專利名稱：腸炎沙門氏菌核酸標準樣品、其建立方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于食品檢測技術領域，具體涉及腸炎沙門氏菌核酸標準樣品制備、其建立方法及其在檢測腸炎沙門氏菌中的應用。
背景技術：
食品安全是重大公共衛生問題，是制約我國經濟發展的重要因素。而微生物污染造成的食源性疾病，是我國食品安全中最突出的問題。近年來，隨著食品產業結構的調整、經濟全球化與國際貿易的迅速發展，我國食源性疾病的防控面臨一系列新問題和挑戰。食品中微生物引起食源性疾病的預防與控制已引起了世界各國關注，食品中微生物的檢測技術是預防與控制的關健的技術環節。目前我國食品中微生物的檢測仍以傳統的 病原菌培養、血清抗體檢測、和生化特征比較水平為主，不能滿足日益發展的檢驗檢疫工作的需要。常規分離培養耗時長，靈敏度低，某些微生物的培養極為困難。隨著2007年《食品中致病菌檢測方法——實時PCR法》(SN/T1870-2007)和《食品中多種致病菌快速檢測方法一PCR法》(SN/T1869-2007)兩項檢驗檢疫行業標準的發布實施，以及即將發布實施的《食品中致病菌檢測方法一DHPLC法》等系列分子生物學檢測國家標準和行業標準。簡單快速，靈敏度高的PCR、實時熒光PCR技術，正在食品致病菌檢測領域開始發揮重要作用。由于食品中細菌的特殊性，人們很難獲得細菌分子生物學檢測陽性樣品，加之食品中致病菌分子生物學檢測技術的研究剛剛起步，而配套的標準樣品的研究工作則起步較晚，制備技術復雜，樣品定值和不確定度的評估存在很多困難，因而國內外食品致病菌核酸標準樣品(定量、定性測試)基本上是一片空白。目前國內外沒有適用于食品中致病菌分子生物學檢測用核酸標準樣品，僅有成套分子生物學檢測試劑盒中配備的陽性對照品，價格非常昂貴，也不具備核酸標準樣品的效能，不能適時地滿足檢驗檢疫工作的需要。研究制備新型的食品致病菌核酸標準樣品，對于保證靈敏、特異、快速檢測食品中致病菌，具有十分重要的意義。

發明內容
為了解決食品中致病菌核酸標準樣品目前國內外均處于空白狀況，本發明主要針對食品中致病菌腸炎沙門氏菌核酸定性和定量檢測項目，研究制備食品中腸炎沙門氏菌核酸標準樣品。通過對致病菌核酸標準樣品的關鍵制備技術和保存技術的研究，并進行定值技術和定值方式的研究，開展均勻性和穩定性研究，并對食品中致病菌核酸標準樣品值的不確定度進行深入細致的研究，最終研制出具有較好的均勻性和穩定性的腸炎沙門氏菌核酸標準樣品。開發處于世界領先水平，具有我國自主知識產權的食品中致病菌核酸標準樣品制備技術；滿足食品安全檢測的需求，滿足國內外食品微生物檢測實驗室的需求。本發明所采用的技術方案是腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis) ATCC 13076的菌株培養、鑒定、核酸標準樣品的制備、核酸標準樣品的干燥、均勻性和穩定性檢查、定性檢定、核酸標準樣品定值等項工作。取制備的核酸標準樣品，經采用實時PCR方法和PCR方法定性分析,確認所制備的核酸標準樣品為腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis) ATCC :13076核酸樣品。采用PicoGreen DNA分子熒光定量方法及紫外分光光度法，隨機抽取樣品進行測試，數據進行T檢驗和F檢驗確認樣品均勻性。經Grubbs檢驗和Cochran檢驗，所有數據均可作為定值依據；經正態性檢驗，這些數據符合正態分布。制備的核酸樣品經過了四年的穩定性測定，在避光、密封，-20°C以下溫度貯存，四年內穩定。本發明的一方面在于一種腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)的標準樣品，其制備方法的步驟如下(一)基因組核酸的提取①腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis) ATCC :13076經菌株活化、增菌培養；②將步驟①獲得的增菌培養液于4000g，4°C離心15min ；③吸棄上清，取沉淀I 3mL，加pH8. O的TE溶液IOmL懸浮，加O. 5mL濃度為IOOg/L SDS和50 μ L濃度為20mg/mL的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ；④加2mL濃度為5mol/LNaCl，混勻，加I. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65°C溫浴20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ；⑤取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ；其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 I ；⑥取上清，加與上清等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，氯仿-異戊醇混合液中氯仿異戊醇的體積比為24 I ；⑦取上清，加上清O. 6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ；⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL pH8. O的TE溶液溶解，獲得腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC :13076 基因組核酸溶液;⑨紫外分光光度計測步驟⑧所得產物的260nm和280nm處的光密度值，當OD26tl/OD280比值在I. 7 I. 9之間時，分裝核酸樣品并進行冷凍干燥；其中，上文所述ρΗ8· O的TE緩沖液組成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 ρΗ8· O 的 TE 緩沖液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. O 和 Iml
0.5MEDTA PH=8. O的溶液于500ml燒杯中，向燒杯中加入約400ml蒸餾水均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存。(二)·冷凍干燥①樣品預凍先把步驟I所得的核酸樣品溶液在_80°C低溫冷凍2h ；②冷凍過程干燥室制冷，溫度降至_35°C時開啟冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度 降至-40°C時，將預凍的核酸樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空；待真空度降至0. 5Torr時，結束冷凍過程；③樣品干燥干燥室溫度設置為15°C，當真空度降至0. ITorr時，關閉真空泵，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋獲得腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC :13076基因組核酸標準樣品，置于_20°C中避光貯存。腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸標準樣品的制備,可廣泛應用于多種食品的檢測試劑盒內，作為陽性標準對照品。本發明的另一方面在于提供一種腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)的檢測試劑盒(不是應用于疾病診斷目的)，包括腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)檢測基因和陽性標準對照品，I.腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)檢測基因，至少包括下述a或b中的一種a:腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特異片段invA基因PCR引物正向引物SEQID NO :I 51 -gtgaaattat cgccacgttc gggcaa-31反向引物SEQID NO 2 5' -tcatcgcacc gtcaaagaac c~3'b:腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特異片段的 Real-Time PCR 引物和探針序列
正向引物SEQID NO:3 5' -gcggcgttgg agagtgata-31反向引物SEQID NO 4 5' -agcaatggaa aaagcaggat g-3'探針SEQID NO :5 5' -FAM-catttcttaa acggcggtgt ctttccct-TAMRA-3'II .所述的陽性標準對照品是通過上述步驟(一)、(二)制備方法獲得的腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)標準樣品。本發明中，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據現有技術確定，并通過配置或商業途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術人員可以依據實施例中所列條件做參考依據進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現有技術中得到充分的啟示，本發明不再贅述。利用腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)標準樣品作為檢測試劑盒中的陽性對照，制備而成的試劑盒，其使用方法為是以待測樣品的基因組為模板，利用腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)檢測基因，經過PCR或Real-Time PCR等反應,結束后，即可以直接以陽性對照為標準，根據瓊脂糖凝膠電泳圖或者熒光信號，以確定待測樣品中是否含有腸炎沙門氏菌，也可以通過先制作標準曲線，再利用實施例中所提及的公式，以計算待測樣品中轉基因成分的含量。具體制作和檢測方法參照實施例I和2。試劑盒以及陽性對照樣品的使用方法可以靈活多變，本領域技術人員可以依據實驗室的操作條件以及制定不同的實驗方案，以實現不同的檢測目的。本發明的創新特征是本發明解決了國內食品中致病菌核酸標準樣品緊缺的狀況，對解決食品中致病菌核酸標準樣品的制備技術和穩定性保證技術，積極開展我國食品中致病菌分子生物學檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義，并對開展食品中致病菌分子生物學檢測工作，食品致病菌核酸標準樣品具有廣闊的市場，有較大的經濟效益和社會效益。


圖I.腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸標準樣品制備工藝流程；圖2. PicoGreen染料進行熒光定量的熒光標準曲線。PicoGreen染料進行熒光定量的熒光標準曲線，用PicoGreen染料進行熒光定量根據Quant-iTTM PicoGreen dsDNAReagent and Kits說明進行。用λ DNA梯度稀釋樣品加入同一板中作標準曲線。橫坐標為梯度稀釋的λ DNA濃度(ng/ μ L)，縱坐標為485nm激發光和535nm發射光的熒光強度。標準曲線顯示了 PicoGreen方法的線性范圍。在DNA濃度為O 1000ng/mL的濃度范圍內，存在DNA濃度與熒光信號的線性關系。
圖3，PicoGreen染料進行熒光定量的熒光標準曲線，用PicoGreen染料進行熒光定量根據 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits 說明進行。用 λ DNA 梯度稀釋樣品加入同一板中作標準曲線。橫坐標為梯度稀釋的λ DNA濃度(ng/ μ L),縱坐標為485nm激發光和535nm發射光的突光強度。標準曲線顯不了 PicoGreen方法的線性范圍。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。DNA提取、和PCR反應試劑等基因工程實驗中所用試劑均購于寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司(貨號D9093)；TaqMan Universal Master Mix :購于 ABI 公司；引物和探針寶生物工程(大連)有限公司合成；實時熒光定量PCR儀ABI 7500型；實施例I菌株來源制備腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸標準樣品所用標準菌株購自于美國標準菌種收藏所(American Type Culture Collection),腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)標準菌株號 ATCC : 13076。圖 I 為腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis)核酸標準樣品制備工藝流程圖。本文中，涉及基因工程操作方面的實驗步驟、實驗試劑配制等方法，如無特殊說明，均參考文獻《分子克隆實驗指南》。基因組核酸的提取方法按照GB/T4789.4-2008[1]進行菌株活化、增菌培養。提取增菌肉湯的DNA，采用 Qiagen 公司的 DNA 提取試劑盒(Qiagen Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit,貨號13362)，并按其操作說明提取基因組DNA。制備核酸標準樣品。(I)取細菌增菌培養液IOOmL,加到500mL無菌離心管中，4000g,4°C離心15min ；(2)吸棄上清，取沉淀lmL，加TE溶液(pH8. O) 10mL，懸浮，加O. 5mL 100g/L十二燒基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 50 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL),混勻，37°C溫浴Ih ；(3)加 2mL NaCl (5mol/L)，混勻，加 I. 5mL CTAB-NaCl 混合溶液(100g/L CTAB 和
O.7mol/L NaCl)，混勻，65°C溫浴 20min ；(4)取上清，加等體積酚-氯仿-異戊醇混合液，(混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 1)，混勻，6000g離心IOmin ;(5)取上清，加等體積氯仿-異戊醇混合液(混合液中氯仿異戊醇的體積比為24 1)，混勻，6000g 離心 IOmin ;(6)取上清，加O. 6倍體積異丙醇，輕輕混勻，13000g離心IOmin ；(7)取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL TE溶液(pH8. O)溶解，此即為細菌基因組核酸溶液。其中，上文所述ρΗ8· O的TE緩沖液組成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 ρΗ8· O 的 TE 緩沖液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. O 和 ImlO. 5MEDTA PH=8. O的溶液于500ml燒杯中，向燒杯中加入約400ml蒸餾水均勻混合；將溶液
定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存。基因組DNA的質量檢查[2](I)直接法——DNA完整性確認用提取的DNA直接電泳檢查，1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖 2,M 為 λ -HindIII digest DNA Marker (Takara D3403A), I 為提取的腸炎沙門氏菌基因組DNA。檢查結果表明電泳條帶清晰明亮，條帶單一，無雜帶，無RNA，說明提取的DNA質 量很好，核酸具有完整性和高分子量。(2)紫外分光光度計法用紫外分光光度計來檢測提取DNA的0D23(I、OD260, OD280光吸收值。取5 μ L DNA溶液加ddH20梯度稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值。當0D26Q/0D28Q比值在I. 7 I. 9之間時，適宜于PCR擴增。
測試結果表明OD23tlAD26tl值小于O. 7，0D26(i/0D28(i值為I. 9，結果表明所提取的核酸標準樣品DNA質量很好。腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸標準樣品的冷凍干燥及分裝冷凍干燥程序(I)樣品預凍先把核酸樣品溶液在_80°C低溫冷凍2h。(2)冷凍過程關好冰凍干燥機的干燥室門，開始干燥室制冷；干燥室溫度降至_35°C時，開始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至_40°C時，將預凍的標準樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空，真空表顯示值開始下降；待真空度降至
O.5Torr時，結束冷凍過程。(3)樣品干燥對干燥室加熱，提高樣品干燥速度；干燥室的溫度設置為15°C。當真空度降至O. ITorr或更低時,表示樣品已干燥好。(4)關閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋。核酸樣品按以上冷凍干燥程序制成凍干粉，即腸炎沙門氏菌(SalmonelIaEnteritidis)核酸標準樣品；分裝將獲得的核酸標準樣品分裝于內置微量管的樣品套管中，分裝400管，冷凍干燥；每管腸炎沙門氏菌核酸標準樣品含量為5 μ g。分裝后的樣品加貼唯一性標識，放置于-20°C中避光貯存。實施例2一定性檢定IPCR 分析a.儀器PE2400，美國PE公司b.測定取制備的核酸標準樣品，經PCR分析測定
腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特異片段invA基因PCR引物正向引物SEQID NO :I 51 -gtgaaattat cgccacgttc gggcaa-31反向引物SEQID NO 2 5' -tcatcgcacc gtcaaagaac c~3'反應條件預變性94°C,3min ；進入循環94°C變性60s，60°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min; 擴增產物長度為284bp,擴增出腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)特異性基因片段，測序后結果證實為腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)。2實時熒光PCR分析a.儀器ABI 7500型實時熒光定量PCR分析儀b.測定取制備的核酸標準樣品,應用腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)特異性引物和探針，經實時熒光定量PCR分析測定，結果證實為腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis)。腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特異片段的Real-Time PCR引物和探針序列正向引物SEQID NO 3 5' -gcggcgttgg agagtgata-31反向引物SEQID NO 4 5' -agcaatggaa aaagcaggat g-3'探針SEQID NO :5 5' -FAM-catttcttaa acggcggtgt ctttccct-TAMRA-3'其中FAM 為 6-carboxyfluorescein, TAMRA 為6-carboxytetramethylrhodamine ；PCR所用試劑購于寶生物，使用寶生物Premix Ex Taq試劑盒，貨號DRR039S。FAM (羧基熒光素)吸收波長492nm，發射波長518nm。反應條件37°C，5min ;95°C預變性3min ;95°C變性5s;60°C退火延伸40s，同時收
集FAM熒光，進行40個循環。4°C保存反應產物。經ABI 7500型實時熒光定量PCR分析儀檢測陰性對照檢測結果顯示，FAM通道無熒光信號檢出，說明反應結果正常，反應體系無污染；陽性對照檢測結果顯示，FAM通道有熒光信號檢出，反應結果正常。根據以上PCR和實時熒光PCR分析的結果，可得出如下結論定性分析結果表明所制備獲得的DNA核酸標準樣品為腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸標準樣品。二定值方法采用PicoGreen DNA分子熒光定量方法[3 5]測定腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis)核酸標準樣品，進行標準樣品定值。I.試劑、耗材、主要儀器Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits invitrogen 公司，包括Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent、20 X TE、λ DNA 標準樣品；黑色平底96孔板Greiner公司。多功能酶標儀TECANGENios PLUS
2. DNA標準曲線繪制(a) DNA標準樣品稀釋、檢測①100ug/mL的λ DNA標準樣品，用TE稀釋成2ug/mL DNA貯存液。②2ug/mL的λ DNA標準樣品貯存液按表I進行稀釋。③每個反應孔按表I所示，再加入ImL Quant-iTTM PicoGreen試劑,混勻,在室溫避光孵育2-5min。④多功能酶標儀檢測。表I DNA標準曲線配制
權利要求
1. 一種腸炎沙門氏菌標準樣品，其特征在于通過以下方法制備 1.基因組核酸的提取 ①腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis) ATCC :13076，經菌株活化、增菌培養； ②將步驟①獲得的增菌培養液于4000g，4°C離心15min； ③吸棄上清，取沉淀I 3mL，加pH8.O的TE溶液IOmL懸浮，加O. 5mL濃度為100g/L SDS和50 μ L濃度為20mg/mL的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ； ④加2mL濃度為5mol/LNaCl，混勻，加I. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65°C溫浴20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 O. 7mol/L NaCl ； ⑤取上清，加與上清等體積的酹-氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心IOmin;其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 I ； ⑥取上清，加與上清等體積的氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心IOmin;其中，氯仿-異戊醇混合液中氯仿異戊醇的體積比為24 : I ; ⑦取上清，加上清O.6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ； ⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8. O的TE溶液溶解，獲得腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC :13076 基因組核酸溶液; ⑨紫外分光光度計測步驟⑧所得產物的260nm和280nm處的光密度值，當0D26(l/0D28(l比值在I. 7 I. 9之間時，分裝核酸樣品并進行冷凍干燥； II .冷凍干燥 ①樣品預凍先把步驟I所得的核酸樣品在-80°c低溫冷凍2h； ②冷凍過程干燥室制冷，溫度降至-35°C時開啟冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C時，將預凍的核酸樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空；待真空度降至0. 5Torr時，結束冷凍過程； ③樣品干燥干燥室溫度設置為15°C，當真空度降至0.ITorr時，關閉真空泵，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋獲得腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC :13076基因組核酸標準樣品，置于_20°C中避光貯存。
2.—種非應用于疾病診斷目的的腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)的檢測試劑盒，其特征在于，包括腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)檢測基因和陽性標準對照品， I.腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)檢測基因，至少包括下述a或b中的一種 a:腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特異片段invA基因PCR引物 正向引物SEQ ID NO 1 反向引物SEQ ID NO 2 b:腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特異片段的Real-Time PCR引物和探針序列 正向引物SEQ ID NO 3 反向引物SEQ ID NO 4 探針SEQ ID NO 5 II.所述的陽性標準對照品是權利要求I所述的腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis)標準樣品。
全文摘要
本發明公開一種腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸標準樣品、其建立方法及應用，其通過菌株培養、鑒定、核酸標準樣品的制備、核酸標準樣品的干燥、均勻性和穩定性檢查、定性檢定、核酸標準樣品定值等項工作,獲得一種腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸標準樣品。本發明解決了國內食品中致病菌核酸標準樣品緊缺的狀況，對解決食品中致病菌核酸標準樣品的制備技術和穩定性保證技術，積極開展我國食品中致病菌分子生物學檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義，并對開展食品中致病菌分子生物學檢測工作，食品致病菌核酸標準樣品具有廣闊的市場，有較大的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12Q1/68GK102719424SQ20121017220
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月30日 優先權日2012年5月30日
發明者于兵, 徐君怡, 徐楊, 曹際娟 申請人:于兵, 徐君怡, 徐楊, 曹際娟