遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒及其應用
【專利摘要】本發明公開了用于遲緩愛德華氏菌的hlyB基因擴增的引物對，所述引物對包括上游引物hlyB?III?F 和下游引物hlyB?III?R，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本發明還公開了遲緩愛德華氏菌的hlyB基因序列的擴增方法。本發明還公開了一種遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒。本發明還公開了遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒在魚類致病菌的檢測方面的應用。本發明還公開了遲緩愛德華氏菌的檢測方法。用本發明的方法可以快速準確地檢測無鱗魚體內或養殖水體是否含有致病菌，做到有針對性的防治魚病。
【專利說明】
遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及一種魚類致病菌的檢測領域，設及一種魚類致病菌檢測試劑盒W及檢 測方法，尤其設及一種遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 遲緩愛德華氏菌化dwardsiella tarda)是革蘭氏陰性短桿菌，愛德華氏菌屬，由 化Shina在1962年首次報道，是當前水產養殖業中的有著極大危害的病原菌之一。該菌的宿 主范圍非常廣泛，除可W感染多種魚類外，也有感染兩棲類、爬行類和哺乳類(包括人在內） 的報道。因此，為了對E. tarda進行及時診斷、監控和防治，建立一種快速、準確、簡便的 E. tarda檢測技術就具有重要意義。
[0003] 常規細菌鑒定方法包括對病原形態、生理生化水平及蛋白質水平等的鑒定，但由 于檢測靈敏度不高，測試項目較多和費時費力等缺點，不能滿足快速檢測的要求。近年來隨 著分子生物學、生化技術的快速發展，新的E.tarda的檢測方法得到了應用。目前分別建立 了基于hemolysin Jimbrial、gy;rB基因的polymerase chain reaction(PCR)檢測技術W及 E. tarda的間接化ISA檢測方法。W上方法較傳統的細菌常規鑒定具有快速、特異等優點，但 W上方法在應用中受到諸如制備抗原及抗體、需要PCR儀和凝膠電泳等專用設備的制約，在 生產中不能得到普及應用。巧光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，PCR)因其具有的簡便、快速、敏感、特異、適于早期和大量樣品檢測的優點，已在 病原檢測領域得到了廣泛應用。目前對于遲緩愛德華氏菌的檢測國內尚沒有相關的定量 PCR檢測技術方面的研究報告。為了及時控制養殖魚類魚病發生，迫切需要一種能快速檢測 魚體內或養殖水體中是否存在致病菌的技術。

【發明內容】

[0004] 發明目的:本發明所要解決的第一個技術問題是提供了一種用于遲緩愛德華氏菌 的hlyB基因擴增的引物對。
[0005] 本發明所要解決的第二個技術問題是一種遲緩愛德華氏菌的hlyB基因序列的擴 增方法。
[0006] 本發明所要解決的第=個技術問題是提供一種遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒。
[0007] 本發明所要解決的第四個技術問題是提供了一種遲緩愛德華氏菌的檢測方法。 [000引本發明的目的是提供用于巧光定量基因擴增法快速檢測E. tarda的引物及其應 用。首先通過生物信息學手段，針對E. tarda核巧酸序列具有種間保守及科、屬間特異的區 域作為引物組的設計區間，最后通過PCR條件優選確定最優條件。
[0009]技術方案:為實現上述目的，本發明提供了用于遲緩愛德華氏菌的hlyB基因擴增 的引物對，所述引物對包括上游引物h 1 y B-III-F和下游引物h 1 yB-II I-R，所述引物對的核 巧酸序列如沈Q ID NO:5和沈Q ID NO:6所示。
[0010]上游引物 hlyB-III-F:
[0011] 5 '-CTGCTGATGTCCACCCTACA-3 '；
[0012] 下游引物 hlyB-III-R:
[0013] 5'-CGCTGTAAATTCTCCAGCCC-3'。
[0014] 作為優選，本發明所采用的上游引物hlyB-III-F和下游引物hlyB-III-R的濃度比 是 1:1。
[0015] -種遲緩愛德華氏菌的hlyB基因序列的擴增方法，包括W下步驟：
[0016] 1)生物信息學方法設計引物組及進行引物篩選得到如所述的引物對：
[0017] 2)遲緩愛德華氏菌的hlyB基因的巧光定量PCR檢測:遲緩愛德華氏菌基因組DNA的 提取，將基因組DNA進行常規PCR檢測獲得陽性DNA樣品；
[001引3) W上述的陽性DNA樣品為模板，將所述的引物對擴增遲緩愛德華氏菌的基因組 DNA序列得到PCR產物；
[0019] 4)PCR擴增產物分析并測序。
[0020] 上述步驟1)通過巧光定量PCR進行引物PCR擴增效率檢測從而篩選得到所述的引 物對。
[0021] -種遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒，它包含所述的引物對。
[0022] 所述試劑盒包括：
[0023] 1)遲緩愛德華氏菌反應液和化q聚合酶:遲緩愛德華氏菌反應液包括含有dNTPs、 buffer、MgCl2、SYBR green I、肥PC水及所述的引物對的混合液；
[0024] 2)強陽性對照品：
[0025] 3)臨界陽性對照品；
[0026] 4)DNA 提取液；
[0027] 5)陰性對照品。
[002引其中，上述遲緩愛德華氏菌反應液是由10Xbuffer，dNTPs、10000XSYBR green I、DEPC水、引物對的混合物配制而成。
[00巧]本發明的DNA提取液為chelex-100。
[0030] 所述的強陽性對照品是重組質粒pBlue-hlyB-I，所述重組質粒的核巧酸序列如 沈Q ID NO:7所示。
[0031] 上述的遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒在魚類致病菌的檢測方面的應用。
[0032] 遲緩愛德華氏菌的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法是實時巧光定量PCR檢測 方法。
[0033] 上述檢測方法具體包括W下步驟：
[0034] 1)提取魚取樣組織的DNA得到樣品DNA;
[0035] 2)建立反應體系進行實時巧光定量PCR;
[0036] 3)通過比對標準品實時巧光定量PCR擴增曲線確定是否感染遲緩愛德華氏菌。
[0037] 上述的檢測方法，所述步驟2)中的反應體系為：SpmolAiL的上游引物hlyB-III-F lyL，5pmol/化的下游引物hlyB-III-R 1化，樣品DNA化L，5U Taq DNA聚合酶的0.6化，3y LDEPC水，2 X進口實時巧光PCR緩沖液12.5祉;所述12.5化的2 X進口實時巧光PCR緩沖液是 2.5化的 10Xbuffer、2化的IOmM dNTP、0.0025化的 10000 XSY服 green IW及祉LDEPC水的 混合物；所述PCR反應條件為：先防污染37°C5min;然后預變性95°C3min ;最后擴增95°C 10sec，60°C40sec，共40個循環，在每個循環的延伸結束時進行巧光信號檢測。
[0038] 有益效果:與現有技術相比，本發明的優點如下：
[0039] 1、首次提供了遲緩愛德華氏菌hlyB巧光定量PCR檢測中的專用引物，使利用巧光 定量PCR檢測對待測樣本中的遲緩愛德華氏菌hlyB基因進行檢測成為可能。
[0040] 2、本檢測方法與遲緩愛德華氏菌其它常規檢測方法如細菌的分離培養鑒定、酶聯 免疫吸附化ISA法和普通PCR相比，靈敏度和特異性極高，檢測效率得到了很大的提高，并且 有效的防止了污染。
[0041] 3、本檢測方法與遲緩愛德華氏菌的其它常規檢測方法，如細菌的分離培養鑒定、 酶聯免疫吸附化ISA法和普通PCR相比，具有操作程序簡單易用的特點，本試劑盒可用于操 作程序化，適合大面積推廣和應用。
[0042] 4、本檢測方法不僅能夠評價魚體的遲緩愛德華氏菌感染狀況，同時也可用于水體 或環境中遲緩愛德華氏菌的檢測。
[0043] 綜上所述，本發明能為快速、準確地檢測出遲緩愛德華氏菌提供了保證，對預防疾 病，科學用藥，和保障魚類健康提供了保障。依據本發明的專用引物的檢測方法及試劑盒可 用于魚類主要患病組織(觸，體表)及水體或環境中遲緩愛德華氏菌hlyB基因的核酸檢測， 應用前景廣闊。
【附圖說明】
[0044] 圖1是采用=對引物對分別對于遲緩愛德華氏菌的目標祀基因進行擴增后的電泳 圖；
[0045] 圖2是采用=對引物對對遲緩愛德華氏菌及六種非祀標魚類致病菌的目標祀基因 進行擴增后的電泳圖；
[0046] 圖3是利用第S對引物hlyB-111-FAlyB-III-R進行的標準品實時巧光定量PCR擴 增曲線圖；
[0047] 圖4是利用第S對引物hlyB-111-FAlyB-III-R對病魚DNA樣本進行檢測PCR擴增 曲線圖。
【具體實施方式】
[0048] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。W下實施例是為了對本發明作 進一步詳細說明，并非對發明的限制。本發明的實驗方法均參照《精編分子生物學實驗指 南KF.M.奧斯伯等主編，科學出版社2005年出版)所建議的實驗條件。
[0049] 實施例1:用于對遲緩愛德華氏菌hlyB基因進行巧光定量PCR檢測的引物設計及篩 選
[0050] 1.生物信息學方法設計引物及進行引物篩選
[0化1 ] 下載GenBank收錄的遲緩愛德華氏菌的全序列（GeneBank:CP006664)，同時下載陰 性對照菌hlyB基因，陰性對照菌包括黃桿菌、河弧菌、巧光假單胞菌、維氏氣單胞菌和嗜水 氣單胞菌相關物種，所有對照細菌均來自中科院水生所分離保存的細菌，請見下表。通過 Clustal X進行比對后，選擇合適區域設計引物，該區域在遲緩愛德華氏菌種內保守，但相 對于陰性對照至少存在10%-30%的差異，選定區域后采用ABI Primer E邱ress 3.0實時 巧光定量PCR引物設計軟件，設計合成引物。引物中允許同一變異位點允許2個及2個W下簡 并堿基。將所提取的備選引物滿足W下要求進行篩選:①引物長度化)在19-28bp之間；②Tm 值在58-60°C之間；⑧GC%在25-75%之間；④polyN《4bp;⑤化irpin《4bp;⑥覆蓋率〉 90% ;⑦擴增產物長度控制在50-250bp之間；⑧進行BLAST篩選，特異性分數乂 X0.4。所用 PCR引物由上海生工公司合成，引物要求PAGE純化，到貨時為引物干粉，用無菌水復溶后，對 干粉進行含量測定，引物至lOOpmol/化膽存液后備用。
[0052] 針對遲緩愛德華氏菌hlyB基因，共設計了3組上下游引物，序列如下：
[0053] hlyB-I(160bp)
[0054] 上游引物11178-1斗：5'-16〔(：口'6(：7^(：口'41'1'1'(：1'-3'；
[0 化 5]下游引物 hlyB-1-R: 5 ' -TGGTCGATAAGGCGGTTTTG-3 '
[0056] hlyB-II(237bp)
[0化7]上游引物11178-11斗：5'-144(：口'6口'641610：4〔0：-3'；
[0化引 下游引物 hlyB-11-R: 5 ' -TCCAGCCCCTGTTCGATATC-3 '
[0059] hlyB-III(24化P)
[0060] 上游引物11178-111斗：5'-口'6押64161〇：40(：口'4〔4-3'；
[0061 ]下游引物 hlyB-II I-R: 5 ' -CGCTGTAAATTCTCCAGCCC-3 '
[0062] LUUOO」 Z .刀、了生'物子頭聰化竹引'物恆觀U
[0064] 2.1、實驗材料及試劑：
[0065] 材料:魚類常見致病菌黃桿菌、河弧菌、巧光假單胞菌、維氏氣單胞菌和嗜水氣單 胞菌。五個菌株均來自中科院武漢水生生物研究所。使用前均用相應的培養基活化，并分別 用細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取基因組DNA。將提取的基因組DNAlO倍梯度稀 釋，用于評價PCR體系的特異性和靈敏度。
[0066] 試劑：5U/]iL !"aq DNA polymerase(P;romega，含IOXreaction buffer和25mMMg2+ )、10mM (INTPs(Promega)、DNA marker I(Tiangen) ;Millipore 出0高壓滅菌后分裝，于-20 °C保存備用。
[0067] 2.2引物、菌株測試
[0068] 用常規PCR測試所設計的引物和購買的菌株，PCR反應體系根據各組分的濃度配 審IJ，擴增程序根據引物的TM值及產物的大小編寫。常規PCR擴增在Bio-Rad Mycycler梯度擴 增儀上進行，瓊脂糖凝膠電泳結合凝膠成像系統檢測所得到的PCR產物。
[0069] 2.3 結果
[0070] 2.3.1遲緩愛德華氏菌
[0071 ] A.常規PCR測試購買的細菌及設計的引物
[0072] 設計的 S對引物序列如下：hlyB-I-F/hlyB-I-R、hlyB-II-F/hlyB-II-R、hlyB- III-FAlyB-III-R;從圖1可W看出，對于遲緩愛德華氏菌，所設計的S對引物對均可擴增 出祀標條帶，表明購買的遲緩愛德華氏菌、自行設計的引物W及使用的PCR擴增體系均可用 于后續的實驗。
[0073] B.常規PCR檢測體系的特異性
[0074] 對于常見的五種非祀標魚類致病菌，使用建立的常規PCR檢測體系均為檢測陰性， 對遲緩愛德華氏菌為檢測陽性，運表明所建立的常規PCR檢測體系具有極好的特異性，可W 用于遲緩愛德華氏菌的快速檢測(如圖2所示）。
[0075] 3.巧光定量檢測引物擴增效率
[0076] 3.1陽性對照物及標準模板的制備
[0077] 用建立的常規PCR體系擴增遲緩愛德華氏菌的基因組，2%瓊脂糖凝膠電泳分離得 到特定的祀標條帶。用干凈的手術刀切下包含祀標條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (天根生化科技(北京)有限公司）回收祀標DNA。將回收的部分DNA加入到連接體系中（1化L， 含線性克隆載體、連接酶和連接酶buffer)，16°C連接過夜。次日，將全部的連接產物轉化到 制備好的大腸桿菌感受態，并涂布于含有氨節青霉素的LB平板，37°C培養至長出菌落。挑取 菌落并制備成菌懸液，使用載體引物及菌落PCR驗證并挑選陽性克隆子。將陽性克隆子對應 的細菌于LB液體培養基中培養過夜，并取ImL提取質粒DNA(普通質粒小提試劑盒，天根生化 科技(北京)有限公司），從而得到陽性對照物。現憶提取的質粒DNA的濃度，稀釋到一定倍數 作為陽性對照用于PCR檢測。
[007引 3.2引物PCR擴增效率檢測
[0079] 引物的篩選原則為:在目的保守區中選擇PCR擴增效率較高的引物作為候選引物。
[0080] 3.2.1梯度模板準備
[0081 ]將陽性對照物DNA(上述3.1所得），用無菌水W10倍梯度稀釋，作為巧光定量PCR反 應體系優化用模板。取1 〇-4、1 〇-5、1 〇-6、1 〇-7、1 〇-8、1 〇-9稀釋度，編號依次對應為Ll、L2、L3、L4、 L5、L6。分裝后于-70°C保存備用。
[0082] 3.2.2巧光定量PCR緩沖液及PCR程序
[0083] PCR反應體系為：上游引物1.扣L (5pmo 1 /化），下游引物1.扣L (5pmo 1 /化），樣品DNA 扣L，hq DNA聚合酶（5U)0.化L，化L DEPC水，2 X進口實時巧光PCR緩沖液的12.5化；12.扣L 的2 X進口實時巧光PCR緩沖液是2.5化的Takara公司的10 X buffer，化L的IOmMdNTP、 0.0025化的10000XSY服green IW及祉LDEPC水的混合物配制而成;PCR反應條件為：先防 污染37 °C 5min;然后預變性95 °C 3min;最后擴增95 °C IOsec，60°C40sec，共40個循環，在每個 循環的延伸結束時進行巧光信號檢測，結果如表1所示。
[0084] 3.2.3 結果
[0085] 表 1 r00861
[0087] 注:表格中注明值為Ct值。
[0088] 根據擴增效率來看，選擇HI號引物對hlyB-111-FAlyB-III-R繼續后續實驗。
[0089] 實施例2:巧光定量PCR引物用量的優化
[0090] 1、巧光定量PCR引物用量的第一次優化
[0091] 用稀釋好的Liao-4)和L2(l〇-5)陽性對照DNA作為引物量優化的模板，分別對引物 的上下游的用量在5.0-12.5pmo 1范圍內進行梯度稀釋優化，PCR反應體系為:上下游引物量 見表2，樣品DNA扣L，hq DNA聚合酶(5U)0.化L，實時巧光PCR緩沖液(2 X ) 12.扣L(2.扣L的 hkara 公司的 10 X buffer, 2 化的 IOmMdNTP W 及的 10000 X SYBR green I 0.0025化和祉 LDEPC水的混合物配制而成），補充無菌水至25化。PCR反應條件為:先防污染37°C5min;然后 預變性95 °C 3min;最后擴增95 °C IOsec，60°C40sec，共40個循環，在每個循環的延伸結束時 進行巧光信號檢測。結果如表2所示，從結果可W分析出，PCR引物在5.0-12.5pmol/反應時 均可W正常工作，其中引物組合（1.0化X SpmoleAiU 2.0化X SpmoleAiL)、（1 .OiiLX 5pmole/]iL、2.5化 X 5pmole/]iL)、（ 1.5化 X 5pmole/]iL、2.0化 X 5pmole/]iL)、（ 1.5化 X 5pmole/]iL、1.5化 X 5pmole/]iL)，（2.0化 X 5pmole/]iL、2.5化 X 5pmole/]iL)、（2.5化 X SpmoleAiL、1.5化X SpmoleAiL)反應效率最高，將上游引物量1.5-2.0化X SpmoleAiL、下游 引物量2.0-2.5化X 5pmo 1 e/jiL作為引物用量進行第二次篩選。
[0092] 表2:實時巧光定景PCR引物用景的第一次優化結果
[0093]
123 注：表格中注明值為Ct值，"1.0，1.5，2.0，2.5"為2扣LPCR體系中引物（濃度為 SpmoleAiL)的用量(化）。 2 2、巧光定量PCR引物用量的第二次優化 3 為測試不同引物用量組合對于試劑靈敏度的影響，選用濃度更低的DNA模板進行 巧聯。使用提取的DNA(實施例1中擴增得到)進行梯度稀釋取L3(l(T6)、L4(l(r7)，L5(l(r 8)作 為第二次引物量優化的模板，對各組引物在第一次優化基礎上進一步進行優化。PCR反應體 系為：上下游引物量見表3，樣品DNA化L，化姐魁聚合酶（5U) 0.化L，實時巧光PCR緩沖液（2 X ) 12.化L(用購自 hkara公司的 10 X buffer 2 .化L，化L的 IOmMdNTPW及的 10000 X SYBR green I 0.0025化和祉LDEPC水的混合物配制而成），補充無菌水至25化。PCR反應條件為： 先防污染37°C5min;然后預變性95°C3min;最后擴增95°C10sec，60°C40sec，共40個循環，在 每個循環的延伸結束時進行巧光信號檢測。結果如表3所示，本次優化上游引物在7.5pmol， 下游引物在12.5pmol時檢測結果較好，選擇此濃度為本發明實時巧光定量PCR引物的使用 濃度。
[0097]表3實時巧光定量PCR引物用量的第二次優化結果，
[009引
[0099]
[0100] 巧：巧祗甲巧巧但刃。1但，--i . U，i . ，Z . U，Z . 刃扣化尸^則本系中引物（濃度為 SpmoleAiL)的用量(化）W上優化結果表明，本發明遲緩愛德華氏菌實時巧光定量PCR檢測 試劑的基本組成和各組分含量基本如表4所示。
[0101] 表4遲緩愛德華氏菌實時巧光定量PCR檢測試劑的基本組成和各組分含量
[0102]
L〇1〇3」實施例3:遲緩愛德華氏菌hlyB基因巧光定量PCR檢測
[0104] 1.標準曲線的建立
[0105] 1.1將陽性對照質粒pBlue-hlyB-I(按照《精編分子生物學實驗指南》的流程制備 的常規重組質粒）用為模板進行巧光定量PCR檢測，建立標準曲線。具體操作如下：將質粒 DNA進行10倍系列稀釋成1:1.0 X 10"拷貝/化;II: 1.0 X IO9拷貝/化;III: 1.0 X IO8拷貝Ai レIV:1.0X107拷貝/化;V:1.0X106拷貝/化;VI:1.0xl05拷貝/化;VII:1.0X104拷貝/化； v^I:l.oxlo3拷貝/化;Ix:l.oxlo2拷貝/化;x:l.oxlol拷貝l化;xI:l.oxloo拷貝A^L。每 個稀釋度重復平行試驗3次。標準品檢測PCR反應體系為：上游引物化L(SpmolAiL),下游引 物化L(5pmo 1 /化），質粒DNA扣L，hq DNA聚合酶（5U)0.化L，實時巧光PCR緩沖液（2 X ) 12.5 化（用購自化kara公司的 10 Xbuffer 2.5化，2化的IOmMdNTPW及的 10000 X SYBR green I 0.0025化和祉LDEPC水的混合物配制而成），補充無菌水至25化。PCR反應條件為:先防污染 371：5111111;然后預變性951：3111111;最后擴增95°(：1036(3,601：4036(3，共40個循環，在每個循環 的延伸結束時進行巧光信號檢測。標準品實時巧光定量PCR擴增曲線如圖3所示（圖3,橫坐 標為Ct值，縱坐標為巧光值，1:1.0 X l〇w拷貝/化;2:1.0 X IO9拷貝/化;3:1.0 X IO8拷貝Ai レ4:1.0X107拷貝/化;5:1.0X106拷貝/化;6:1.0xl05拷貝/化;7:1.0X104拷貝/化;8:1.0 X 1〇3拷貝/化;9:1.0 X 1〇2拷貝/化;10:1 .OX 10l拷貝化レ 11:1 .OX 10*^拷貝/化。）
[0106] 1.2標準曲線的繪制
[0107] 根據所得Ct值與其對應的標準品的對數值繪制標準曲線（圖3,橫坐標為拷貝數的 對數，縱坐標為Ct值），由圖3可知，實時巧光定量PCR檢測的線性范圍是I X IO8~I X IO2拷 貝/反應體系，標準曲線的相關系數R平方值為1.003 (y = -3.1365X+36.201)，巧光定量PCR 反應的擴增效率為99.6%。標準曲線顯示:本發明建立的遲緩愛德華氏菌hlyB基因實時巧 光定量PCR檢測方法有9個數量級的線性檢測范圍，進一步說明該檢測方法的具有非常高的 靈敏度。
[0108] 2.實時巧光定量PCR法檢測20份魚類樣本
[0109] 2.1提取魚取樣組織的DNA
[0110] 采集了 10份患病及疑似患病的草魚樣品及10份健康草魚樣品，使用Chelex-IOO (Bio-Rad)煮沸法快速提取DNA。方法如下：取一小塊觸組織塊，加入20化L Millipore出0， 搗爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12 ,OOOrpm離屯、Imin,棄上清，加入200y LMillipore出0重懸。充分混勻后取50化加入到200化6%的chelex-100中，混勻，56°C保溫 20min，劇烈震蕩混勻后于100°C保溫8min，劇烈震蕩，并于12,000離屯、3min，取上清作為PCR 的模板，用建立的常規PCR檢測體系進行檢測。剩余的模板于-2(TC保存W備復檢。
[0111] 2.2用實施例1，2中建立的方法檢測病魚DNA樣本
[0112] 病魚檢測PCR反應體系為：上游引物化L(SpmolAiL),下游引物化L(SpmolAiL),質 粒DNA扣L，抓化q DNA聚合酶的0.化L，化L DEPC水，2 X進口實時巧光PCR緩沖液的12.5y L 12.5化的2 X進口實時巧光PCR緩沖液是2.5化的Takara公司的10 X buff er，2化的 lOmMdNTP、10000 XSYBR green I 0.0025化W及祉LDEPC水的混合物配制而成。PCR反應條 件為:先防污染37°C5min;然后預變性95°C3min;最后擴增95°C10sec，60°C40sec，共40個循 環，在每個循環的延伸結束時進行巧光信號檢測。標準品實時巧光定量PCR擴增曲線如圖4 所示（圖4,橫坐標為Ct值，縱坐標為巧光值），結果顯示：W確診的10份遲緩愛德華氏菌感染 魚標本DNA為模板時出現了目的模板時出現了目的巧光擴增曲線，W其余10份樣本的DNA為 模板時，均無擴增曲線。
[0113] 實施例4:遲緩愛德華氏菌hlyB基因巧光定量PCR檢測試劑盒
[0114] 遲緩愛德華氏菌hlyB基因巧光定量PCR檢測試劑盒包括各自獨立包裝的遲緩愛德 華氏菌反應液Iml/管和化q聚合酶巧U，每個反應0.化L)30ul/管，兩試劑管再共同組裝在一 外包裝盒中。其中，遲緩愛德華氏菌反應液為含有dNTPs、MgCl2、SYBR green I及引物混合 液，由12.5化的2 X buf f er (用購自hkara公司的10 X buf f er 2.5化，2化的1 OmM dNTP W及 的10000XSYBR green I 0.0025化和祉LDEPC水的混合物配制而成）、實施例2確定的hlyB- III組合中化L上游引物、1化下游引物和1.化L的DEPC水按比例混合，配制時將每一組分乘 W -個系數(如10000,根據生產量定），混勻后，分裝，每支ImL為方便檢測，試劑盒還可W包 括另外各自獨立包裝的強陽性對照品（1〇-5稀釋度的陽性對照品質粒L2)、臨界陽性對照品 (1〇-8稀釋度的陽性對照品質粒L5)、DNA提取液(配方為：chelex-100)及陰性對照品（無菌 水），并與遲緩愛德華氏菌反應液和Taq聚合酶試劑管共同組裝在外包裝盒中。PCR反應體 系：上游引物1.化L (5pmo 1 /化），下游引物2.扣L(5pmo 1 /化），樣品DNA化L，hq DNA聚合酶 (5U) 0.化L，實時巧光PCR緩沖液（2 X ) 12.扣L(用購自hkara公司的10 X buf f er 2. ，化L 的IOmMdNTPW及的10000XSY服green I 0.0025化和祉LDEPC水的混合物配制而成），補充 無菌水至25化。PCR反應條件為：先防污染37°C5min;然后預變性95°C3min;最后擴增95°C IOsec，60°C40sec，共40個循環，在每個循環的延伸結束時進行巧光信號檢測。結果表明（表 5，經過5次重復測定結果比較穩定，確定為本發明試劑盒的陽性對照。
[0115] 表5陽性對照的測試結果 「01161
L〇117」實施例5:遲緩裳德華氏菌hlyB基因巧光定量PCR檢測試劑盆的性能評估
[0118] 為對本發明試劑盒的性能進行評估，按照產品優化后的工藝多次配制出產品小樣 對試劑盒的靈敏度、特異性、精確度、W及穩定性，W及用試生產的產品進行臨床試驗，W考 查產品的性能。
[0119] 1、試劑盒檢測的線性范圍和靈敏度測試將遲緩愛德華氏菌hlyB基因人工構建質 粒地lue-hlyB-I用DEPC水稀釋液進行10倍系列梯度稀釋至1(T9,即靈敏度質控品（取Liao ―4稀釋度）、L2(10-5稀釋度）、L3(l〇-6稀釋度）、L4(l〇-7稀釋度）、L5(l〇- 8稀釋度）、L6(l〇-9稀釋 度)作為評價試劑盒靈敏度的質控品，編號L1-L6。分裝后于-70°C保存備用），使用本發明試 劑盒進行檢測。PCR反應體系：上游引物化L(5pmo 1 /化），下游引物化L(5pmo 1 /化），樣品DNA 5化，Taq DNA聚合酶（5U)0.化L，實時巧光PCR緩沖液（2 X ) 12.化L(用購自hkara公司的的 IOXbuffer 2.5化，2化的IOmMdNTPW及的 10000 X SYBR green I 0.0025化和祉LDEPC水的 混合物配制而成），補充無菌水至25化。PCR反應條件為:先防污染37 °C 5min;然后預變性95 °C3min;最后擴增95°C10ec，60°C40sec，共40個循環，在每個循環的延伸結束時進行巧光信 號檢測。結果(表6)顯示，1〇-9稀釋度(L6)樣本不能檢出，在1〇-8稀釋度(L5)時候試劑盒多數 情況下均可檢出，所W本發明試劑盒最低可檢出含1(T8稀釋度的遲緩愛德華氏菌hlyB基因 人工構建質粒，具有較高的靈敏度。對不同批次的產品小樣進行靈敏度及線性分析，結果顯 示引物均可穩定測出IO-S稀釋度的DNA樣品，對于1〇-9稀釋度樣品，本發明試劑盒不能檢出。 故設1(T8稀釋度為最低檢出值。
[0120] 表6本發明試劑盒線性范圍的測試結果 「ni勺11 Lm 22」2、試刑盒粒測的特弁巧分化
[0123] 采用不同批次的產品小樣對5種主要魚類致病菌(魚致病菌黃桿菌、河弧菌、巧光 假單胞菌、維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌)進行檢測。PCR反應體系：上游引物化USpmolAi 1)，下游引物1化（5口111〇1/化），樣品0歴5化，樣品0麻扣1^，51]1曰9〇論聚合酶的0.化1^，化 LDEPC水，2 X化kara實時巧光PCR緩沖液的12.5化；12.扣L的2 X化kara實時巧光PCR緩沖液 是2.化L的hkara公司TM的 10 Xbuffer，2化的lOmMdNTP、10000X SYBR green I 0.002扣L W及祉LDEPC水的混合物配制而成。PCR反應條件為：先防污染37 °C5min;然后預變性95 °C 3min;最后擴增95 °C IOsec，60°C40sec，共40個循環，在每個循環的延伸結束時進行巧光信 號檢測。結果(表7)N1-N5均未檢出Ct值，證明本發明的試劑盒具有良好的特異性。
[0124] 表7本發明試劑盒特異性的測試結果 r〇125l

[01%] 3、試劑盒的準確性測定
[0127] 采用測序方法進行確認本發明試劑盒的準確性。對擴增產物進行測序，序列與預 期結果完全一致，證明本發明試劑盒的檢測結果是準確的。
[0128] 4、試劑盒的穩定性測定
[0129] (1)試劑盒的穩定性
[0130] 產品的穩定性取決于各個組成成份的穩定性。本發明中配制遲緩愛德華氏菌實時 巧光定量PCR反應液、Taq DNA聚合酶、陽性對照品在實驗室使用中，在-20°C保存，取出后一 直保存至4°C冰箱，最長保存一周仍未見性能下降。
[0131] 在為臨床試驗準備的產品運輸中，全套產品（包括遲緩愛德華氏菌實時巧光定量 PCR反應液、Taq DNA聚合酶、試劑盒對照品），在先后經歷為期3天的-20°C冷凍、4°C長途運 輸、-2(TC冷凍、復融等一系列往返過程，使用質控品檢測，檢測結果未見有顯著差異。表明 本發明試劑盒的各個組份相當穩定。
[0132] (2)對照品的穩定性
[0133] 對照品的穩定性對試驗結果的分析判斷有很大影響，本試劑盒的對照品主要為了 對反應體系進行質量控制。本試劑盒使用了一份強陽性對照、一份臨界陽性和一份陰性對 照，對其進行凍融檢測。實驗結果如表9所示，結果表明本發明試劑盒中的對照品也具有良 好的穩定性。
[0134] 表9陽性對照品的凍融試驗結果
[0135]
LUUW 上所化化是本發巧的1 兀選買砸萬巧，應當指出：卿十本巧不領項的晉迪巧不人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可W做出若干改進和潤飾，運些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 用于遲緩愛德華氏菌的hlyB基因擴增的引物對，其特征在于，所述引物對包括上游 引物hlyB-III-F和下游引物hlyB-III-R，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6所示。2. -種遲緩愛德華氏菌的hlyB基因序列的擴增方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 生物信息學方法設計引物組及進行引物篩選得到如權利要求1所述的引物對； 2) 遲緩愛德華氏菌的hlyB基因的熒光定量PCR檢測：遲緩愛德華氏菌基因組DNA的提 取，將基因組DNA進行常規PCR檢測獲得陽性DNA樣品； 3)以上述的陽性DNA樣品為模板，將權利要求1所述的引物對擴增遲緩愛德華氏菌的 基因組DNA序列得到PCR產物； 4)PCR擴增產物分析并測序。3. 根據權利要求2所述的一種遲緩愛德華氏菌的hlyB基因序列的擴增方法，其特征在 于，所述步驟1)通過熒光定量PCR進行引物PCR擴增效率檢測從而篩選得到權利要求1所述 的引物對。4. 一種遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒，它包含權利要求1所述的引物對。5. 根據權利要求4所述的遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 括： 1) 遲緩愛德華氏菌反應液和Taq聚合酶：遲緩愛德華氏菌反應液包括含有dNTPs、 buffer、MgCl2、SYBR green I、DEPC水及權利要求1所述的引物對的混合液； 2) 強陽性對照品： 3) 臨界陽性對照品； 4. DNA提取液； 5) 陰性對照品。6. 根據權利要求5述的遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述遲緩愛德華氏 菌反應液是由10 X buffer，dNTPs、10000 X SYBR green I、DEPC水、引物對的混合物配制而 成。7. 權利要求4~6任一項所述的遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒在魚類致病菌的檢測方面 的應用。8. 權利要求4~6任一項所述的遲緩愛德華氏菌的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法 是實時熒光定量PCR檢測方法。9. 根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法具體包括以下步驟： 1) 提取魚取樣組織的DNA得到樣品DNA; 2) 建立反應體系進行實時熒光定量PCR; 3) 通過比對標準品實時熒光定量PCR擴增曲線確定是否感染遲緩愛德華氏菌。10. 根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟2)中的反應體系為:5pmol/ yL的上游引物hlyB-III-F lyL，5pmolAxL的下游引物hlyB-III-R lyL，樣品DNA5yL，5U Taq DNA聚合酶的0.6 yL，3yLDEPC水，2 X實時熒光PCR緩沖液12.5uL;所述12.5yL的2 X實時熒 光PCR緩沖液是2.5yL的 10Xbuffer、2yL的IOmM dNTP、0.0025yL的 10000XSYBR green I以 及8yLDEPC水的混合物;所述PCR反應條件為:先防污染37 °C 5min;然后預變性95 °C 3min;最 后擴增95°C IOsec，60°C4〇sec，共40個循環，在每個循環的延伸結束時進行熒光信號檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK105925683SQ201610316398
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月13日
【發明人】鄒紅, 熊凡, 張金, 李文祥, 吳山功, 王桂堂
【申請人】中國科學院水生生物研究所, 武漢轉導生物科技發展有限公司