入相應化合物所引起的蟲熒光素酶活性增加的程度，其是以對照組的蟲熒光素酶活性為1來表達的。
下面，就本發明化合物對基因轉錄的調節作用怎樣涉及病理狀態作出闡述。本發明涉及新穎的藥物組合物，用于治療和/或預防外周胰島素抗性、出現在心動脈與腦動脈中的各種慢性炎癥、糖尿病并發癥固有的微血管病、關節與外周組織中的慢性炎癥、鈣代謝機能紊亂等。本發明化合物與靶細胞內的類視色素X受體結合，與其他充當類視色素X受體配偶體的受體一起形成雜二聚體，然后與染色體上的激素應答單元結合。當基因信號的轉錄受到這些雜二聚體結合的調節時，基因信號在靶細胞、組織和動物個體內的表達有所改變，因此抑制了參與病理發作的基因表達，從而改善病理狀態。RXR與各種核受體一起形成雜二聚體，因此調節基因信號的表達。其中，由RXR與PPARγ、LXR和VDR形成的雜二聚體是特別重要的，因為這些雜二聚體對特殊基因信號的表達的調節作用涉及改善各種病理狀態的效果。
表6包含RXR作為配偶體之一的核受體雜二聚體的作用

現在，將描述發明人的新發現。首先，在脂肪細胞內表達的PPARγ與RXR一起形成雜二聚體，抑制脂肪細胞-來源的細胞因子(主要是TNFα)的產生，從而恢復外周胰島素的敏感性。這種作用也取決于個體動物水平下的劑量。即使作為II型糖尿病模型的遺傳性肥胖的糖尿病小鼠(db/db小鼠)也幾乎不顯示血糖水平因胰島素的給藥而有任何降低，本發明化合物發揮減輕胰島素抗性的作用，因此大大改善代謝機能紊亂。與淋巴細胞內的RXR受體結合后，本發明化合物與也與配體結合的PPARγ受體一起形成雜二聚體，因此抑制導致慢性炎癥的炎性細胞因子的產生。結果，能夠抑制血管、關節和外周組織內的慢性炎癥。另一方面，由在肝細胞內表達的LXR與RXR形成的雜二聚體增強膽甾醇-7α羥基化酶基因在肝內的轉錄，因此加速膽甾醇氧化為膽汁酸，從而促進膽汁酸的排泄。本發明化合物所表現的降低人血清總膽甾醇水平的作用起源于促進膽汁酸排泄的功能。在成骨細胞內的VDR與RXR的雜二聚體使鈣代謝機能紊亂正常化，因此改善骨質疏松癥。
如上所討論的，根據本發明的藥物組合物目的在于治療和/或預防廣泛范圍的疾病，包括循環疾病(缺血性心臟病、以低密度脂蛋白增加為特征的高脂蛋白血癥、高血壓等)、代謝疾病(I型糖尿病、II型糖尿病等)、慢性炎癥(類風濕性關節炎等)、自體免疫疾病與誘發各種器官內腔的縮窄與梗阻(即動脈硬化)的動脈內的慢性炎癥、使動脈變脆的結節性動脈外膜炎、局部慢性炎癥(動脈瘤等)、經皮經腔冠狀血管成形術后動脈再狹窄、和糖尿病的并發癥，即慢性微血管炎癥(糖尿病性腎病、糖尿病性神經病、糖尿病性視網膜病等)。而且，本發明化合物可用于治療/預防以鈣代謝機能紊亂為特征的骨質疏松癥。為了治療和/或預防上述疾病，可以將本發明化合物對包括人在內的動物給藥。
下面，將描述證實殼二孢氯素及其衍生物充當RXR配體、從而對多種類型慢性炎癥發揮治療和/或預防作用的方法。殼二孢氯素及其衍生物在動物和臨床試驗中顯示各種生物學活性。由于這些生物學活性似乎彼此各不相關，因此形成其基礎的功能機理長期以來都是未知的。1985年發現糖皮質激素核受體，1990年發現RXR受體，這些發現給出有可能導致第一次披露殼二孢氯素及其衍生物的功能機理的方案。PPARγ是核受體總科的成員之一，它在脂肪細胞內被表達，并與配體結合。然后它與RXR一起形成雜二聚體，從而促進基因的轉錄，該基因促進前體細胞分化為脂肪細胞。已經闡明，這種雜二聚體對基因轉錄的調節作用導致外周胰島素敏感性的增強。從1982年至1985年，發明人報道了殼二孢氯素衍生物化合物-14增強遺傳性肥胖的糖尿病小鼠和正常小鼠胰島素的作用(T.Hosokawa等《農業與生物化學》(Agr.Biol.Chem.)342865-2869，1982；《糖尿病》(Diabetes)34267-274，1985)。六年后，據報道PPARγ配體之一曲格列酮對糖尿病動物發揮類似于本發明化合物的胰島素增強作用(T.Fujiwara等《糖尿病》371549-1558，1988)。基于這些化合物彼此相似的作用，發明人首先考慮它們可能具有相同的功能機理。
由于殼二孢氯素及其衍生物發揮各種不能被證實為可歸因于PPARγ配體的作用，顯然這些化合物不是PPARγ配體。因此，發明人假定本發明化合物有可能在核受體總科內充當雜二聚體的一種載體，因此也與PPARγ一起形成雜二聚體。從此觀點來看，他們已經證實殼二孢氯素及其衍生物在細胞培養物和動物實驗中都是RXR的配體，從而完成了本發明。通過用本發明化合物處理已被其中RXR基因載體和激素應答單元與報告基因配位結合的質粒轉染的動物細胞，濃度-依賴性地促進報告基因的轉錄，與9-順式視黃酸(9-cRA)的情況一樣，后者是天然的RXR配體。盡管本發明化合物從不誘導前體脂肪細胞分化為脂肪細胞，化合物與PPARγ配體的聯合使用也顯著促進向脂肪細胞的分化，并且濃度低至不顯示誘導分化的作用的程度。因此，還已經闡明RXR的配體與PPARγ的配體發揮協同作用。也就是說，已經清楚地發現本發明化合物與核受體總家系的其他成員體內一起形成雜二聚體，并調節以核受體作為配偶體的特殊基因的轉錄。
另一方面，發明人于1970年確認，殼二孢氯素對嚙齒動物，例如小鼠和大鼠口服給藥發揮減食欲作用以及降低血糖水平、血清脂質水平和血清胰島素水平的作用。當對麻醉大鼠和高血壓大鼠口服給藥時，殼二孢氯素顯示有力的降低血壓的作用。這些作用使殼二孢氯素適合作為胰島素抗性綜合征的藥物。不過在動物實驗中，減食欲作用類似于增強胰島素作用的作用，這使評價藥物作為胰島素增強劑的作用非常困難。因此，人們嘗試合成具有相對弱的減食欲作用的衍生物，通過修飾殼二孢氯素的分子結構合成了各種衍生物。結果已經發現，通過用各種取代基取代殼二孢氯素分子中連接在甲基苔黑醛的4-和/或2-位羥基上的氫原子，可以弱化減食欲作用。
當將其中芳族環的2-或4-位羥基已被低級烷基、酰基、羧甲基等取代的殼二孢氯素衍生物對實驗動物，例如正常小鼠、大鼠和Beagles口服給藥時，這些衍生物顯示降低血糖水平和血清總膽甾醇水平的作用。這些衍生物顯示加強正常嚙齒動物和病理糖尿病模型胰島素的作用。例如，這些衍生物之一的化合物-14與對照組相比，降低正常和糖尿病小鼠的血清胰島素水平，此外還降低血糖水平，促進葡萄糖從血液中排出(Hosokawa等《農業與生物化學》342865-2869，1982)。本發明化合物發揮顯著的改善遺傳性肥胖的糖尿病小鼠(db/db小鼠)代謝的作用。由于它們出于遺傳原因缺少leptin受體，leptin是由脂肪細胞組織在飽滿感下合成和釋放的減食欲蛋白，因此這樣的小鼠即使在飽滿感下也沒有食欲控制。結果，它們因過量進食而患上高胰島素血癥，外周胰島素敏感性大為降低。因此，這些db/db小鼠即使服用足以導致正常動物低血糖昏迷量的胰島素后也幾乎不顯示血糖水平降低，它們還顯示嚴重的肥胖、高胰島素血和高脂血。當對db/db小鼠口服給藥時，化合物-14減輕胰島素抗性，并顯著降低血糖水平、血清脂質水平和血清胰島素水平(T.Hosokawa等《糖尿病》第34卷267-274，1985)。發明人在環格列酮之前進行了一系列研究，該藥是最早的相當于吡格列酮前體的TZD。不過在這些研究中，本發明化合物僅在db/db小鼠的肥胖達到最大值之前的相對短時間內給藥。所以，結果可能不正確地表示本發明化合物對人的長期病理狀況的作用。
(保護朗格罕氏胰島β-細胞的作用)將本發明化合物對db/db小鼠口服給藥增強外周胰島素敏感性，改善代謝機能紊亂，這已經得到若干實驗結果的支持。不過，值得注意的是，本發明化合物在保持胰腺合成胰島素的功能上發揮長時間的作用，在糖尿病中該功能缺損。血清胰島素水平和對已經給藥化合物-14約1年的db/db小鼠胰腺的病理觀察清楚地指示出這種作用。化合物-14降低db/db小鼠的血糖水平至幾乎相當于正常小鼠的水平，抑制糖尿病特有的煩渴和多尿，并且戲劇性地降低尿糖至對照組的1/100或以下。而且，化合物-14在全部實驗階段改善尿蛋白。在對照小鼠中，當體重達到最大時(也就是出生后約20周)，胰β-細胞由于過度產生胰島素而耗盡，胰島素的產生能力顯著降低。出生后約40周，這些小鼠患有酮癥，血糖水平超過700mg/dl。也就是說，出現非胰島素依賴型糖尿病轉化為胰島素依賴型糖尿病，類似于人的II型糖尿病。即使在40周后體重減少至接近正常小鼠的水平，缺少leptin受體的db/db小鼠仍然過量進食，因缺乏胰島素而不能合成的食物能量，又從體內大量排出。在該實驗中，需要強調的是盡管化合物-14給藥組因過量進食而連續過度產生胰島素，胰β-細胞的功能仍然完整地持續了1年。由于化合物-6顯示相似的作用，使糖尿病胰β-細胞能夠持續其有效性的作用是本發明化合物的主要特征之一。
在這樣一種實驗中也觀察到了本發明化合物在保護朗格罕氏胰島β-細胞功能中的作用，其中將aloxan或鏈脲霉素對大鼠給藥，迅速誘發胰島素依賴型糖尿病。當對動物給藥時，糖尿病誘發劑，例如aloxan和鏈脲霉素選擇性地使朗格罕氏胰島β-細胞變性。以前認為這種作用將殺死朗格罕氏胰島β-細胞，繼而導致胰島素產生的終止，從而誘發胰島素依賴型糖尿病的發作。不過通過監測由糖尿病誘發劑所導致的胰島素依賴型糖尿病的發作過程，已經闡明這種過程更加復雜。也就是說，這些糖尿病誘發劑僅僅引發該過程，已被糖尿病誘發劑變性并且經歷炎癥的朗格罕氏胰島β-細胞是作為免疫過程的結果而被殺死的，免疫過程在給藥糖尿病誘發劑之后歷經1至2周完成。控制細胞免疫的T淋巴細胞把已被變性并且患有慢性炎癥的朗格罕氏胰島β-細胞識別為外來物質，試圖從免疫上消除和殺死這些細胞，從而誘發胰島素依賴型糖尿病的發作。因此，通過給藥環孢菌素能夠預防胰島素依賴型糖尿病的發作，這種藥物能夠抑制T淋巴細胞的功能，不僅在朗格罕氏胰島β-細胞的免疫破壞完成之前，甚至在糖尿病誘發劑的給藥之后。
本發明化合物不具有象環孢菌素那樣抑制T淋巴細胞功能的作用。當在朗格罕氏胰島β-細胞的完全破壞和胰島素依賴型糖尿病的發作之前口服給藥本發明化合物時，它們能夠干擾糖尿病的發作過程，大大減輕所導致的病理狀況。這種作用似乎從由本發明化合物所發揮的改善慢性炎癥的作用衍生而來。也就是說，巨噬細胞首先識別已被糖尿病誘發劑變性并被看作外來物質的朗格罕氏胰島β-細胞，并作為抗原提供給與朗格罕氏胰島β-細胞結合的淋巴細胞，從而消除這些細胞。在活化的巨噬細胞內，根據本發明的化合物形成由RXR和PPARγ組成的雜二聚體，因此延緩淋巴細胞消除變性朗格罕氏胰島β-細胞的過程，從而提供朗格罕氏胰島β-細胞的修復時間。在遺傳性肥胖的糖尿病小鼠中觀察到的胰島素產生功能的遺傳編程性減少和由糖尿病誘發劑迅速誘導的朗格罕氏胰島β-細胞的分裂具有一個共同點，在于朗格罕氏胰島β-細胞因慢性炎癥而經歷免疫自解體；盡管這些現象在進展的迅速程度上是彼此不同的。因此，有理由假定本發明化合物在兩種不同的病理模型中都對朗格罕氏胰島β-細胞表現出保護作用。產生胰島素的朗格罕氏胰島β-細胞是涉及糖尿病的主要細胞。這些對糖尿病動物朗格罕氏胰島β-細胞的保護作用是本發明化合物在治療糖尿病中的決定性作用。
(化學結構的相似性)有趣的是，殼二孢氯素具有類似于類視色素的化學結構。殼二孢氯素攜帶法呢醇側鏈，它比香葉草基香葉醇短一個異戊二烯單元，也就是類視色素前體。殼二孢氯素的末端環己酮環在結構上類似于類視色素的環己烯環。如發明人用X-射線衍射學測定的絕對結構所示，本發明化合物攜帶[1’(R)，2’(S)，6’(S)-三甲基-3’-羥基環己基]-3-甲基-2，4-戊二烯基側鏈、雙鍵之一被還原的3-甲基-2-戊烯基側鏈、環己酮環的羰基遷移至5-位的1’(R)，2’(S)，5’(S)-三甲基-5’-羥基環己基或[1’(R)，2’(S)，6’(S)-三甲基-3’-氧代環己烯基]基團作為與2，4-二羥基-5-氯苯甲醛的5-位連接的側鏈。此外，從環己基計數的甲基苔黑醛羰基位于與視黃酸末端羧酸根相同的位置。這些事實說明，殼二孢氯素的骨架在結構上類似于9-順式視黃酸，后者是RXR的內源性配體。因此，從分子結構觀點來看，殼二孢氯素及其衍生物也的確是RXR的配體。
本發明化合物顯著抑制用高膽甾醇飲食飼喂的白兔和日本鵪鶉動脈硬化，抑制將礦物皮質激素給藥并給以生理鹽水作為飲用水的大鼠腸系膜動脈內動脈瘤的形成。這些發現說明，本發明化合物對動脈慢性炎癥發揮治療和/或預防作用。另一方面，對大鼠佐劑性關節炎的作用說明，本發明化合物不僅對動脈內的慢性炎癥、而且對關節內的慢性炎癥都具有改善作用。而且，本發明化合物對臨床上由微血管內慢性炎癥誘發的糖尿病并發癥發揮顯著的治療作用。那么至于本發明化合物如何能夠對這些慢性炎癥發揮治療和/或預防作用，問題便出現了。在這點上，關于過氧物酶體增殖物-活化的受體PPARγ的研究提供了有用的說明。以前認為，PPARγ可能是這樣一種核受體，它存在于脂肪細胞組織內，可能調節基因信號的表達，并誘導前體細胞分化為脂肪細胞。目前已經闡明，PPARγ不僅在脂肪細胞組織內、而且在腸道、淋巴組織和腎上腺內都被大量表達。另外已經確定，似乎對PPARγ具有最高親合性的內源性配體15-脫氧-Δ12，14-前列腺素J2(15d-PGJ2)不僅存在于白脂肪細胞組織內，而且存在于淋巴細胞內，例如巨噬細胞。
巨噬細胞產生和釋放炎性細胞因子引發慢性炎癥，這便出現這樣一種情況，PPARγ與RXR的雜二聚體對炎性基因轉錄的調節作用發生機能障礙。事實上，已經證實作為RXR配體的本發明化合物在動物實驗中以劑量依賴性方式有效治療和/或預防慢性炎癥。在對糖尿病并發癥患者進行的臨床試驗中，這些化合物對慢性炎癥也顯示治療作用。本發明化合物對慢性炎癥的抗炎作用的發現相當于本專利的要點之一，其他要點是改善糖尿病代謝、保護朗格罕氏胰島β-細胞、促進肝內膽汁酸的合成和改善鈣代謝的作用。在循環疾病中，慢性炎癥出現在心臟冠狀動脈、腦動脈等內。在糖尿病并發癥中，它出現在外周神經、腎臟、視網膜等內。它在類風濕性關節炎中出現在關節內，在自體免疫疾病中出現在各種外周組織內。而且，慢性炎癥出現在被移植器官的動脈和利用氣囊或支架擴大的冠狀動脈內。由本發明化合物實現的炎性細胞因子產生的抑制作用是這些廣泛出現在器官和組織內的慢性炎癥的抑制作用共有的功能機理。
在核受體總科的數十種成員中，存在若干孤獨受體，它們的配體仍然是未知的。PPARγ與單獨的RXR一起形成雜二聚體，而RXR與除PPARγ以外的若干核受體一起形成雜二聚體。因此，今日生物學的焦點之一是RXR與除PPARγ以外的受體所形成的雜二聚體如何影響生物學功能。已經知道有些雜二聚體，例如RXR與甲狀腺激素受體的雜二聚體不影響甲狀腺激素的功能。正如本發明所公開的，肝孤獨受體(LXR)又稱膽甾醇傳感器，和活化的維生素D3受體(VDR)與RXR形成肯定影響基因轉錄的雜二聚體。這些雜二聚體如何調節基因信號表達和影響生物學功能，直到現在也還是完全未知的。也就是說，發明人第一次闡明了RXR與LXR或VDR的雜二聚體對生物學功能的作用。
(臨床作用)經常可以觀察到，即使在病理模型中經篩選為有效并且證實對人給藥安全的新化合物出現預期作用，研究和開發努力也會落空。不過，有些本發明化合物的功效和安全性不僅得到動物實驗、而且得到I期臨床試驗和II期臨床試驗的確認。也就是說，化合物-6的口服給藥降低II型糖尿病患者的血清總膽甾醇水平和血糖水平，顯著降低伴有高血壓或臨界性高血壓的糖尿病患者的血壓。因為它能夠顯著改善與糖尿病性腎病和神經病有關的癥狀，化合物-6可以說在慢性炎癥的情況下無疑能夠發揮抗炎作用，這種作用在動物試驗和臨床環境中都觀察到了。而且，化合物-6改善II型糖尿病的葡萄糖耐受性，從而增強外周胰島素敏感性。另一方面，化合物-6在以1mg/kg至16mg/kg的每日劑量范圍給藥時，不顯示主觀或客觀的副作用，在生物學血清檢查、血細胞檢查、尿檢查等中不呈現異常數據。因此，可以得出結論，化合物-6在上述指定的給藥范圍內沒有副作用。從臨床觀點來看進一步值得注意的是，本發明化合物對糖尿病并發癥發揮顯著的作用。糖尿病并發癥不在短期內出現。也就是說，由腎臟、外周神經和視網膜內微血管病誘發的糖尿病特有的并發癥不會出現，除非患有糖尿病10年或更長時間才會出現。因此，本發明化合物對糖尿病并發癥的治療作用不僅通過經由緩減胰島素抗性而改善代謝、而且通過改善慢性炎癥加以確立。這種對糖尿病并發癥的治療作用是本發明化合物最為顯著的作用之一。
(類視色素固有的副作用的避免)關于類視色素，已經累積了大量數據，并且已經研究了很長時間，它是典型的脂溶性維生素。除了9-順式視黃酸以外，已經報道了很多與RXR特異性結合的衍生物，不一而足。如果RXR的配體在治療慢性疾病中具有有效而顯著的作用，那么問題便出現了為什么從來沒有從大量類視色素衍生物中分離到非常有效和安全的化合物可供藥用？答案在于所有迄今已知作為RXR配體的類視色素及其類似物都對肝臟和神經系統具有強烈的毒性。那么，為什么本發明化合物不會對動物和人顯示類視色素共有的這類毒性呢？為了回答這個問題，有必要闡述類視色素與本發明化合物在吸收、轉運、分布、代謝、排泄等方面上的差異。當經由消化道吸收時，強脂溶性物質維生素A與血清蛋白結合，該蛋白與類視色素特異性結合。當結合入靶細胞時，它與這樣一種蛋白質結合，這種蛋白質與細胞內的類視色素結合，并貯存在肝臟內。或者，如果必要的話，它在靶組織內發揮它的作用。為了使被轉運的維生素A結合入靶細胞，血液中的類視色素-結合蛋白與細胞表面層上的相應受體特異性結合似乎是必要的。不過，關于這點沒有進行過詳細研究。無論如何，類視色素的分布與特異性密切相關。在治療糖尿病的情況下，類視色素不會選擇性地分布在靶脂肪細胞組織或活化的巨噬細胞內，即慢性炎癥的靶細胞內。為了將靶組織或靶細胞內的RXR配體濃度提高到使類視色素對動物給藥能夠調節基因信號的水平，類視色素需要過量給藥。當過量給藥類視色素時，它蓄積在神經、肝臟、皮膚等內，水平超過可接受的上限，繼而發揮副作用。總而言之，迄今已知的類視色素衍生物不顯示靶器官分布特異性，因此強烈的不良副作用的發生是不可避免的。
在將放射性同位素-標記的根據本發明的化合物對動物口服給藥的情況下，血漿中沒有檢測到化合物，不過經由消化道吸收的放射性出現在門血液中。也就是說，本發明化合物與血清蛋白強烈地結合。因此，在釋放與蛋白質結合的藥物所常用的條件下，這些化合物不能從蛋白質中釋放并回收到有機溶劑中。為了從血漿中回收游離態化合物，需要向血漿中加入大量水可混溶性有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等)，酸化混合物(pH 3.0或以下)，然后在室溫下放置約1周。即使經過這種處理，最多能夠回收產率約90％的游離化合物，按放射性計。也就是不可能回收100％的游離化合物。因此，假定本發明化合物與蛋白質結合不是經由一般在大量藥物中所觀察到的蛋白鍵，而是經由共價鍵。下列實驗已經闡明從本發明化合物衍生的這些新物質和存在于血清中的血清蛋白的結構。將殼二孢氯素、化合物-6或化合物-14溶于少量有機溶劑中，加入到血清中。然后，游離化合物以短的半衰期連續減少。24小時后，游離化合物幾乎檢測不到。在此期間，隨著游離化合物減少，血清變為黃色。這是因為血清的加入使由本發明化合物固有的醛基引起的紫外最大吸收向可見部分遷移。當將有機溶劑(乙醇、乙腈等)加入到含有本發明化合物的黃色血清中時，著色劑從不溶于溶劑，這清楚地說明化合物與蛋白質緊密結合。已經確定該鍵是由本發明化合物中的醛基與血清蛋白的氨基之間的反應所形成的共價鍵，反應生成席夫堿。經由本發明化合物與血清蛋白之間的鍵所生成的席夫堿不會經歷阿馬多里重排，這不同于糖類與蛋白質結合的情況。因此，沒有生成不可逆的高級糖化終產物。這樣一種席夫堿是完全可逆的，在酸性條件下、在有機溶劑中水解再生本發明化合物和血清蛋白。因此，本發明化合物與血清蛋白生成席夫堿具有緩沖作用，由此經由消化道吸收的游離化合物的生物學活性被暫時屏蔽了，活性游離化合物是逐漸供應給靶組織的。
由本發明化合物與血清蛋白的反應所生成的席夫堿是失活的化合物，具有被屏蔽的生物學活性。已將放射性同位素-標記的化合物-6口服給藥一次的大鼠器官內放射性分布檢查說明，放射性在多數器官內迅速下降，3天后消失。這種放射性主要經由糞便排泄。非常有趣的是，進入白脂肪細胞組織(即II型糖尿病治療的靶組織)的放射性逐日上升。同樣有趣的是，進入脂肪細胞組織的放射性化合物是溶解在細胞內油滴中的游離化合物-6。不知道為什么放射性選擇性地分布在脂肪細胞組織內，并且隨著時間的推移而蓄積。不過，這種分布選擇性充分說明根據本發明的化合物能夠改善糖尿病性代謝機能紊亂，且安全程度高。也就是說，本發明化合物在經由消化道吸收的步驟轉化為高度安全的席夫堿，具有被屏蔽的生物學活性。這種席夫堿在靶細胞表面層上被吸收，經由胞吞作用結合入細胞中。然后它水解再生游離化合物-6。游離化合物-6溶解在儲存脂肪內的油滴中。在脂肪細胞內，它逐漸溶解在細胞質中，發揮其作用。當白脂肪細胞組織內的儲存脂肪作為能量來源被轉運到其他組織內時，游離化合物-6與脂肪一起被轉運。也就是說，它同時也充當儲庫。根據本發明的化合物幾乎不進入其他組織中。而且，它既不蓄積也不顯示任何毒性，除非存在儲存脂肪的油滴。與類視色素不同，本發明化合物能夠發揮其作用而不導致類視色素固有的副作用。原因無疑與本發明化合物的動力學(活化化合物在靶細胞表面層中的吸收、轉運、再生等)有關，這些都不同于類視色素。例如，(1)本發明化合物在通過腸粘膜中的吸收性內皮細胞的步驟轉化為無毒的席夫堿，具有被屏蔽的活性；(2)與類視色素不同，本發明化合物經由共價鍵與血清蛋白結合，隨后體內轉運；(3)通過胞吞作用經由靶細胞表面層結合后，化合物-6水解、再生、然后溶解在細胞內的油滴中。圖1系統性地闡述在根據本發明的化合物與血清蛋白之間生成席夫堿的反應。
如上文所討論的，本發明化合物充當RXR受體的配體(也就是充當核受體總科的成員)，從而調節溫血動物基因信號的表達。迄今所知，RXR受體不僅與PPARγ、而且與甲狀腺激素受體(TR)、LXR、BXR(與苯甲酸結合的孤獨受體)、VDR等形成雜二聚體。已經進一步闡明，每種雜二聚體以器官-或組織-特異性方式調節基因轉錄，對生物學功能發揮各種作用。如本文所述，在公開本發明化合物的功能機理的過程中已經闡明，基因信號轉錄的RXR配體-依賴性調節作用意外廣泛地大大影響生物學功能。
迄今針對PPARγ所作的研究已經揭示，從因貯存脂肪增加而增大的脂肪細胞中釋放的腫瘤壞死因子(TNFα)降低肌肉和肝臟中的胰島素敏感性，RXR與PPARγ的二聚體抑制TNFα的產生，從而恢復胰島素的敏感性。另一方面，本發明化合物結合入活化的巨噬細胞中，后者蓄積在誘發于動脈壁和關節的慢性炎癥部位。然后，這些化合物充當RXR配體，與PPARγ形成雜二聚體，然后與染色體的特異性位點結合，從而調節有關炎癥的基因信號的表達。因此，這些化合物阻滯炎性細胞因子轉錄啟動子，抑制基因信號轉錄，從而實現抗炎作用。當結合入肝臟時，本發明化合物形成RXRLXR雜二聚體，從而促進膽汁酸生物合成途徑中的基因轉錄。然后，這些化合物活化將膽甾醇氧化為膽汁酸的過程，從體內排出多余的膽甾醇。RXR與作為活化的維生素D3的核受體VDR一起形成雜二聚體，使體內鈣代謝正常化，防止骨礦物密度降低。本發明化合物在動物實驗和臨床試驗中發揮各種作用，它們似乎彼此各不相關。這是因為這些化合物是RXR受體的配體。該發現不僅對生物學、而且對臨床醫學都發生影響。
發明的實施方式本發明化合物可以通過任何用于相似目的所需和可接受的給藥途徑給藥，單獨或者以適當制劑的形式。也就是說，它們可以配制成固體、半固體、凍干粉末或液體制劑(片劑、栓劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、溶液、懸液、乳劑、霜劑、洗劑、氣霧劑、軟膏劑、凝膠劑等)，例如經口、鼻、腸胃外或局部給藥，優選為適合的單一劑型，以便以精確劑量給藥。這些組合物包含本領域常用的藥物載體或賦形劑和本發明化合物以及可選的其他醫用藥物、載體、吸收助劑等。一般來說，藥學上可接受的組合物含有約1至99％(重量)的本發明化合物和約99至1％適當的藥用添加劑，因所需的給藥劑型而異。這些組合物含有約5至75％的本發明化合物作為醫用藥物，和余量適當的醫用填充劑。為了有效改善病理狀態，本發明化合物對成人的給藥劑量為0.1至20mg/kg/天，優選為0.2至5mg/kg/天。
為了治療上文詳細描述的疾病，優選制成制劑，以便根據疾病的嚴重性控制劑量。在配制制劑中最重要的因素在于由于本發明化合物可溶于脂肪，因此受到加工上的限制。由于核受體總科的配體是脂溶性激素或維生素，因此本發明化合物也可以是脂溶性的。
藥學上可接受的口服給藥用添加劑通過加入任意的常用填充劑加以制備，例如甘露糖醇、葡萄糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、明膠、蔗糖或碳酸鎂。這些組合物可以是溶液、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑或緩釋制劑的形式。優選的是，組合物是片劑或丸劑的形式。除了本發明化合物以外，這些組合物還可以含有稀釋劑(乳糖、蔗糖、磷酸鈣等)、崩解劑(淀粉、其衍生物等)、潤滑劑(硬脂酸鎂等)、粘合劑(淀粉、阿拉伯膠、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、纖維素、其衍生物等)、濕潤本發明化合物顆粒表面的表面活性劑、脂溶性添加劑、膽汁酸、磷脂等。特別優選的是，組合物含有可溶于有機溶劑的脂族合成表面活性劑或聚合物助劑。其實例包括阿拉伯膠、藻酸鈉、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、膨潤土、月桂基硫酸鈉、polysorbate80、脫水山梨醇單脂肪酸酯和聚乙二醇40硬脂酸酯(polyoxyl 40 stearate)。
在配制這些制劑中最重要的因素在于受到本發明化合物是脂溶性和防水性的限制。一般來說，脂溶性藥物經由消化道的吸收取決于從藥物顆粒中釋放的個體分子的溶解速率。一旦溶解在水中的脂溶性藥物到達消化粘膜的吸收部位，實際上它以無障礙狀態快速被吸收。即使幾乎不溶于水的藥物也能夠通過口服給藥快速被吸收，達到較高的生物利用度，只要它能夠快速溶于水。已知本發明化合物在水中溶解非常緩慢。為了配制這些化合物的制劑，因此需要提供添加劑，后者提高水中的溶解速率，和/或在配制過程中進行一些處理。在化合物幾乎不溶于水并且顯示非常緩慢的水中溶解速率的情況下，正如本發明的化合物，促進水中溶解的處理之一是減小藥物顆粒大小。也就是說，有效的是(1)制備化合物的微細顆粒，以便增大顆粒與水的接觸面積。即使生成化合物的微細顆粒，如果這些顆粒因防水性表面的存在而未能與水接觸，也不能提高水中溶解速率，因而不能作為微細顆粒分散在水中。為了使顆粒表面與水接觸，因此優選的是(2)使用本發明化合物以及結合脂溶性和水溶性基團的表面活性劑或聚合物。另外有用的是(3)加速個體分子從藥物顆粒中的釋放。在藥物顆粒是晶體的情況下，有效的是選擇這樣的晶體形式，其中從晶格中釋放個體分子需要有限的自由能。另外有用的是使本發明化合物是無定形的，以便促進個體分子的釋放。涉及本發明化合物的發明權利要求書要求保護含有本發明化合物的制劑的配制所需條件。
正如上文所討論的，本發明化合物的特征在于(1)在化學結構上非常類似于9-順式視黃酸，后者是類視色素X受體的天然配體；(2)在為了尋找類視色素X受體活性配體而進行的細胞培養實驗系統中促進基因轉錄，其特異性高于9-順式視黃酸；(3)當對包括人在內的動物給藥時，呈現出調節各種與RXR一起形成雜二聚體的核受體對基因信號的表達的效果；(4)醛基與血清蛋白反應，生成席夫堿，從而沒有類視色素固有的毒性，盡管本發明化合物是固有高毒性的RXR的配體。
現在，參照下列實施例，將更加詳細地描述發明。不過，發明的范圍不應被解釋為受其限制。
實施例實施例1按每片計，將63mg氯柱枝菌素、10mg脫水山梨醇倍半油酸酯、10mg粉狀硅膠、40mg玉米淀粉、50mg L-羥丙基纖維素(PO-30)、12mg羥丙基纖維素-SL、46mg微晶纖維素、10mg羧甲基纖維素鈉鹽、3mg硬脂酸鈣和6mg滑石按常規方式一起混合，造粒，壓片。
實施例2向63g研磨過的殼二孢氯素中加入50g乳糖、60g玉米淀粉、30g L-羥丙基纖維素、12g羥丙基纖維素-SL、46g微晶纖維素、10g羧甲基纖維素鈉鹽、3g硬脂酸鈣和6g滑石。所得混合物按常規方式造粒，壓片，得到片劑，每片重0.25g。
實施例3向100g 4-O-羧甲基殼二孢氯素(化合物-14)中加入70g微晶纖維素、35g乳糖、70g羧甲基纖維素鈣鹽、70g玉米淀粉和5g硬脂酸鎂。所得混合物按常規方式壓片，得到片劑，每片重0.35g。
實施例4將含有表達受RXR應答元件調節的報告基因的質粒和RXRα表達質粒轉移到COS-1細胞內。然后將這些細胞用本發明化合物，例如殼二孢氯素處理。發現報告基因的表達劑量由此提高了。本發明化合物的RXR轉活化活性低于9-CRA，但是幾乎與ATRA可比。這些結果說明本發明化合物是RXR激動劑，經由RXR調節基因表達。
RXR(類視色素X受體)報告基因轉移將質粒轉移到COS-1細胞內。利用Lipofect AMINE試劑(LifeTechnologies)，按常規方式進行基因轉移。將1×105個細胞分散在含有10％胎牛血清的2ml Dulbecco氏改性Eagle培養基(DMEM)中，倒在35mm陪替氏培養皿中。在CO2培養器內培養17小時后，取出培養基，粘附在陪替氏培養皿上的細胞用磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS)洗滌。然后利用Lipofect AMINE試劑進行基因轉移。也就是將含有4mg含有表達受RXR應答元件調節的蟲熒光素酶基因的質粒(pRXRLRXRE-SV40蟲熒光素酶；其中RXRE已與SV40啟動子配位結合并且由此表達受到調節的蟲熒光素酶cDNA已經位于其下游的報告基因質粒)的500ml最小血清培養基OptiMEM(LifeTechnologies)；4mg RXRα表達質粒(pRXRα；其中人RXRαcDNA已與巨細胞病毒啟動子下游配位結合以在哺乳動物細胞內表達人RXRα質粒)；和2mg用于評估基因轉移比的β-半乳糖苷酶基因質粒(pCH110；Pharmacia)與含有50ml Lipofect AMINE的500ml OptiMEM預混合，所得混合物在室溫下保持15分鐘。將100ml該液體混合物與400ml OptiMEM混合，將培養基混合物分盛在陪替氏培養皿中。在37℃CO2培養器內保持3小時后，從陪替氏培養皿中吸出基因轉移培養基，向其中加入含有測試物和10％血清(活性炭處理過)的DMEM培養基，再在37℃下培養20小時。使用化合物-1、-5、-6、-7、-10、-14、-19、-26和-28(各自在10-8、10-7和10-6M下)作為測試物，同時使用全反式視黃酸、9-順式視黃酸和地塞米松作為對照。進一步加入二甲基亞砜(最終濃度0.1％)作為測試物的溶劑。
RAR或GR(糖皮質激素)報告基因轉移代替含有表達受RXR應答元件調節的蟲熒光素酶基因的質粒(pRXRLRXRE-SV40蟲熒光素酶)和RXRα表達質粒(pRXRα)的是，將含有表達受RXR應答元件調節的蟲熒光素酶基因的質粒(pRARLRASE-SV40蟲熒光素酶)和GR表達質粒(pRARα)轉移到COS-1細胞內。將具有這些質粒的轉染體和本發明化合物(濃度10-4至10-7M)加入到培養物中。作為對照化合物，加入全反式視黃酸(10-8、10-7和10-6M)、9-順式視黃酸(10-8、10-7和10-6M)、地塞米松(10-8、10-7和10-6M)等。
從陪替氏培養皿中吸出培養基后，加入250ml培養后的溶胞溶液(25mMTris磷酸鹽緩沖液(pH7.8)、2mM1，2-二氨基環己烷-N，N，N’，N’-四乙酸酯、10％甘油、1％Triton X-100)，用橡膠淀帚剝離細胞，收集。通過冷凍和熔化使細胞完全破裂后，將細胞在4℃下離心(15000rpm，2分鐘)，采用所得上清液作為測量樣本。向20ml上清液中加入100ml蟲熒光素酶底物溶液(2.14mg Co-A、100ml 470mM D-蟲熒光素、200ml 530mM ATP、2ml DTT-麥黃酮緩沖液(pH7.8))，用發光計(ATTO Luminosensor AB-2000)測量熒光強度。為了測量決定基因轉移效率的β-半乳糖苷酶，使用發光的β-半乳糖苷酶檢測試劑盒II(Clontech)，用發光計測量熒光強度。正如表2所示，由此發現本發明化合物是RXR特異性配體，盡管它們的活性多少低于9-順式視黃酸。盡管這些化合物對RAR的活性相當于對RXR的活性的約25至40％，不過它們根本不活化GR。因此，顯然說明本發明化合物是RXR特異性配體。
實施例5對遺傳性肥胖的糖尿病小鼠的胰功能保護作用由于缺乏遺傳性leptin報道基因，db/db小鼠即使在飽滿感下也沒有食欲控制。結果，它們因過量進食患上高胰島素血癥和嚴重的肥胖，從而經歷糖尿病的發作。將本發明化合物對db/db小鼠口服給藥40周(從出生后11周至51周)(圖2)。
在小鼠經歷嚴重肥胖(直到出生后第20周)期間，外周組織的胰島素抗性逐漸增強，因此血液胰島素水平逐漸上升。隨著肥胖達到最大水平，胰島素需求超過胰島素的產生水平。因此，其中具有胰島素貯存顆粒的朗格罕氏胰島β-細胞多數脫顆粒，出現胰島素貯存缺乏。為了過量產生胰島素而已經嚴重工作的朗格罕氏胰島β-細胞逐漸疲勞。從肥胖達到最大水平開始，易發生朗格罕氏胰島β-細胞的變性和/或壞死，與此同時，血液胰島素水平快速降低。從出生后第23周開始，因胰島素功能不足，不可能合成過量攝入的全部食物能量，誘發體重下降。不能被合成的食物能量作為尿糖排泄出去。結果是尿糖隨著血液胰島素水平的減少而增加。出生后約50周，遺傳性肥胖的糖尿病小鼠體重減少至相當于正常胎仔的水平(即最大體重的1/2至1/3)，血糖水平明顯超過700mg/dl，排泄大量葡萄糖進入尿液。此時血液胰島素水平降低至幾乎相當于正常胎仔的水平。也就是在人的臨床病案中出現非胰島素依賴型糖尿病向胰島素依賴型糖尿病的轉化。在用含有0.1％化合物-14的飼料飼喂的db/db小鼠中，從剛開始給藥之后葡萄糖幾乎不排泄進入尿液，血糖水平逐漸降低至正常水平。出生后約40周，db/db小鼠的血糖水平幾乎相當于正常胎仔。不過，化合物-14沒有修復leptin受體的功能，因此對因過量進食所致高胰島素血癥誘發肥胖的過程不發揮作用。
關于化合物-14的作用，重要的是要注意它的給藥不引起胰島素的產生因朗格罕氏胰島β-細胞疲勞而有任何顯著減少，盡管給藥該化合物迫使朗格罕氏胰島β-細胞在高胰島素血癥情況下行使其功能，另外還使血糖水平正常化，顯著減少尿糖。由于朗格罕氏胰島β-細胞在糖尿病的各個方面都是至關重要的，本發明化合物長期維持這些細胞功能的能力對糖尿病的治療和預防具有非常重要的意義。
實施例6將十八只體重約200g的雄性Wistar大鼠隨機分成3組。將45mg/kg鏈脲霉素對2組動物靜脈內給藥。這些組之一視為對照組，而另一組視為化合物-6給藥組。將其中溶解有鏈脲霉素的1/10M檸檬酸鹽緩沖溶液(pH 3.5)對其余1組視為正常對照組的動物靜脈內給藥。鏈脲霉素給藥后立即將化合物-6的阿拉伯膠懸浮液口服給藥，每天一次，連續10天，劑量為20mg/kg/天。將單獨的阿拉伯膠溶液對其他組給藥。最后一次給藥后禁食6小時后，從每只動物的心臟采集血液，測量血糖水平和血液胰島素水平。如下表7a所給出的數據所示，口服給藥化合物-6抑制了血糖水平的升高和血液胰島素水平的降低。
將十八只體重約250g的雄性SD大鼠隨機分成3組。這些組之一視為正常對照組，而其余2組視為鏈脲霉素給藥組。從50mg/kg鏈脲霉素靜脈內給藥后24小時開始，口服給藥10mg/kg/天懸浮在阿拉伯膠溶液中的化合物-5，每天一次(清早)，連續14天。將單獨的阿拉伯膠溶液對正常對照組和鏈脲霉素對照組口服給藥。最后一次給藥后禁食6小時后，從每只動物的心臟采集血液，測量血糖水平和血液胰島素水平。如下表7b所給出的數據所示，化合物-5的口服給藥抑制了血糖水平的升高和血液胰島素水平的降低。
表7本發明化合物減緩鏈脲霉素誘發糖尿病的發作a.化合物-6減緩發作(平均±SE)劑量(mg/kg) 血糖(mg/dl) 血清IRI(mU/ml)正常組(對照) - 159.7±3.8921.7±2.87糖尿病組(對照) - 672.1±40.76 2.7±0.88糖尿病組(治療) 20 277.2±52.44*12.3±1.65*
*P＜0.05(與糖尿病對照組的顯著性差異)b.化合物-5減緩發作(平均±SE)劑量(mg/kg)血糖(mg/dl)血清IRI(mU/ml)正常組(對照)- 120.5±3.50 25.2±2.99糖尿病組(對照) - 667.8±53.71 2.1±1.12糖尿病組(治療) 10 237.2±26.31*15.5±2.16**P＜0.05(與糖尿病對照組的顯著性差異)實施例7抑制白兔動脈硬化的作用已知白兔在用富含脂肪的飼料飼養時，在相當短的時間階段內患上動脈硬化，經歷循環機能紊亂。因此，向粉狀市售標準白兔飼料中加入10％硬化椰子油、2％膽甾醇、0.5％牛膽汁粉和0.04％或0.01％殼二孢氯素，使混合物形成顆粒，制備高脂肪飼料。單獨制備另一份用于對照組的高脂肪飼料，不加入殼二孢氯素。而且，向飼料中加入0.2％氯貝特(clofibrate)(即PPARα配體)作為對照藥物，得到另一份高脂肪飼料。
將二十四只體重約2kg的白兔隨機分成4組。這些組之一視為對照組，而其余3組分別隨機視為氯貝特組、殼二孢氯素0.01％組和殼二孢氯素0.04％組。然后進行14周的實驗。圖3顯示結果。從實驗的大約第6周開始，對照組和氯貝特組動物喪失食欲，在實驗過程中，每組六只動物中有2只因冠狀動脈梗阻死于循環機能不全。相形之下，在殼二孢氯素0.01％組和殼二孢氯素0.04％組動物中，顯著減輕了冠狀動脈梗阻的損害，所有個體存活下來，直到實驗結束。需要強調的是，殼二孢氯素和氯貝特不會抑制血清總膽甾醇水平增加。白兔的血清總膽甾醇水平(即將開始實驗之前約為50mg/dl)在各組內均迅速增加，1個月后超過1g/dl。因此，血漿變得象牛奶一樣渾濁。各組的血清總膽甾醇水平幾乎相同，這說明低密度脂蛋白結合入動脈壁的比例在這些組內是幾乎相同的。殼二孢氯素對動脈硬化的抑制作用提示，抑制了從白細胞浸潤至受傷動脈經由慢性炎癥再到動脈硬化的過程。
實施例8抑制日本鵪鶉動脈硬化的作用當用高脂肪飼料飼喂時，鳥類也在短時間階段內顯示動脈硬化的發作。將32只約30天齡的日本成年鵪鶉隨機分成4組。這些組之一視為標準飼料組，另一組視為高脂肪飼料對照組，其余2組分別視為高劑量化合物-6組和低劑量化合物-6組，各自用高脂肪飼料飼喂。向粉狀富含蛋白質的標準雞用飼料中加入1％膽甾醇，使混合物形成顆粒，制備飼料。向粉狀飼料中加入0.16％或0.0025％的化合物-6，然后使混合物形成顆粒。實驗進行9個月。在此期間，使鳥隨意取用飼料和飲用水。用在本實驗中的飼料比用在白兔實驗中的飼料含有較少脂肪，并且不含促進膽甾醇從消化道吸收的膽汁酸。結果，沒有日本鵪鶉患有嚴重的循環機能紊亂，飼料攝取量在整個實驗期間顯示沒有組間差異。
9個月后，采集血液，測量血清總膽甾醇水平和中性脂肪水平。與用標準飼料飼喂的對照組相比，用高膽甾醇飼料飼喂的對照組的血清總膽甾醇水平高出13倍，血清中性脂肪水平高出4倍。膽甾醇和中性脂肪水平在高劑量化合物-6組中均減少40％，在低劑量化合物-6組中分別減少25.5％和21.6％。解剖每只鳥，取出主動脈。然后根據動脈粥樣化占總內孢子膜面積的比例和動脈壁的增厚分5級為嚴重性打分。結果，高膽甾醇飼料組有7/8顯示動脈粥樣化損害，動脈粥樣化嚴重性平均為2.21。相形之下，高劑量化合物-6組顯示沒有動脈粥樣化，而低劑量化合物-6組有1/2的鳥顯示動脈粥樣化，大大減輕了嚴重性，得分為0.50。
這些實驗數據說明，不僅母體化合物殼二孢氯素、而且經過4-位羥基修飾的其衍生物都具有抑制動脈硬化的作用，如本實驗所示，在抑制血清低密度脂蛋白水平的增加的同時，抑制動脈硬化的作用得到進一步加強。
表8用含有化合物-6和1％膽甾醇的標準雞用飼料飼喂日本鵪鶉9個月的血清脂質水平組 化合物-6(％) 血清總膽甾醇(mg/dl) 血清中性脂肪(mg/dl)對照0 2013±193 654.6±64.0低劑量 0.0025 1499±120*513.1±39.2-25.5％ -21.6％高劑量 0.161200±136**392.6±46.5*-40.4％ -40.0％(平均±SE)*P＜0.05，**P＜0.01，在Studentt試驗中表9用含有1％膽甾醇的標準雞用飼料飼喂日本鵪鶉9個月的弓形主動脈中的動脈粥樣化形成個體編號 對照組 低劑量組 高劑量組I II 00II I00IIIIV 00IV 0I0V I00VI II I0VIIIII I0VIII IV I0平均2.12±0.52 0.50±0.199**0.00±0.00**弓形主動脈中動脈粥樣化的發作0沒有動脈粥樣化I覆蓋動脈粥樣化的比例為總面積的1至10％II覆蓋動脈粥樣化的比例為總面積的11至40％III覆蓋動脈粥樣化的比例為總面積的41至70％IV覆蓋動脈粥樣化的比例為總面積的71至100％實施例9抑制動脈瘤的作用本發明化合物顯示抑制惡性高血壓模型大鼠結節性動脈外膜炎的作用，在該模型中結節性動脈外膜炎出現在腸系膜動脈中，并發展為動脈瘤。在動脈瘤中，在腸系膜動脈中形成的那些可以定量治療。因此，取出腸系膜動脈，用福爾馬林固定。然后進行脂肪染色，計數三次小動脈和動脈瘤，計算每支小動脈的平均動脈瘤數。給因一腎切除而腎機能減退的大鼠飲用滲透壓略高于血漿的0.9％鹽水，將10mg/kg乙酸脫氧皮質酮(DOCA)(一種礦物性腎上腺皮質激素)皮下給藥，間隔1周。將二十四只雄性Wistar大鼠隨機分成4組。取出左腎后，使每只動物維持原狀，手術傷口愈合。一周后，這些組之一視為對照組，而將10mg/kg/天和40mg/kg/天的化合物-6對其余兩組連續給藥。實驗進行7周。自實驗開始，每三天測量一次每組的飼料攝取、水攝取、尿、體重和血壓。
對照組顯示血壓迅速升高。平均血壓在第3周超過180mmHg，在第4周達到200mmHg。與對照組相比，本發明化合物給藥組在第2周和第3周顯示顯著抑制血壓升高的作用，盡管之后沒有觀察到顯著差異。給藥組顯示顯著的減少水攝取、減少尿、維持濃縮尿電解質的能力、改善體重增加速度等作用。在第7周，解剖每只動物，取出腸系膜動脈。用福爾馬林處理后，動脈進行脂肪染色，計數動脈瘤。正常對照組沒有個體顯示動脈瘤。另一方面，高血壓對照組中的所有個體都顯示動脈瘤，每支腸系膜動脈的平均動脈瘤數為1.67±0.68，從而說明高血壓的動脈損害已經在發展之中了。低劑量化合物-6組的每支小動脈平均顯示0.66±0.41個動脈瘤。在高劑量化合物-6組中，每支小動脈的平均動脈瘤數降至0.27±0.05個。
也就是已經闡明，根據本發明的化合物強烈地抑制主要由高血壓引起的分支部位血管損害所誘發的動脈瘤發作。
表10化合物-6抑制在DOCA高血壓大鼠的腸系膜動脈中形成動脈瘤的作用組 大鼠編號小動脈數結節數 表象頻率a)(％) 損害指數b)對 19 11.00 35.67324.27 4照 20 14.67 8.00 54.53 221 15.33 8.67 56.56 222 9.33 39.33421.54 423 15.00 2.00 13.33 124 15.67 20.67131.91 3平均13.50 19.06 167.02±68.122.67±0.4910 25 9.00 2.33 25.89 1mg/ 26 11.33 2.33 20.56 1kg 27 11.00 3.00 27.27 128 14.67 40.33274.91 429 17.00 5.67 33.35 130 13.33 2.00 15.00 1平均12.72 9.27 66.16±41.83 1.50±0.5040 31 12.67 1.00 7.89 1mg/ 32 10.33 0.33 3.19 1kg 33 12.00 2.00 16.67 1
34 13.67 5.00 36.59 135 13.00 3.33 25.62 136 15.00 4.33 28.87 1平均 12.78 2.67 26.57±5.24***1.00±0.00***腸系膜動脈中的小動脈和結節各自計數三次，計算平均值。
a)表象頻率＝結節數/小動脈數×100(％)b)損害指數評價如下0腸系膜動脈中的結節數；01結節數；1至50％2結節數；51至100％3結節數；101至200％4結節數；201％以上實施例10對大鼠佐劑性關節炎的治療作用為了討論本發明化合物是否不僅對動脈內的慢性炎癥有效，而且對全身性慢性炎癥有效，檢查了對大鼠佐劑性關節炎的作用，這是典型的慢性炎癥模式。
實驗1所采用的患有關節炎的大鼠是患有由45天前注射佐劑導致的嚴重關節炎的個體，由于不能彎曲后肢，只能靠前肢爬行。通過觀察行走，肉眼觀察后肢炎癥的嚴重性和腿部腫脹的體積，來評價藥物的作用。將含有死結核桿菌Aoyama B株的Freund氏不完全佐劑皮下注射到19只SD雄性大鼠(重約300g)尾根內，誘發后肢的關節炎。將化合物-6懸浮在黃芪膠溶液中，按0.5ml/100g體重的比例口服給藥。化合物-6對3個組給藥，包括高劑量模型(HM；50mg/kg)、中劑量模型(MM；25mg/kg)和低劑量模型(LM；10mg/kg)。給藥在每天早晨進行一次，連續7次。在此期間，在實驗開始和之后2、4和7天測量后肢體積。以實驗開始時的體積為100％，計算體積變化。在第7天，用肉眼分5級評價后肢的炎癥狀況。
1周后，對照組在炎癥嚴重性和后肢體積上顯示與實驗開始前沒有大的差異。不過，驚人的是原本已經由于關節腫脹而不能彎曲后肢的化合物-6組的所有大鼠又能夠行走了，這歸功于化合物-6的作用。事實上，后肢腫脹的體積也大為減小了。殼二孢氯素及其衍生物如化合物-14顯示相似的作用。基于這些結果，已經證實本發明化合物不僅發揮改善動脈炎癥的作用，而且發揮改善關節內慢性炎癥的作用。給藥后立即合并三個化合物-6組，再根據關節炎的發生與否分組(即陽性和陰性組)。然后將數據與對照組的數據比較。所有對照組個體都患上關節炎。當校準化合物-6組與對照組之間的表象頻率時，觀察到顯著的差異，危害率為5％。這個事實說明化合物-6在治療嚴重關節炎上顯然是有效的。
表11各組在第7天時的體重增加和后肢炎癥體重變化(g/大鼠)*炎癥得分**對照(n＝5) 2.9 4.4HM組(n＝5) 2.2 2.2MM組(n＝5) 3.9 2.8LM組(n＝5) 2.0 3.2*給藥剛開始前的體重減去給藥剛結束后的體重**炎癥得分如下評價后肢炎癥的嚴重性5由于雙后肢腫脹而不能正常行走；4由于單后肢腫脹而不能正常行走；3盡管雙后肢腫脹，不過還能夠行走；2盡管單后肢腫脹，不過還能夠行走；1雙后肢正常。
x方檢驗關節炎(-) 關節炎(+) 總計MAC組 7 7 14對照組 0 55總計 7 12 19在相當于自由度為1的5％顯著性差異下的理論值＝3.84。校準后的值＝3.96。因此P＜0.05。
實施例11降低小鼠血清總膽甾醇水平的作用血清膽甾醇降低劑的作用因動物而異。也就是一些對某種動物有效的藥物對其他動物發揮任何作用。例如，當HMG CoA還原酶抑制劑compactin對嚙齒動物(例如大鼠或小鼠)給藥時，不能降低血清總膽甾醇水平。這是因為即使HMG CoA還原酶在嚙齒動物肝臟內受到抑制，該酶也以超過補償抑制作用的量生物合成，以致否定了抑制作用。因此，可取的是在盡可能多的動物中校準降低血清總膽甾醇水平的作用。關于本發明化合物對血清總膽甾醇水平的作用，利用小鼠進行測定。向大鼠與小鼠用標準粉狀飼料中加入這些化合物后，使所得混合物形成顆粒，對5周齡的雄性ICR和ddY小鼠給藥8天。在第8天的下午，從心臟采集每只動物的血液，測定血清中的總膽甾醇。將劑量確定為最大劑量，即口服給藥1周后不抑制體重增加的劑量，及其1/4劑量。表12顯示結果表12本發明化合物對小鼠血清總膽甾醇的降低作用

每個數值以平均±SE表示(n＝10)。
a)在化合物-1的情況下，對照組由23只動物組成，而0.04％與0.01％組各由12只動物組成。
實施例12
大鼠膽汁酸排泄的促進作用和膽甾醇-7α羥基化酶轉錄的促進作用測定飼料來源的膽甾醇和已經給藥本發明化合物的大鼠糞便中的中性甾醇和酸性甾醇，以監測甾醇平衡和糞便中的膽汁酸組成變化。結果闡明給藥本發明化合物導致排泄進入糞便中的甾醇(特別是膽汁酸)增加。進一步隨著時間的推移從已經接受膽管造口術的大鼠中采集膽汁樣本，測定其中的膽汁酸。由此闡明給藥本發明化合物顯著增強膽汁酸排泄進入膽汁。將重約250g的雄性Wistar大鼠分組，每組6至8只動物。然后用含有2％膽甾醇的標準鼠用飼料(CE-2；Nippon Crea Co.，Ltd.)飼喂這些大鼠10天。在此期間，強迫口服給藥10mg/kg懸浮在阿拉伯膠溶液中的化合物-6或化合物-5，每天一次。在第6天和第10天收集糞便。然后按常規方式從中提取甾醇，測定酸性甾醇和中性甾醇。另一方面，也測定飼料中的膽甾醇，以便計算飼料來源的甾醇的量。
表13化合物-6對大鼠甾醇平衡的作用飼 血清總膽 甾醇(mg/200g重量) 體內生物合成甾醇平料 組 甾醇(mg/dl)攝入排泄 (mg/200g重量) 衡(mg)標 對照77.7±3.26 7.388.421.05 0準 化合物-6 65.0±2.98*7.48 10.811.05-2.28含有對照91.2±3.39 310.38255.70 0 +54.68膽甾醇 化合物-6 77.0±2.19*301.45275.52 0 +25.93*P＜0.05，Studentt-試驗(n＝6)表14a標準飼料試驗 給藥膽甾醇攝 糞便中的甾醇(mg/天) 甾醇平衡排泄增加組 (天)入(mg/天) 糞甾醇 膽甾醇 酸性甾醇(mg/天)(mg/天)對照 5 7.93 3.402.85 2.59 -0.91-化合物-16 5 8.28 3.983.51 5.19 -4.40 3.49對照 10 7.83 2.152.67 2.66 +0.34-化合物-1610 7.59 2.843.18 4.61 -3.04 3.39(n＝8)
表14b高膽甾醇飼料試驗給藥膽甾醇攝 糞便中的甾醇(mg/天) 甾醇平衡 排泄增加組 (天)入(mg/天) 糞甾醇 膽甾醇 酸性甾醇(mg/天) (mg/天)對照 5 302.9142.69 229.726.43 +24.07 -化合物-165 311.1441.05 246.308.67 +15.12 8.95對照 10 350.2859.06 222.476.17 +62.59 -化合物-16 10 329.8058.27 233.089.93 +28.5234.07(n＝8)為了檢查本發明化合物促進膽汁酸排泄的功能機理，進行了研究對核受體LXR作用的實驗。假定肝臟內的特殊核受體LXR可能是膽甾醇傳感器，與22-羥基膽甾醇一起用作配體(Bethany A.Janowski等《自然》383728-731，1996)。當膽甾醇過量蓄積在各自的器官內時，LXR與配體結合，與RXR形成雜二聚體，然后與激素應答元件結合。這種結合充當用于促進膽甾醇氧化為膽汁酸以從體內排泄的信號，從而減少沉積的膽甾醇。因此，肝臟是最大量蓄積膽甾醇的器官，同時又是最大量地以膽汁酸形式釋放膽甾醇的器官。據估計，本發明化合物促進膽汁酸排泄進入糞便的能力將是如下確立的。在肝臟內，RXR和LXR與對應的配體結合，隨后彼此形成雜二聚體，因此促進膽甾醇-7α-羥基化酶的表達，后者是膽汁酸生物合成途徑中的限速酶。也就是說，據估計，作為RXR配體的本發明化合物將促進膽甾醇-7α-羥基化酶(即肝臟內膽汁酸生物合成中的速率狀態酶)基因的轉錄，因此增強膽甾醇-7α-羥基化酶的表達。在測量已經口服根據本發明的化合物-6的大鼠的研磨肝臟中的膽甾醇-7α-羥基化酶活性時，確認以劑量依賴性方式提高了每單位蛋白質重量的膽甾醇-7α-羥基化酶的酶活性和產量。因此，可以得出結論，氯貝特與本發明化合物對膽甾醇代謝的作用之間的差異在于前者是PPARα的配體，其不能與LXR形成雜二聚體，而后者以RXR配體依賴性方式增強膽甾醇氧化酶基因的轉錄，因此促進以膽汁酸形式從體內排泄。這些發現可以看作本發明的一個主要方面。
如下進行實驗。對于每種化合物，將10只重約200g的雄性SpragueDawley大鼠隨機分成2組，用含有1％膽甾醇的粉狀大鼠飼料(CE-2；NipponCrea Co.，Ltd.)飼喂一周，飲水隨意。將本發明化合物懸浮在2％阿拉伯膠溶液中，強迫口服給藥，每天一次，連續7次，劑量為5mg/kg(化合物-1和化合物-26)或20mg/kg(化合物-6和化合物-14)。在第8天清晨，通過放血殺死每只動物。用生理鹽水回流后，立即取出肝臟。然后向肝臟加入4倍250mM蔗糖溶液(含有75mM煙酰胺、1mM EDTA和0.5mM MgCl2)，利用特氟隆勻漿器研磨混合物。然后在4℃下，將液體研磨物在9500G下離心15分鐘，所得不含線粒體的上清液進一步在105000G下離心60分鐘，由此分離微粒體部分。利用所分離的微粒體，按常規方式測量7α-膽甾醇產量，計算轉化率。
表15本發明化合物對肝微粒體內7α-膽甾醇生成的作用化合物組7α-羥基膽甾醇(％) 7α-羥基膽甾醇(nM/hr/mg蛋白質)化合物 對照 3.88 2.56-1 治療 5.51 3.80化合物 對照 4.24 2.69-6 治療 5.30 3.61化合物 對照 4.33 3.06-14治療 7.06 4.47化合物 對照 2.89 2.05-26治療 4.00 3.31(n＝5)，以5只大鼠的平均數表示實施例13化合物-14加強維生素D3活性的作用RXR也與核受體VDR形成雜二聚體，與活性維生素D3(1a，25-二羥基維生素D3)一起用作配體。不過，迄今還沒有研究過這種雜二聚體的形成在體內的意義如何。因此這種雜二聚體對基因轉錄的作用及其生理學意義仍然是未知的。活化的維生素D3是兒童骨骼發育和生長所必需的。而且，它也是預防老人和病人骨質疏松和骨折所必需的。盡管有如此有意義的作用，也沒有進行過研究，以闡明VDR與RXR的雜二聚體的功能。發明人研究了db/db小鼠中的鈣代謝和化合物-14對鈣代謝的作用。1992年部分報道了這項研究(Tomoyoshi Hosokawa《Nogei Kagaku Kai-shi》(農業化學雜志)661221-1226，1992)。與同齡的正常胎仔相比，db/db小鼠顯示異常高水平的尿鈣、血鈣、血降鈣素和甲狀旁腺激素。將殼二孢氯素衍生物，即化合物-14給藥1周，尿鈣、血鈣和降鈣素水平顯著降低了。通過長期(4周)飼喂db/db小鼠，發現這些動物的骨礦物密度低于同齡的正常胎仔。值得注意的是，長期給藥根據本發明的化合物能夠顯著預防骨礦物密度降低。換句話說，作為RXR配體的殼二孢氯素衍生物劑量依賴性地加強內源性活性維生素D3的功能，預防鈣代謝機能紊亂，例如骨質疏松癥。RXR配體的這種作用是迄今未知的新發現。
實施例14化合物-6的I期臨床試驗對17名40至82歲的高膽甾醇血癥的男性和女性患者進行了本發明化合物之一化合物-6的I期臨床試驗。實驗持續12周，將化合物-6在前8周內給藥。劑量規劃如下1mg/kg至第2周，2mg/kg至第3周，4mg/kg至第4周，8mg/kg至第6周，16mg/kg至第8周。從第8周到第12周(安慰劑給藥階段)給以安慰劑，但不告知患者。藥物的每日劑量分成3份，飯后服用。每名患者每周來醫院一次，接受調查和血液采集，用于分析血清。
本試驗中，沒有觀察到嚴重的主觀或客觀副作用。在生物化學的血清檢查、血液百分率、尿檢查等數據中也沒有觀察到由藥物給藥所導致的異常。盡管有一名患者出現眩暈，也沒有嚴重到停止藥物給藥的程度。由于該患者還患有高血壓，似乎由于給藥化合物-6使血壓正常化，而誘發眩暈。在心電描記術和眼底鏡檢查中也沒有觀察到藥物給藥的影響。
由藥物給藥所導致的最大變化是血清總膽甾醇水平的顯著降低。這種降低從給藥后1周開始，降低速率隨著給藥劑量的增加而上升，也就是顯示劑量依賴性。進一步有趣的是，患者的血清總膽甾醇水平甚至在停止藥物給藥后2至4周內仍然低于給藥前的水平。也就是藥物明顯地顯示延期效應。按照WHO規定的標準，盡管有些患者患有高血壓或臨界性高血壓，各組內給藥化合物-6都降低了收縮血壓和舒張血壓。患者中還包括5名糖尿病患者，他們的血糖水平分別降至100mg/dl，即正常范圍的上限。另一方面，血清中性脂肪水平沒有象血清總膽甾醇水平那樣顯著降低。盡管僅在中性脂肪/總膽甾醇之比為1.5或以下的患者組中觀察到了顯著的降低，不過1.5或以上的患者顯示中性脂肪沒有降低(圖4和5)。
這些事實符合本發明化合物形成RXRLXR雜二聚體、由此活化膽甾醇以膽汁酸形式從體內排泄的途徑的功能機理。
表16化合物-6降低人血清膽甾醇的作用(平均±SE)劑量血清總膽甾醇(mg.kg) mg/dl 降低(％) P治療前 - 342±61.0 - -1周后 0.5 273±62.7 -20 P＜0.0052周后 1 266±66.7 -22 P＜0.0023周后 2 269±66.0 -21 P＜0.0054周后 4 254±65.7 -28 P＜0.00056周后 8 217±58.8 -36 P＜0.00058周后 16 229±61.5 -33 P＜0.000510周后 0 256±57.6 -25 P＜0.000512周后 0 264±57.7 -22 P＜0.002受治療者48至70歲的11名男性和6名女性(n＝17)。
安慰劑給藥階段第10至12周。
實施例15化合物-6的II期臨床試驗進行化合物-6的II期臨床試驗，該試驗涉及30名患有非胰島素依賴型糖尿病(II型)的患者。化合物-6給藥的每日劑量為6mg/kg(也就是每餐后服用兩片，片重60mg)。給藥持續12周。
由本試驗所闡明的事實如下。化合物-6顯著降低血糖水平和血清總膽甾醇水平，但是幾乎不顯示降低血清中性脂肪水平的作用。在清晨空腹口服50g葡萄糖的葡萄糖耐受性試驗中，與給藥前的數據相比，化合物-6顯著改善葡萄糖耐受性，減少尿糖(圖6和7)。
因此，已經證實本發明化合物具有改善II型糖尿病代謝和胰島素敏感性的作用。II型糖尿病經常伴有高血壓。本試驗中，按照WHO的標準，7名患者患有高血壓，而17名患者患有臨界性高血壓。不過，給藥化合物-6顯著降低了這些組的血壓。作為PPARγ配體的曲格列酮改善II型糖尿病的胰島素敏感性、代謝參數和葡萄糖耐受性。不過，它匯集體內的鈉，因此不發揮降壓作用。在這點上，曲格列酮明顯不同于本發明化合物(圖8)。
表17化合物-6在II期臨床試驗中降低禁食血糖水平和血清總膽甾醇水平的作用(化合物-6的劑量360mg/天)
a.血糖水平變化(平均±SE)n 禁食血糖水平(mg/dl)降低(％)治療前(Pre-Rx) 30 188±6.6 -第4周30 165±4.3**12.37第8周30 159±2.4**15.45第12周 30 154±4.4**18.05(n＝30)，**P＜0.01和***P＜0.001，Student成對t試驗b.血清總膽甾醇水平變化(平均±SE)n 血清總膽甾醇水平(mg/dl) 降低(％)治療前(Pre-Rx)30319±10.2 -第4周 30265±4.4***16.6第8周 30240±4.4***24.3第12周 30231±4.4***27.2(n＝30)，**P＜0.01和***P＜0.001，Student成對t試驗在上述化合物-6的臨床試驗中，最突出的是顯著改善了由糖尿病性腎病和糖尿病性神經病所導致的糖尿病并發癥臨床癥狀。大多數糖尿病人例如表現由糖尿病性腎病所導致的口渴感以及由過量攝入水分所導致的多尿癥狀。化合物-6改善患者組的這些癥狀。
詢問30名II型糖尿病患者的口渴情況，分4個等級進行評價，也就是(+++)非常強烈的口渴；(++)強烈的口渴；(+)口渴；和(-)不口渴。正如圖8所清楚地顯示，隨著用化合物-6治療的進展，情況有改善(第2周P＜0.005，第4周P＜0.005，第8周P＜0.001，第12周P＜0.001，與治療開始前的數據比較)。治療比例達到100％。
由于II型糖尿病是典型的慢性疾病，患者患有該疾病達15至20年也并不罕見。具有如此長期病史的患者會對大多數藥物沒有反應。在參與本實驗的患者中，8人患有該疾病達15至20年以上。值得注意的是盡管如此，所有病例的口渴和多尿癥狀都得到改善。收集尿液24小時所測量的尿糖水平也通過給藥化合物-6得以顯著減少。而且，由糖尿病性神經病所導致的癥狀(例如“慵懶”、“無力”、“厭煩”、“腿部肌肉疼痛”)也得到顯著改善。糖尿病并發癥可以認為屬于慢性炎癥的范疇。據認為，本發明化合物改善糖尿病并發癥的作用不是取決于改善代謝的作用，而是取決于對慢性炎癥的抗炎藥物作用的功能機理。
表18a給藥化合物-6對II型糖尿病厭煩的改善作用厭煩給藥前不久第4周第8周第12周總計是 14 10 2 0 26否 1 5 1315 34總計15 15 1515 60表18b給藥化合物-6對II型糖尿病無力的改善作用無力給藥前不久第4周第8周第12周總計是 25 15 6 1 47否 0 10 1924 53總計25 25 2525 100表18c給藥化合物-6對II型糖尿病神經痛的改善作用神經痛給藥前不久第4周第8周第12周總計是 12 76 2 27否 4 9 1014 37總計 16 16 1616 64實施例16本發明化合物與血清蛋白生成席夫堿本發明化合物在體內和體外都與血清蛋白的游離氨基快速反應，生成可逆的席夫堿。盡管本發明化合物顯示類視色素樣作用，它們并不表現象類視色素那樣強烈的毒性。這是因為本發明化合物在經由腸道吸收的過程中與血清蛋白反應，轉化為席夫堿，以致生物學活性被屏蔽了。另一方面，本發明化合物與蛋白質的氨基之間生成席夫堿的反應在體外中性或弱堿性水溶液中也快速進行著。已知在本發明的化合物中，化合物-1和化合物-26當在血液中以游離態存在時顯示強烈的毒性。例如，化合物-1的乙酰化衍生物(4-O-乙酰基殼二孢氯素化合物-5)不溶于水，但是通過使用表面活性劑HCO-60能夠在水中增溶，得到透明的液體。在這種狀態下，化合物-5分子不是溶解在水中，而是以小于可見光線波長的微膠束分散。因此，液體變得透明。當以這種狀態對動物口服給藥時，化合物-5經由消化道快速被吸收。當化合物-2僅以小劑量(2mg/kg)對大鼠給藥時，血壓降低，心臟在1至2小時內停止搏動。若隨時間推移采集血液以監測吸收動力學，則存在于血清中的不是化合物-5而是化合物-1。這是因為經由消化道吸收的化合物-5在血液中立即被酰基轉移酶分解。也就是不言而喻的是，體內存在的游離殼二孢氯素對循環系統具有強烈的毒性。不過，即使將懸浮在2％阿拉伯膠溶液中的化合物-5以100倍劑量(即200mg/kg)給藥時，大鼠也沒被殺死。當隨時間推移采集大鼠血液時，在血液中沒有檢測到游離的化合物-1。不過，血液中沒有檢測到游離化合物-1這一事實并不說明血液中不存在化合物-1。相反，可以證實已經給藥化合物-5的大鼠血液中存在如此高水平的化合物-1，以致超過游離化合物的致死劑量。
向已經給藥化合物-5懸液的大鼠血清中加入10倍量含有1％乙酸的乙腈，將混合物在室溫下放置1周。在藥物分子與蛋白質結合的情況下，藥物分子通常僅經由非共價鍵(例如疏水鍵、氫鍵、范德華鍵、離子偶極矩鍵等)與蛋白質微弱地結合。因此，加入有機溶劑并放置約1小時可以使藥物從蛋白質中解離出來。不過，已經給藥化合物-5給藥的大鼠血清中存在的殼二孢氯素在1小時后決不會從蛋白質中釋放出來。為了接近完全地回收與蛋白質結合的殼二孢氯素，需要將混合物在室溫下放置1周。而且，僅向已經給藥化合物-5的大鼠血清中加入有機溶劑(乙腈、乙醇、丙酮等)并不會使殼二孢氯素解離。也就是它直到加入乙酸使混合物酸化才會釋放。基于這些事實，據估計血液中存在的殼二孢氯素可能經由共價鍵與血清蛋白的氨基生成席夫堿。在醛基與氨基之間反應生成席夫堿時，在堿性條件下平衡向堿的生成方向移動，在酸性條件下向解離方向移動。為了釋放經由共價鍵與血清蛋白結合的殼二孢氯素，有必要通過酸化作用使平衡向左側移動。
隨后，向血清中加入化合物-6，檢查體外席夫堿的生成。化合物-6幾乎不溶于水，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的溶解度為0.8μg/ml。當向牛血清中分批加入溶于二甲基亞砜中的高濃度化合物-6時，化合物-6按800mg/ml(即1000倍)的比例溶于血清，血清變黃，取決于化合物-6的濃度。當向該黃色血清中加入有機溶劑(乙醇、乙腈等)時，有色物不溶于有機溶劑，但是沉淀出黃色血清蛋白。有機溶劑層不含化合物-6。不過，向該黃色沉淀中加入含有1％乙酸的乙腈并將混合物放置1周，可以定量回收化合物-6的乙腈溶液。在蛋白質與藥物分子之間的反應中，沒有考慮經由藥物與血清蛋白之間的體內共價鍵生成而轉化為新化合物。不過，顯然本發明化合物苯環內的醛基與血清蛋白的氨基在下列事實的基礎上生成席夫堿。(1)不能用任何常用的方法檢測已經給藥化合物的動物血清中的本發明化合物。(2)向血清中加入大量酸化的有機溶劑并在室溫下放置約1周，使本發明化合物釋放出來。(3)當體外向血清中加入時，本發明化合物以高達1000倍的比例溶解，并且可以通過與從已經給藥化合物的動物血清中回收本發明化合物所用相同的方法加以回收。(4)已經給藥化合物的動物血清或含有本發明化合物的血清變為黃色。(也就是可歸因于醛基的吸收消失，但是另一種可歸因于席夫堿的吸收出現了。)也就是說，本發明化合物的特征在于與血清蛋白的氨基生成席夫堿，這是發明的必然需要。
由本發明化合物與血清蛋白體內生成的席夫堿是不直接結合入細胞的屏蔽化合物，因此不快速地表現生物學活性(藥物作用或毒性)。為了發揮生物學活性，這樣的席夫堿應當經由胞吞作用進入細胞的囊泡，并進行蛋白質部分的水解，從而再生游離態的本發明化合物。因此，本發明化合物的給藥相當于生物學活性被屏蔽并且顯示緩慢作用和沒有副作用的化合物的給藥。
利用大鼠進行的試驗采用重約200g的雄性Wistar大鼠(n＝4)，血清所含有的化合物-1濃度以平均±SE表示(圖9)。
圖9中，空心圓表示化合物-5用HCO-60增溶并按2mg/kg劑量口服給藥的情況。如圖9所示，化合物-5經由消化道快速被吸收，在血液中被酰基轉移酶水解得到化合物-1。不過當游離的化合物-1達到如圖9所示濃度時，所有大鼠在給藥后1小時內死亡。
實心圓表示將化合物-5懸浮在阿拉伯膠溶液中并按20mg/kg劑量口服給藥的情況。向隨時間推移所采集的每份血清中加入含有1％乙酸的乙醇，將混合物在室溫下在暗處放置7天。然后用高效液相色譜法測定化合物-1。
空心正方形表示將化合物-5懸浮在阿拉伯膠溶液中并口服給藥的情況。然后在一定的時間點采集血液，之后立即用高效液相色譜法測定化合物-1。在這種情況下沒有檢測到化合物-1。另將懸浮在阿拉伯膠溶液中的化合物-5對已在門靜脈內插套管的大鼠口服給藥。然后隨時間推移采集門血液，測定化合物-1。類似于圖8所示情況，血清中不存在游離的化合物-1。也就是化合物-1全部是席夫堿型化合物，在含有乙酸的乙醇中放置1周后釋放出來。
本發明化合物與血清的反應將化合物-14、化合物-5和化合物-6分別溶于聚乙二醇-400，然后加入到牛血清中，濃度為500μg/ml，放置在室溫下。在一定的時間點對血清取樣，分成2份。向其中一份加入十倍量的乙腈，將混合物離心。然后測定血清中的游離化合物。向另一份中加入10倍量含有1％乙酸的乙腈。在室溫下放置1周后，將混合物離心，測定游離化合物(圖10)。
圖10清楚地顯示，通過加入乙腈而脫蛋白的血清中所剩余的每種化合物隨著時間的推移而減少。不過，這種減少僅僅是表面上的。如果向血清中加入含有1％乙酸的乙腈，混合物在室溫下放置1周，然后測定，在這種情況下，每種化合物的回收率為98至102％。在化合物-5的情況下，它是酰基化衍生物，在室溫下放置期間水解得到化合物-1，根據兩種化合物中每一種的所得水平計算化合物-5的轉化水平，以測定水平。另一方面，在加入含有1％乙酸的乙腈并在室溫下放置1周后，化合物-6和化合物-14可以接近定量地從離心后的上清液中回收。
權利要求
1.類視色素X受體配體，選自殼二孢氯素及其同系物，它們具有甲基苔黑醛部分和連接在所述甲基苔黑醛部分3-位上的類萜部分。
2.根據權利要求1的類視色素X受體配體，其中所述殼二孢氯素及其同系物選自由殼二孢氯素、氯柱枝菌素、4’-羥基-5’-氫殼二孢氯素、4’-乙酰氧基-5’-氫殼二孢氯素(氯尼菌素)、4’，5’-二氫殼二孢氯素及其類似物和通過所述甲基苔黑醛部分2-和/或4-位羥基的烷基化和/或酰基化作用所得衍生物組成的組。
3.化合物作為類視色素X受體配體的用途，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組。
4.用于治療和/或預防通過基因轉錄的類視色素X受體配體(RXRL)-依賴性調節作用得以減輕的疾病或病況的組合物，包含治療和/或預防所述疾病或病況有效量的化合物和藥學上可接受的添加劑，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組。
5.根據權利要求4的組合物，其中所述疾病或病況選自由胰島素抗性表達所導致的疾病、高血壓、腦血管病、類風濕性關節炎、自體免疫疾病、鈣代謝機能紊亂、糖尿病并發癥、經皮經腔冠狀血管成形術繼發的動脈再狹窄和器官移植繼發的動脈硬化。
6.用于預防朗格罕氏胰島β-細胞變性和/或壞死、以保持所述細胞的胰島素產生能力的組合物，包含預防所述細胞變性和/或壞死有效量的化合物和藥學上可接受的添加劑，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組。
7.根據權利要求4至6中任一項的組合物，其中所述添加劑是可溶于有機溶劑的合成脂族表面活性劑或聚合物。
8.用于治療和/或預防哺乳動物通過基因轉錄的RXRL-依賴性調節作用得以減輕的疾病或病況的方法，包括將治療和/或預防有效量的化合物和可選的藥學上可接受的添加劑對所述哺乳動物給藥，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組。
9.根據權利要求8的方法，其中所述疾病或病況選自胰島素抗性為特征的疾病、高血壓、腦血管病、類風濕性關節炎、自體免疫疾病、鈣代謝機能紊亂、糖尿病并發癥、經皮經腔冠狀血管成形術繼發的動脈再狹窄和器官移植繼發的動脈硬化。
10.預防哺乳動物朗格罕氏胰島β-細胞變性和/或壞死、以保持所述細胞的胰島素產生能力的方法，包括將預防所述細胞變性和/或壞死有效量的化合物和藥學上可接受的添加劑，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組。
11.根據權利要求8至10任一項的方法，其中所述添加劑是可溶于有機溶劑的合成脂族表面活性劑或聚合物。
12.有效量化合物的用途，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組，可選地與藥學上可接受的添加劑結合，用于治療和/或預防哺乳動物通過基因轉錄的RXRL-依賴性調節作用得以減輕的疾病和/或病況。
13.根據權利要求12的用途，其中所述疾病或病況選自胰島素抗性為特征的疾病、高血壓、腦血管病、類風濕性關節炎、自體免疫疾病、鈣代謝機能紊亂、糖尿病并發癥、經皮經腔冠狀血管成形術繼發的動脈再狹窄和器官移植繼發的動脈硬化。
14.化合物的用途，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組，可選地與藥學上可接受的添加劑結合，用于預防哺乳動物朗格罕氏胰島β-細胞變性和/或壞死、以保持所述細胞的胰島素產生能力。
15.根據權利要求12至14任意一項的用途，其中所述添加劑是可溶于有機溶劑的合成脂族表面活性劑或聚合物。
16.化合物在制備藥物中的用途，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組，可選地與藥學上可接受的添加劑結合，該藥物用于治療和/或預防哺乳動物通過基因轉錄的RXRL-依賴性調節作用得以減輕的疾病和/或病況。
17.根據權利要求16的用途，其中所述疾病或病況選自胰島素抗性為特征的疾病、高血壓、腦血管病、類風濕性關節炎、自體免疫疾病、鈣代謝機能紊亂、糖尿病并發癥、經皮經腔冠狀血管成形術繼發的動脈再狹窄和器官移植繼發的動脈硬化。
18.化合物在制備藥物中的用途，該化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組，可選地與藥學上可接受的添加劑結合，該藥物用于預防哺乳動物朗格罕氏胰島β-細胞變性和/或壞死、以保持所述細胞的胰島素產生能力。
19.根據權利要求16至18任一項的用途，其中所述添加劑是可溶于有機溶劑的合成脂族表面活性劑或聚合物。
20.由能夠充當類視色素X受體配體的化合物與血清蛋白的氨基所生成的席夫堿。
21.根據權利要求20的堿，其中所述化合物選自由權利要求2所定義的化合物組成的組。
全文摘要
最近發現公知的脂溶性抗生素殼二孢氯素及其同系物充當類視色素X受體的配體,體內與血清蛋白的氨基反應,生成不顯示任何類視色素副作用的席夫堿。殼二孢氯素及其同系物可用于治療和/或預防通過基因轉錄的類視色素X受體配體－依賴性調節作用得以緩解的疾病或病況(例如由胰島素抗性表達所導致的疾病、高血壓、腦血管疾病、類風濕性關節炎、自體免疫疾病、Ca代謝機能紊亂、糖尿病并發癥、動脈硬化等)。而且,它們還能夠抑制朗格罕氏胰島β－細胞的變性和/或壞死,因此可用于使這些細胞維持胰島素的產生能力。
文檔編號C07D213/80GK1334802SQ99816147
公開日2002年2月6日 申請日期1999年12月14日 優先權日1998年12月14日
發明者田村學造, 安藤邦雄, 馬替純二, 內田隆史 申請人:株式會社核內受容體研究所