一種融合多肽及其制備方法和應用【
技術領域：
】[0001]本發明屬于醫藥
技術領域：
，具體涉及一種融合多肽，同時還涉及該融合多肽的制備方法和應用。【
背景技術：
】[0002]棉鈴蟲，夜蛾科鈴夜蛾屬昆蟲的一種，是棉花蕾鈴期的大害蟲，廣泛分布在世界各地，中國棉區和蔬菜種植區均有發生，主要蛀食蕾、花、鈴和嫩葉。棉鈴蟲天敵很多，有寄生性天敵一寄生蜂、寄生蠅等，捕食性天敵烏雀類及一些細菌、真菌、病毒等可對棉鈴蟲的卵和幼蟲起到抑制作用。[0003]利尿激肽helicokininI(HKI)對棉鈴蟲的水分代謝活動刺激最為強烈（Seinscheetal.，2000)，在極微量的HKI注射進入棉鈴蟲幼體后，即可使其過度排泄，進而導致死亡，HKI作為殺蟲物質進行應用的潛力巨大。由于其來源于生物體，對高等生物和環境安全，因此作為殺蟲物質進行應用具有先天的環境優勢。如何將HKI作為一種殺蟲活性物質進行使用，是否可以利用害蟲的取食行為將其攝入體內發揮作用；如何使有活性的短肽分子穿透消化道進入體內位點，同時保證短肽在運送過程中的穩定，這是亟待解決的問題。【
發明內容】[0004]為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的之一在于提供一種對棉鈴蟲具有強的毒殺活性的融合多肽。[0005]本發明的目的之二在于提供一種融合多肽的制備方法。[0006]同時，本發明還在于提供一種融合多肽的應用。[0007]為了克服現有技術的缺陷，本發明采用的技術方案如下：[0008]一種融合多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。具體為：甲硫氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-脯氨酸-色氨酸-甘氨酸。[0009]所述融合多肽的N端乙酰化。[0010]上述融合多肽的制備方法，包括以下操作步驟：[0011]1)以2-(lH-苯并三偶氮L-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲四氟硼酸酯為縮合劑，以聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂為起始樹脂，采用FM0C固相合成法逐一耦合每一個保護氨基酸，合成得到全保護的肽鏈樹脂；[0012]2)制備的融合多肽N端進行乙酰化。[0013]3)用切割試劑對乙酰化處理后的測鏈全保護的肽鏈樹脂進行切割，將肽鏈從樹脂上裂解下來并取出側鏈保護基團，得到多肽粗品；[0014]4)將步驟3)制備的多肽粗品經冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，分離純化，冷凍干燥即得所述的融合多肽。[0015]步驟2)所述乙酰化試劑為乙酸酐和N-甲基咪唑的混合液。[0016]步驟3)中切割試劑為氟化氫、對甲苯酚、對疏基苯酚按照體積比90:5:5的比例配制而成的混合物。[0017]步驟3)中切割試劑的用量為10~15mL/g。[0018]上述融合多肽在制備防治棉鈴蟲藥物方面的應用。[0019]TAT(transactivatoroftranscription，TAT)為病毒有效轉錄和復制所必須的多肽序列。TAT能夠將與之共價連接的生物大分子非特異地轉導細胞內部，這種過程既不依賴于受體和轉運蛋白，也與溫度和能量無關，而且對宿主細胞幾乎沒有毒性。這種具有攜帶外源蛋白穿透細胞膜能力的特異多肽序列稱為蛋白轉導域（ProteintransductionDomains，PTDs)，也稱細胞穿膜肽（cellpenetratingpeptides，CPP)。[0020]利尿多肽Helicokinin是屬于昆蟲激肽家族的一類小分子昆蟲神經肽，整個家族成員都具有類似的碳末端五肽序列Phe-Tyr-Pr〇-Trp-Gly-NH2(FYPWGa)，這個核心5肽對于其刺激肌肉活動和利尿活動是必需的，研宄表明微量昆蟲激肽及其類似物可以對昆蟲生理代謝造成較大的影響（Smaggheetal.AntifeedantactivityandhighmortalityinthepeaaphidAcyrthosiphonpisum(Hemiptera:Aphidae)inducedbybiostableinsectkininanalogs，，2010;Nachmanetal.Nachmanetal.BiostableandPEGpolymer-conjugatedinsectpyrokininanalogsdemonstrateantifeedantactivityandinducehighmortalityinthepeaaphidAcyrthosiphonpisum(Hemiptera:Aphidae,2012)[0021]本發明融合多肽，在利尿多肽HKI的序列的C端連接蛋白轉導域TAT多肽序列，將HKI同蛋白轉導域進行融合表達，構建TAT-HKI融合肽，借助TAT的高效跨膜轉運作用，使HKI快速地穿過食道系統內膜進入體內位點，確保利尿多肽序列在體內運送過程中穩定發揮作用，使融合多肽進入棉鈴蟲體內后，使棉鈴蟲過度排泄，導致死亡。本發明融合多肽可通過棉鈴蟲自然取食的行為進入棉鈴蟲體內，并在體內高效穩定的表達，表現出非常強的毒殺活力，克服了HKI經昆蟲消化道毒力差得缺陷。[0022]本發明融合多肽的制備方法采用FM0C法制備融合多肽，氨基酸接枝成功率高，操作簡便，易于實現，適于工業化推廣應用。[0023]本發明融合多肽在棉鈴蟲體內高效表達，表現出毒殺活性的特性，使其可用于制備防治棉鈴蟲的藥物。【具體實施方式】[0024]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。[0025]實施例1[0026]本實施例融合多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，具體為甲硫氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-脯氨酸-色氨酸-甘氨酸。[0027]本實施例融合多肽N端乙酰化。[0028]本實施例融合多肽的制備方法，具體操作步驟為：[0029]1)以2-(lH_苯并三偶氮L-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲四氟硼酸酯為縮合劑，以聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂為起始樹脂，采用FMOC固相合成法逐一耦合每一個保護氨基酸，合成得到全保護的肽鏈樹脂；[0030]2)用乙酸酐和N-甲基咪唑的混合液對步驟1)制備的全保護的肽鏈樹脂進行乙酰化處理；[0031]3)用13mg/L切割試劑對乙酰化處理后的測鏈全保護的肽鏈樹脂進行切割，將肽鏈從樹脂上裂解下來并取出側鏈保護基團，得到多肽粗品；所述切割試劑為氟化氫、對甲苯酚、對疏基苯酚按照體積比90:5:5的比例配制而成的混合物；[0032]4)將步驟3)制備的多肽粗品經冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，分離純化，加入乙酸酐和N-甲基咪唑的混合液進行乙酰化處理，冷凍干燥即得所述的融合多肽。[0033]性能檢測：實施例制備的融合多肽的毒力測定[0034]測定方法，具體操作步驟為：[0035]1)首先配制新鮮的棉鈴蟲人工飼料：將瓊脂8g煮沸融化，溫度低于90°C后依次加入無菌麥麩70g，干酵母10g，玉米油3ml，山梨醇lg，抗壞血酸15g，溶劑為水，邊加邊攪拌均勻；[0036]2)試驗分為3組：融合多肽TAT-HKI試驗組：將實施例制備的融合多肽TAT-HKI溶于無菌水中，待人工飼料溫度加熱至45°C時，加入TAT-HKI融合多肽攪拌均勻，作為融合多肽TAT-HKI試驗組；利尿激肽HKI試驗組：將HKI溶于無菌水中，待人工飼料溫度加熱至45°C時，加入HKI多肽攪拌均勻，作為HKI試驗組；空白對照組：人工飼料中不添加任何添加劑；[0037]3)將步驟2)制備的3組飼料分別切成1cm3方塊，放入2.5X10cm平底試管中（棉塞封口），并接入正常的棉鈴蟲初孵化2齡初的幼蟲，每處理組接蟲200頭，每管1頭，置于培養箱中；處理后試蟲的飼養條件：溫度27±1°C，相對濕度65~70%，光照比（L:D)16:8h，每隔4天更換一次飼料，每隔4天觀察棉鈴蟲的存活狀態，統計死亡率，判斷融合多肽的毒力；其中統計數據采用DSP軟件進行方差分析。[0038]棉鈴蟲存活狀態判斷標準：以小毛筆輕觸蟲體，不能協調運動認為死亡。[0039]檢測結果如下表1所示：[0040]表1不同多肽的毒力檢測比較[0041]【主權項】1.一種融合多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.如權利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽的N端乙酰化。3.-種如權利要求1所述的融合多肽的制備方法，其特征在于，包括以下操作步驟：1)以2-(1H-苯并三偶氮L-I-基）-1，1，3,3-四甲基脲四氟硼酸酯為縮合劑，以聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂為起始樹脂，采用FMOC固相合成法逐一耦合每一個保護氨基酸，合成得到全保護的肽鏈樹脂；2)將步驟1)制備的融合多肽N端進行乙酰化；3)用切割試劑對乙酰化處理后的測鏈全保護的肽鏈樹脂進行切割，將肽鏈從樹脂上裂解下來并取出側鏈保護基團，得到多肽粗品；4)將步驟3)制備的多肽粗品經冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，分離純化，冷凍干燥即得所述的融合多肽。4.一種如權利要求1所述的融合多肽在制備防治棉鈴蟲藥物方面的應用。【專利摘要】本發明公開了一種融合多肽及其制備方法和應用，屬于醫藥
技術領域：
。本發明融合多肽，在利尿多肽HKI的序列的C端連接蛋白轉導域TAT多肽序列，將HKI同蛋白轉導域進行融合表達，構建TAT-HKI融合肽，借助TAT的高效跨膜轉運作用，使HKI快速地穿過食道系統內膜進入體內位點，確保利尿多肽序列在體內運送過程中穩定發揮作用，使棉鈴蟲過度排泄，導致死亡。本發明融合多肽可通過棉鈴蟲自然取食的行為進入棉鈴蟲體內，并在體內高效穩定的表達，表現出非常強的毒殺活力，克服了HKI經昆蟲消化道毒力差得缺陷，可用于制備防治棉鈴蟲的藥物。【IPC分類】C07K19-00,C07K1-04,A01N47-44,A01P7-04,C07K1-06【公開號】CN104650242【申請號】CN201510017417【發明人】周洲,李永麗,崔林開,李紅英,源春彥,吳建【申請人】河南科技大學【公開日】2015年5月27日【申請日】2015年1月13日