一種vbnc狀態沙門氏菌的誘導形成方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品微生物培養及檢測領域，更具體的說，涉及一種VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法。
【背景技術】
[0002]微生物活的但非可培養(Viable but nonculturable，VBNC)狀態是指其失去了在常規培養基上生長繁殖的能力，但在合適條件下又可復蘇并恢復可培養性的一種特殊休眠狀態。自1982年徐懷恕等首次在河口和海洋環境中發現生存但不可培養的霍亂弧菌(Vibr1 cholerae)和大腸桿菌(Escherichia coli)，直到 1985 年 Colwell 正式提出 VBNC概念，至今已在20個種屬的90多種細菌中發現VBNC狀態。在食品加工與儲藏過程中，主要有物理脅迫因素和化學誘導因素兩大類誘導細菌進入VBNC狀態。物理脅迫因素主要包括在食品加工貯藏過程運用的低溫、冷凍、干燥、輻照以及高壓等技術。目前研究表明低溫可以誘導幾乎所有細菌進入VBNC狀態。化學誘導因素主要是由于不當使用消毒劑和防腐劑導致，包括含氯消毒劑、二氧化硫和一些酸性防腐劑。食源性致病菌和腐敗菌一旦進入VBNC狀態，將對食品安全和公共健康安全非常不利。主要體現在潛伏期長、可控性差及潛在致病性。
[0003]傷寒沙門氏菌是一種腸道桿菌，其感染造成的沙門氏菌疾病是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病之一，容易引起人類胃腸道炎癥。從食品安全角度來看，沙門氏菌引發果蔬汁、鮮切果蔬和蛋乳產品中毒事件，形成對世界范圍內人類健康和安全的威脅。

【發明內容】

[0004]本部分的目的在于概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。
[0005]鑒于上述和/或現有VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法中存在的問題，提出了本發明。
[0006]因此，本發明的一個目的是提供一種沙門氏菌VBNC狀態誘導形成的方法，尤其是一種誘導鼠傷寒沙門氏菌進入VBNC狀態的方法。
[0007]為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案:一種VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法，其包括，將沙門氏菌懸浮于液體中，混合均勻，使其菌液濃度為17?10 sCFU/mL，將菌液在42°C?55°C恒溫條件下超聲波190?570W處理5?25min，檢測是否誘導沙門氏菌進入VBNC狀態。
[0008]作為本發明所述的VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法的一種優選方案，其中:所述檢測是否誘導沙門氏菌進入VBNC狀態，其方法為:將處理后的沙門氏菌懸浮液離心處理得到菌體沉淀，用無菌蒸餾水沖洗，保留菌體沉淀，然后用無菌水重懸，加入混合染色液進行染色，經過激光激發在激光共聚焦顯微鏡上觀察，若有發綠色熒光的細胞存在，說明已經誘導其進入VBNC狀態。
[0009]作為本發明所述的VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法的一種優選方案，其中:所述沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌。
[0010]作為本發明所述的VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法的一種優選方案，其中:還包括，使沙門氏菌復蘇的方法，所述使沙門氏菌復蘇的方法是將處于VBNC狀態的沙門氏菌菌液離心提取菌體沉淀物，用無菌生理鹽水沖洗，用培養基重懸，培養即可得到復蘇后濃度為17?10 8CFU/mL的菌液。
[0011]作為本發明所述的VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法的一種優選方案，其中:所述離心提取菌體沉淀物，其離心條件為3500 X g，離心1min。
[0012]作為本發明所述的VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法的一種優選方案，其中:所述用培養基重懸，其培養基包括:牛肉膏5.0g L \蛋白胨10.0gL \酵母抽提物5.0gL \葡萄糖 5.0gL \ 氯化鈉 5.0gL \ pH 7.0。
[0013]作為本發明所述的VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法的一種優選方案，其中:所述培養即可得到復蘇后濃度為17?10 sCFU/mL的菌液中，其培養的條件為溫度20?37°C，培養6?72h。
[0014]作為本發明所述的VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法的一種優選方案，其中:還包括，檢測沙門氏菌是否復蘇的方法，其是將所述復蘇后濃度為17?10 sCFU/mL的菌液，混合均勻，采用無菌檢驗方式取樣，并均勻涂布在SS瓊脂平皿上，倒置在生化培養箱中，于37°C培養24h，若長出黑褐色具有金屬光澤的圓菌落，則表明已成功復蘇。
[0015]本發明的另一個目的是提供一種VBNC狀態沙門氏菌的誘導形成方法在食品微生物檢測領域的應用。
[0016]本發明的有益效果:通過本發明能夠在30min內將沙門氏菌誘導進入VBNC狀態，并能在適宜的復蘇條件下較為迅速的復蘇。拓展了對VBNC狀態沙門氏菌的認識，彌補傳統微生物平板計數方法不能檢測VBNC狀態細菌而造成“漏檢”的缺陷，規避了污染的風險，為將TS技術更好的應用到食品加工、微生物控制及食品安全保障方面提供理論基礎和技術支持。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明實施例3中VBNC鼠傷寒沙門氏菌復蘇示意圖；
[0018]圖2為本發明實施例4中超聲波熱處理誘導鼠傷寒沙門氏菌進入VBNC狀態并快速復蘇示意圖；
[0019]圖3為本發明實施例4中VBNC鼠傷寒沙門氏菌復蘇示意圖。
【具體實施方式】
[0020]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合說明書附圖對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明。
[0021]在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明，但是本發明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似推廣，因此本發明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0022]其次，此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發明至少一個實現方式中的特定特征、結構或特性。在本說明書中不同地方出現的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。
[0023]實施例1:采用超聲波熱處理誘導BPY培養基中鼠傷寒沙門氏菌進入VBNC狀態
[0024]取可培養菌數為17?10 8CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌(菌種編號CMCC50115)BPY培養基懸浮菌液60mL無菌操作轉移到夾套燒杯中。連通循環水浴裝置，設定溫度為52°C。平衡處理5min，使夾套燒杯中心BPY菌液溫度為52°C。立即開啟超聲波裝置，采用190W功率。超聲波熱處理20min。取出樣品，冷卻到4°C。
[0025]將處理前后的沙門氏菌懸浮液，用渦旋混合儀混合均勻后，采用無菌檢驗方式取樣，并均勻涂布在SS瓊脂平皿上，倒置在生化培養箱中，與37°C培養24h，若無任何沙門氏菌菌落生長，則初步認為已成功將其誘導進入VBNC狀態。進而將TS處理后沙門氏菌懸浮液ImL離心處理得到菌體沉淀，并用無菌蒸餾水沖洗兩次以上，保留菌體沉淀，最后用無菌水重懸。加入 30 μ L 的 LIVE/DEAD@BacLight? Bacterial Viability 試劑盒(MolecularProbes)中SYT09/PI混合染色液進行染色，經過488nm激光激發在激光共聚焦顯微鏡上觀察，若有發綠色熒光的細胞存在(SYT09使所有細菌染色呈現綠色，而PI僅能使細胞壁破損的