一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標記gga-miR-34a-5p及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程技術領域，提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子 標記gga-miR-34a-5p及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)為革蘭氏陰性菌，是世界公認的食源性 致病菌之一，不僅對蛋雞生產造成重大影響，而且它能通過家禽副產品給人類的健康帶來 很大的威脅。這種病菌主要是通過動物性產品包括禽肉，雞蛋和奶類及奶制品等導致人中 毒甚至死亡。因此如何獲得抗性高的遺傳個體成為亟待解決的問題之一。
[0003] 小RNA(miRNA)是一類長度約22nt的內源性非編碼小RNA，與靶基因非翻譯 區）結合在轉錄后水平調控靶基因的表達，在細胞增殖、分化、凋亡、神經發育、脂肪代謝等 多個生物學過程中發揮重要作用。

【發明內容】

[0004]本發明的發明人針對上述現有技術的情況，結合長期研究和探索，提供了一種雞 腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標記及其檢測方法，該抗性分子標記為雞miRNAgga-miR-34a-5p，發明人經過研究發現，gga-miR-34a-5p可以通過調控N0TCH2基因的表達調控 腸炎沙門氏菌對雞的感染，因此gga-miR-34a-5p可以作為腸炎沙門氏菌感染抗性檢測的分 子標記，發明人進一步提供了其檢測方法，從而為雞的抗病遺傳育種奠定基礎。
[0005]發明人提供的具體技術方案如下：
[0006]發明人首先提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標記，該抗性分子標 記為雞miRNAgga-miR-34a-5p，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示；
[0007]發明人進一步給出了該分子標記的檢測方法如下：
[0008] gga-miR-34a-5p的表達量檢測
[0009]miRNA反轉錄
[0010] 用OneStepPTi.ffie.S:e.Tipt?.miRNAcDNASynthesisKit(PerfectRealTime)試 劑盒，嚴格按說明書進行。反轉錄體系為20yL(具體見表1)。反應程序為:37°C，60min; 85°C， 5s;反應完成后獲得的cDNA置于-20°C保存備用；
[0011] 表1miRNA反轉錄體系(20μυ
[0012]
[0013 ]其中所述的盲腸總RNA為雞盲腸總RNA，采用常規方法獲得，
[0014] gga-miR-34a_5p焚光定量PCR
[0015] 根據gga-miR-34a_5p成熟序列設計引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合 成。利用所設引物，采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPrimeScriptTM miRNART-PCRKit說明書，在StratageneMX3000P熒光定量PCR儀上進行擴增，反應體系如 表3所示。
[0016] 表2miRNA定量檢測引物
[0017]
[0018]其中〉gga_34a_5p和U6分別作為ForwardqPCRPrimer，而Uni-miRqPCRPrimer 選用試劑盒中自帶引物；
[0019] 熒光定量PCR反應程序采用兩步法:95°C預變性30s，l個循環;95°C5s，60°C30s，40 個循環；最后添加溶解曲線(95°Clmin，62°C30s，95°C30s)，1個循環，每個cDNA樣品重復三 次。以U6作為內參基因，用方法來計算miRNA的相對表達量，用SAS8.1軟件中單因素方 差分析對miRNA表達量差異進行分析。
[0020] 表3熒光定量PCR體系（20μυ
[0021]
[0022]發明人為了驗證上述gga-miR-34a-5p的功能采用了革Ε1基因檢測的方式，利用TargetScan及miRanda等軟件預測到N0TCH2是gga-miR-34a-5p的革E基因。結果發現通過分 別比較腸炎沙門氏菌感染組與未感染組中miRNA與革E1基因的調控方向，可知gga-miR-34a-5p在感染組中顯著下調，靶基因N0TCH2在感染組中的表達量顯著高于未感染組（如圖1所 示），即gga-miR-34a-5p與N0TCH2調控方向相反，表現出相互作用關系，與生物信息學預測 結果一致。說明gga-miR-34a-5p可以通過調控N0TCH2基因的表達調控腸炎沙門氏菌對雞的 感染。因此gga-miR-34a-5p可以作為腸炎沙門氏菌感染抗性檢測的分子標記。
[0023]綜上所述，本發明提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性分子標記及其檢測方法， 該抗性分子標記為雞miRNA gga-miR-34a-5p，發明人經過研究發現，gga-miR-34a-5p可以 通過調控N0TCH2基因的表達調控腸炎沙門氏菌對雞的感染，因此gga-miR-34a-5p可以作為 腸炎沙門氏菌感染抗性檢測的分子標記，發明人進一步提供了其檢測方法，從而為雞的抗 病遺傳育種奠定基礎。
【附圖說明】
[0024] 圖1為RNAgga-miR-34a-5p與靶基因N0TCH2在感染組相對未感染組中的表達差異 倍數柱狀圖，
[0025] 由圖可知，gga-miR-34a-5p在感染組中顯著下調，N0TCH2在感染組中的表達量顯 著高于未感染組，即gga-miR-34a-5p與N0TCH2調控方向相反，表現出相互作用關系，說明gga-miR-34a-5p可以通過調控N0TCH2基因的表達調控腸炎沙門氏菌對雞的感染。
【具體實施方式】
[0026]下述實施例中除特殊說明之外，所采用的均為本領域現有技術；
[0027]實施例1
[0028]gga-miR-34a_5p的表達量檢測
[0029]miRNA反轉錄
[0030] 用OneStepPrinieScript?miRNAcDNASynthesisKit(PerfectRealTime)試 劑盒，嚴格按說明書進行。反轉錄體系為20yL(表1)。反應程序為:37°C，60min; 85°C，5s;反 應完成后獲得的cDNA置于-20°C保存備用；
[0031] 表1miRNA反轉錄體系（20yL)
[0034]其中所述的盲腸總RNA為雞盲腸總RNA，采用常規方法獲得，
[0035]gga-miR-34a_5p焚光定量PCR
[0036]根據gga-miR-34a_5p成熟序列設計引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合 成。利用所設引物，采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPrimeScriptTM miRNART-PCRKit說明書，在StratageneMX3000P熒光定量PCR儀上進行擴增，反應體系如 表3所示。
[0037] 表2 miRNA定量檢測引物
[0038]
[0039]其中〉gga_34a_5p和U6分別作為ForwardqPCRPrimer，而Uni-miRqPCRPrimer 選用試劑盒中自帶引物；
[0040] 熒光定量PCR反應程序采用兩步法:95°C預變性30s，1個循環;95°C5s，60°C30s，40 個循環；最后添加溶解曲線(95°Clmin，62°C30s，95°C30s)，1個循環，每個cDNA樣品重復三 次。以U6作為內參基因，用方法來計算miRNA的相對表達量，用SAS8.1軟件中單因素方 差分析對miRNA表達量差異進行分析。
[0041 ] 表3熒光定量PCR體系（20μυ
[0042]
[0043] 實施例2
[0044] 靶基因N0TCH2的表達量檢測
[0045] mRNA反轉錄
[0046] 根據試劑盒說明書要求，利用TaKaRaPrimerScriptTMRTreagentkit (PerfectRealTime)試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA，放在-20°C保存備用。反轉錄體系如表4 所示。反轉錄步驟:37°C，15min;85°C，5s。
[0047] 表4反轉錄體系
[0048]
[0049] N0TCH2 熒光定量PCR
[0050] 根據NCBI數據庫mRNA序列（登錄號:XM_001233595)，用PrimerPremier5.0設計熒 光定量PCR引物(表5所示），引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0051 ] 表5引物序列
[0053] 采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqTM說明書，在 StratageneMX3000P熒光定量PCR儀上進行擴增，反應體系為20yL(表6):SYBRPrimerEx TaqTM(2X)10μ1,ForwardPrimer(10μΜ)0.4μ1,ReversePrimer(10μΜ)0.4μ1,ROX ReferenceDyeΠ(50X)0 · 4yL，cDNA模板2yL，滅菌雙蒸水（ddH2〇)6·8yL，終體積20yL。反應 程序為兩步法:95°C預變性30s，PCR反應為:95°C，5s; 60°C，30s;循環40次;添加溶解曲線： 95°C，lmin; 61°C，30s; 95°C，30s;每個樣品重復3次。以β-actin作為內參，用2-AAGt方法來 計算mRNA的相對表達量，用SAS8.1軟件中單因素方差分析對mRNA表達量差異進行分析。 [0054]表6熒光定量PCR體系
[0055]
[0056] 實施例3
[0057]雞接種腸炎沙門氏菌試驗
[0058]將沙門氏菌陰性白來航蛋雞分為感染組與未感染組，感染組每只雞接種5.8X l〇8CFU腸炎沙門氏菌，未感染組接種磷酸鹽緩沖液(PBS)，接種后第7天采集盲腸組織樣品。 按照使用說明，用Trizol法提取盲腸總RNA。
[0059]gga-miR-34a-5p與腸炎沙門氏菌感染的相關性分析
[0000] 利用實施例1所述方法，檢測腸炎沙門氏菌感染后盲腸組織gga-miR-34a_5p表達 變化。定量結果顯示，gga-miR-34a-5p在感染組盲腸中的表達量顯著低于未感染組(Fold change= -2.79)。說明gga-miR-34a-5p與腸炎沙門氏菌感染具有較強的相關性。
[0061 ]N0TCH2與腸炎沙門氏菌感染的相關性分析
[0062] 利用實施例2所述方法，檢測盲腸N0TCH2表達與腸炎沙門氏菌感染的相關性。結果 顯示，感染組N0TCH2的表達量顯著高于未感染組，是未感染組的1.29倍（P〈0.05)。說明 N0TCH2與雞腸炎沙門氏菌感染相關。
[0063]gga-miR-34a-5p與其靶基因N0TCH2的互作分析
[0064] 通過分別比較感染組與未感染組中miRNA與革E1基因的調控方向，可知gga-miR-34a-5p在感染組中顯著下調，N0TCH2在感染組中的表達量顯著高于未感染組（如圖1)，即gga-miR-34a-5p與N0TCH2調控方向相反，表現出相互作用關系。說明gga-miR-34a-5p可以 通過調控N0TCH2基因的表達調控腸炎沙門氏菌對雞的感染。因此gga-miR-34a-5p可以作為 腸炎沙門氏菌感染抗性檢測的分子標記。
【主權項】
1. 一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標記，該分子標記為雞miRNA gga-miR-34a-5p，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2. 權利要求1所述雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標記gga-miR-34a-5p檢測方 法，具體步驟如下： gga-miR-34a-5p的表達量檢測 miRNA反轉錄 用One StepPrimeScriptAmiRNA cDNA Synthes is Kit試劑盒，嚴格按說明書進行；反 轉錄體系為20yL，如表1所示;反應程序為:37°C，60min; 85°C，5s;反應完成后獲得的cDNA置 于-20°C保存備用； 表1 miRNA反轉錄體系(20yL) gga-miR-34a_5p 焚光定量 PCR根據gga-miR-34a-5p成熟序列設計引物，如表2所示；利用所設引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit說明書，在 Stratagene MX3000P熒光定量PCR儀上進行擴增，反應體系如表3所示； 弄2 miRNA宙量拾涮引物表3熒光定量PCR體系熒光定量PCR反應程序采用兩步法:95°C預變性30s，1個循環;95°C5s，60°C30s，40個循 環;最后添加溶解曲線(95°Clmin，62°C30s，95°C30s)，一個循環，每個cDNA樣品重復三次； 以U6作為內參基因，用方法來計算miRNA的相對表達量，用SAS8.1軟件中單因素方差 分析對gga-miR-34a-5p表達量差異進行分析。
【專利摘要】本發明涉及基因工程技術領域，提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性分子標記及其檢測方法，該抗性分子標記為雞miRNA？gga-miR-34a-5p，發明人經過研究發現，gga-miR-34a-5p可以通過調控NOTCH2基因的表達調控腸炎沙門氏菌對雞的感染，因此gga-miR-34a-5p可以作為腸炎沙門氏菌感染抗性檢測的分子標記，發明人進一步提供了其檢測方法，從而為雞的抗病遺傳育種奠定基礎。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/113
【公開號】CN105463109
【申請號】CN201610015489
【發明人】李顯耀, 吳桂賢, 劉麗英, 劉肖意
【申請人】山東農業大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月11日