專利名稱：一種利用葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法
技術領域：
本發明涉及一種葡糖桿菌(Gluconobacter sp. ) CGMCC No. 5146產生二羥基丙酮的方法。
背景技術：
二羥基丙酮，又稱1，3-二羥基丙酮，簡稱DHA，英文名為1，3-dihydroxyacetone。 DHA是最簡單的酮糖，表觀分子式為C3H6O3，分子量為90. 07。DHA外觀為白色粉末，有甜味，水溶性> 250g/L(20°C )，在pH 6. O時穩定，熔點為 70 80°C (單體和二聚體的混合物)，易溶于水、乙醇、丙酮及乙醚等溶劑。一般狀態下， DHA是以二聚體(l，4-DioXane)形式存在的結晶，但是，經溶解或加熱后則變為單體。二羥基丙酮(DHA)是一種天然存在的酮糖，具有生物可降解性，可食用且對人體和環境無毒害。DHA分子中含有3個官能團O個羥基，1個羰基)，化學性質活潑，廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學反應，是一個重要的化學合成中間體，也是一個重要的多功能試劑，如在工業應用上，能有效地還原丁二烯-苯乙烯復合物。以DHA為主要成分的保鮮劑可用于果蔬、水產品、肉制品的防腐保鮮。DHA不僅是一種重要藥物，也是一種重要的醫藥中間體，如作為藥物已經應用在低血糖與糖尿病的治療及某些病毒性皮膚病的治療上。DHA 被廣泛應用于化妝品中，與皮膚表層自由氨基結合形成細密的薄膜，起到很好的保濕及防曬作用。DHA的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法。目前，國內外DHA的生產主要采用微生物轉化甘油的方法。微生物轉化甘油生產DHA的原理就是利用微生物代謝產生的甘油脫氫酶，使甘油分子結構中2位C上的羥基進行反應，生成DHA。 因此，理論上凡是能夠利用甘油，并且具有相應的甘油脫氫酶系的微生物，都可具有反應條件溫和、底物利用率高、副產物少、工藝簡單易于控制等優點，以轉化甘油生產 DHA。自1898年Bertrand發現利用細菌可以將甘油轉化成DHA后，各國科研人員對微生物發酵甘油生產DHA進行了多方面研究，目前用于以甘油為底物生產DHA的菌種主要以弱氧化醋酸桿菌(Acetobacter Suboxydans)禾口氧化葡H桿菌(Gluconobacter oxydans) 為主，兩者都為革蘭氏陰性棒狀桿菌，屬于醋酸桿菌屬，且擁有相似的代謝機制。此外，粗狀假絲酵母(Candida valida)、粗糙脈胞菌(Neurospora crassa)、漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、產氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、 膜璞畢赤酵母(Pichia membranifaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)等也有報道能夠將甘油轉化為DHA。目前生物法生產DHA中存在底物和產物對生產菌株的抑制效應，從而導致甘油濃度提高時轉化率降低，生產周期延長等問題，以及發酵法生產DHA后續分離提取產品工藝中存在的工序復雜、分離能力小、分離成本高及產品收得率低等問題，因此，DHA在國內還未實現工業化生產。本發明針對目前該技術存在的缺陷，通過紫外線和烷化劑EMS復合誘變處理氧化葡糖桿菌出發菌株Gluconobacter oxydans (G. oxydans)，然后經篩選培養基培養后，得到高產誘變菌株葡糖桿菌(GluconcAacter sp.)CGMCC No. 5146。所述誘變菌株具有高甘油脫氫酶活性、產物耐受性和底物耐受性高等特點。另外還選擇穩定高效的發酵工藝以提高甘油轉化效率，降低生產成本，實現工業化發酵生產DHA。

發明內容
本發明的目的在于提供一種高效、節能、操作簡單的二羥基丙酮發酵生產新工藝。本發明提供的一種利用葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其特征是，所述的葡糖桿菌為葡糖桿菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146。優選的是，所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，包括以下步驟步驟一、利用山梨醇為底物的培養基進行初期發酵培養，直到葡糖桿菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146的菌體生長至穩定期，即菌體濃度不再增加；步驟二、將通過步驟一得到的含菌體和產物二羥基丙酮的溶液放置在膜生物反應器中，利用以甘油為底物的培養基進行連續發酵，即在發酵過程中，持續通過膜生物反應器上的膜組件，過濾出不含菌體細胞的澄清的發酵液，同時不斷向膜生物反應器中補充新鮮的所述以甘油為底物的培養基。優選的是，所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，在步驟二之后還包括步驟三然后分離發酵液中的二羥基丙酮，并進行提純。優選的是，所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，所述膜生物反應器為利用中空纖維超濾內壓膜的膜生物反應器。優選的是，所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，山梨醇為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2. O 3.0，蛋白胨1.5 2. 5，山梨醇25. O 35.0， (NH4)2SO4 1. 5 2. 5，MgSO4 · 7Η20 0. 5 1. 5，K2HPO4 · 3H202. O 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 4 0. 6，CaCO3 2. O 3. 0，CaCl2 1. 0 1. 5，ρΗ 5. 0 6. 5，以溶劑水配置。優選的是，所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，山梨醇為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2. 5，蛋白胨2.0，山梨醇30.0，(NH4)2SO4 2.0， MgSO4 · 7H20 1.0，K2HPO4 · 3H20 2. 62，MnSO4 · IH2O 0. 56，CaCO3 2. 5，CaCl2 1· 25，ρΗ6· 0，以溶劑水配置。優選的是，所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，所述以甘油為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2.0 3.0，蛋白胨1.5 2. 5，甘油50.0 70.0， (NH4)2SO4 1. 5 2. 5，MgS04 ·7Η20 0· 5 1· 5，K2HPO4 · 3Η20 2· 0 3· 0，MnSO4 · IH2O 0· 4 0. 6，CaCO3 2. 0 3. 0，CaCl2 1. 0 1. 5，ρΗ 5. 0 6. 5，以溶劑水配置。優選的是，所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，所述以甘油為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2.5，蛋白胨2.0，甘油60.0，(NH4)2SO4 2.0，MgSO4 · 7H20 1.0，K2HPO4 · 3H20 2. 62，MnSO4 · IH2OO. 56，CaCO3 2. 5，CaCl2 1· 25，pH 6· 0，以
溶劑水配置。優選的是，所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，所述葡糖桿菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146為通過紫外線和烷化劑EMS復合誘變處理醋酸桿菌屬的氧化葡糖桿菌而得到的。優選的是，所述的氧化葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，所述連續發酵時間超過400小時。優選的是，所述的氧化葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法中，二羥基丙酮的提純步驟包括經過所述離子交換處理后的二羥基丙酮濾液于40°C下真空蒸發直至近干，得到濃縮物，然后向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于40°C的真空干燥箱內干燥，得到二羥基丙酮固體；將上述步驟所得二羥基丙酮固體溶于水中，得到二羥基丙酮水溶液，然后40°C下將二羥基丙酮水溶液真空蒸發直至近干，得到濃縮物，向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于 40°C的真空干燥箱內干燥，即得到純化的二羥基丙酮晶體。本發明提供的一種利用葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法包括以下步驟1)利用山梨醇為底物的培養基進行初期發酵培養，山梨醇初始濃度為30g/ L，發酵溫度觀°〇，pH6.0，溶氧值控制在1.8mg/L，稀釋率控制在0. 151Γ1，直到葡糖桿菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146的菌體生長至穩定期，即菌體濃度不再增加。2)將通過步驟一得到的含菌體和產物二羥基丙酮的溶液放置在中空纖維超濾內壓膜的膜生物反應器中，利用以甘油為底物的培養基進行連續發酵，即在發酵過程中，持續通過膜生物反應器上的膜組件，過濾出不含菌體細胞的澄清的發酵液，同時不斷向膜生物反應器中補充新鮮的所述以甘油為底物的培養基，溶氧值控制在1.8mg/L，稀釋率控制在 .巧一，發酵溫度觀！，？朋^，發酵培養產生含有二羥基丙酮(DHA)的發酵液。3)取上述含二羥基丙酮的發酵液以6 7mL/min的速度分別流過陽離子(001X7 型強酸性)和陰離子(302凝膠型弱堿性苯乙烯系)交換樹脂柱，收集濾液，然后再用去離子水淋洗陽、陰離子交換樹脂，收集濾液直至流出液中無DHA檢出。4)經過上述離子交換處理后的二羥基丙酮濾液于40°C下真空蒸發直至近干，得到濃縮物，然后向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液， 再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌， 直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于40°C的真空干燥箱內干燥，得到二羥基丙酮固體。
5)將上述步驟所得二羥基丙酮固體溶于水中，得到二羥基丙酮水溶液，然后40°C 下將二羥基丙酮水溶液真空蒸發直至近干，得到濃縮物，向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于 40°C的真空干燥箱內干燥，即得到純化的DHA晶體。本發明提供的一種利用葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法具有以下突出特點1)通過紫外線和烷化劑EMS復合誘變處理氧化葡糖桿菌出發菌株Gluconobacter oxydans(G. oxydans)，然后經篩選培養基培養后，得到高產誘變菌株葡糖桿菌 (Gluconobacter sp.) CGMCC No. 5146。該菌株在甘油濃度達到150g/L時仍有高活性，相對于現有菌株當甘油濃度達到或超過80 120g/L時，菌體就會裂解、失活的情況，更適合于工業化大生產；2)膜生物反應器連續生產DHA，可分別創造適合微生物細胞生長及產物生產的良好環境，避免了高濃度底物、高濃度DHA對細胞生長及甘油到DHA轉化過程的抑制作用，實現了細胞的充分增殖和與產物的生產；3)采用超濾和陽離子交換吸附技術分離純化DHA。在連續發酵過程中利用膜的選擇性濾過作用，即時引出DHA，使反應和分離同時進行，簡化了工藝過程，縮短了工藝時間， 提高了產品收率，降低了溶劑消耗和環境污染；本發明以紫外、EMS誘變出的高產菌株為出發菌株，在膜反應器中制取DHA，并采用超濾和離子交換吸附技術提純DHA，具有操作簡單方便、節能、生產效率高等特點，適合于工業化大規模生產。


圖1為該發明氧化葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法的工藝流程圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。葡糖桿菌(GluconcAacter sp.)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101，保藏號CGMCC No. 5146，保藏日期2011年08月16日。實施例1將葡糖桿菌(GluconcAacter sp.) CGMCC No. 5146利用山梨醇為底物的培養基進行初期發酵培養，山梨醇初始濃度為30g/L，發酵溫度觀1，？!1 6.0。菌體開始生長緩慢，在連續發酵達到穩定期后，在中空纖維超濾內壓膜的膜生物反應器內以甘油為底物的培養基進行連續發酵，連續發酵過程中膜生物反應器不斷引出不含菌體的產物DHA同時補加新鮮培養基，減少了發酵罐中高濃度底物積累對發酵過程的抑制，使得DHA的積累在較長的時間內進行。同時整個發酵過程中菌體未引出，但DHA產物依然得到穩定積累，這證實了葡糖桿菌在菌體細胞減緩生長或，完全停止生長時，仍可氧化甘油生成DHA。連續發酵反應溫度控制在，用5%的NaOH調節pH，維持在6. 0，分別測定發酵液中DHA與菌體濃度。取IL膜反應后的發酵液以6-7mL/min的速度分別流過陽離子(001 X 7型強酸性) 和陰離子(302凝膠型弱堿性苯乙烯系)交換樹脂柱(陽、陰離子交換樹脂的體積為400mL， 高徑比為20 1)，收集濾液，然后用去離子水淋洗陽、陰離子交換樹脂，收集濾液直至流出液中無DHA檢出。經過離子交換處理后的二羥基丙酮濾液于40°C下真空蒸發直至近干，得到濃縮物，然后向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于40°C的真空干燥箱內干燥，得到二羥基丙酮固體。將上述步驟所得二羥基丙酮固體溶于水中，得到二羥基丙酮水溶液，然后40°C下將二羥基丙酮水溶液真空蒸發直至近干，得到濃縮物，向濃縮物中邊攪拌邊加入1倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于 40°C的真空干燥箱內干燥，即得到純化的DHA晶體。甘油轉化率達到90%以上，收率達到 80%以上。實施例2將葡糖桿菌(GluconcAacter sp.) CGMCC No. 5146利用山梨醇為底物的培養基進行初期發酵培養，山梨醇初始濃度為30g/L，發酵溫度觀1，？!1 6.0。菌體開始生長緩慢，在連續發酵達到穩定期后，在中空纖維超濾內壓膜的膜生物反應器內以甘油為底物的培養基進行連續發酵，連續發酵過程中膜生物反應器不斷引出不含菌體的產物DHA同時補加新鮮培養基，減少了發酵罐中高濃度底物積累對發酵過程的抑制，使得DHA的積累在較長的時間內進行。同時整個發酵過程中菌體未引出，但DHA產物依然得到穩定積累，這證實了葡糖桿菌在菌體細胞減緩生長或，完全停止生長時，仍可氧化甘油生成DHA。連續發酵反應溫度控制在，用5%的NaOH調節pH，維持在6. 0，分別測定發酵液中DHA與菌體濃度。取IL膜反應后的發酵液以6-7mL/min的速度分別流過陽離子(001 X 7型強酸性) 和陰離子(302凝膠型弱堿性苯乙烯系)交換樹脂柱(陽、陰離子交換樹脂的體積為400mL， 高徑比為20 1)，收集濾液，然后用去離子水淋洗陽、陰離子交換樹脂，收集濾液直至流出液中無DHA檢出。經過離子交換處理后的二羥基丙酮濾液于40°C下真空蒸發直至近干，得到濃縮物，然后向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于40°C的真空干燥箱內干燥，得到二羥基丙酮固體將上述步驟所得二羥基丙酮固體溶于水中，得到二羥基丙酮水溶液，然后40°C下將二羥基丙酮水溶液真空蒸發直至近干，得到濃縮物，向濃縮物中邊攪拌邊加入2倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于 400C的真空干燥箱內干燥，即得到純化的DHA晶體。甘油轉化率達到90%以上，收率達到 80%以上。實施例3其他步驟和條件相同，DHA的純化過程中加入3倍的無水乙醇去除雜質。甘油轉化率達到90%以上，收率達到80%以上。實施例4其他步驟和條件相同，DHA的純化過程中加入4倍的無水乙醇去除雜質。甘油轉化率達到90%以上，收率達到80%以上。實施例5其他步驟和條件相同，DHA的純化過程中加入5倍的無水乙醇去除雜質。甘油轉化率達到90%以上，收率達到80%以上。實施例6將葡糖桿菌(GluconcAacter sp.) CGMCC No. 5146利用山梨醇為底物的培養基進行初期發酵培養，所述培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2.0，蛋白胨1.5，山梨醇 25. 0，(NH4)2SO4 1. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，K2HPO4 · 3Η202· 0，MnSO4 · IH2O 0. 4，CaCO3 2. 0， CaCl2 1. 0，以溶劑水配置，山梨醇初始濃度為30g/L，發酵溫度^°C，pH5. 0，菌體開始生長緩慢，在連續發酵達到穩定期后，在中空纖維超濾內壓膜的膜生物反應器內以甘油為底物的培養基進行連續發酵，甘油為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2.0， 蛋白胨 1. 5，甘油 50. 0，(NH4)2SO4 1. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，K2HPO4 · 3Η202· 0，MnSO4 · IH2O 0. 4， CaCO3 2.0, CaCl2 1.0, ρΗ 5. 0，以溶劑水配置，連續發酵過程中膜生物反應器不斷引出不含菌體的產物DHA同時補加新鮮培養基，減少了發酵罐中高濃度底物積累對發酵過程的抑制，使得DHA的積累在較長的時間內進行。同時整個發酵過程中菌體未引出，但DHA產物依然得到穩定積累，這證實了葡糖桿菌在菌體細胞減緩生長或，完全停止生長時，仍可氧化甘油生成DHA。連續發酵反應溫度控制在^°C，用5%的NaOH調節pH，維持在6.0，分別測定發酵液中DHA與菌體濃度。取IL膜反應后的發酵液以6-7mL/min的速度分別流過陽離子(001 X 7型強酸性) 和陰離子(302凝膠型弱堿性苯乙烯系)交換樹脂柱(陽、陰離子交換樹脂的體積為400mL， 高徑比為20 1)，收集濾液，然后用去離子水淋洗陽、陰離子交換樹脂，收集濾液直至流出液中無DHA檢出。經過離子交換處理后的二羥基丙酮濾液于40°C下真空蒸發直至近干，得到濃縮物，然后向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于40°C的真空干燥箱內干燥，得到二羥基丙酮固體將上述步驟所得二羥基丙酮固體溶于水中，得到二羥基丙酮水溶液，然后40°C下將二羥基丙酮水溶液真空蒸發直至近干，得到濃縮物，向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于 400C的真空干燥箱內干燥，即得到純化的DHA晶體。甘油轉化率達到90%以上，收率達到 80%以上。實施例7山梨醇為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2. 5，蛋白胨2.0， 山梨醇 30，(NH4)2SO4 2. 0，MgSO4 · 7H20 1.0，K2HPO4 · 3H20 2. 5，MnSO4 · IH2O 0. 5，CaCO3 2. 5， CaCl2 1. 2，以溶劑水配置，pH 6. 0，以溶劑水配置。甘油為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2.5，蛋白胨2.0，甘油 60，(NH4)2SO4 2. 0，MgS04 ·7Η20 L 0，K2HPO4 ·3Η20 2. 5，MnSO4 · IH2O 0. 5, CaCO3 2. 5, CaCl2 1.2，ρΗ6. 0，以溶劑水配置。其余條件同實施例6，甘油轉化率達到90%以上，收率達到80%以上。實施例8山梨醇為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏3.0，蛋白胨2. 5， 山梨醇 35. 0，(NH4)2SO4 2. 5，MgSO4 · 7H20 1. 5，K2HPO4 · 3H20 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 6，CaCO3 3. 0，CaCl2 1. 5，以溶劑水配置，pH 6. 5，以溶劑水配置。甘油為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏3.0，蛋白胨2.5，甘油 70. 0，(NH4)2SO4 2. 5，MgSO4 · 7H20 1. 5，K2HPO4 · 3H20 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 6，CaCO3 3. 0， CaCl2 1. 5，pH6. 5，以溶劑水配置。其余條件同實施例6，甘油轉化率達到90%以上，收率達到80%以上。實施例9通過紫外線誘變處理葡糖桿菌出發菌株Gluconobacter oxydans (G. oxydans)后經篩選培養基培養后，再用烷化劑EMS進行二次誘變處理，篩選得到高產誘變菌株葡糖桿菌(Gluconobacter sp.)CGMCC No. 5146。其中紫外線誘變是指將葡糖桿菌出發菌株在PDA斜面培養基上30°C，培養2-3d。 PDA斜面培養基組成，質量(g)體積(L)比葡萄糖100.0，酵母膏10.0，CaCO3 20.0，瓊脂 18.0，以溶劑水配置，pH 6.8。配置好的固體篩選培養基于121°C殺菌25min后使用。用接種環接種在種子培養基中過夜培養，使之處于對數生長期。收集菌種細胞，用生理鹽水洗滌兩次后，菌種細胞懸浮于生理鹽水中，調整菌種細胞濃度為IO8個/mL左右，將平板放置在距30W紫外燈光源30cm的地方照射50s。紫外線照射后，將菌種細胞涂布于固體篩選培養基平板上，30°C培養2d，固體篩選培養基，其組成為酵母膏lg，葡萄糖5g，碳酸鈣0. 39，甘油5g溶于IOOmL 1.8%營養瓊脂中。實驗菌在平板上分離接種，培養3_4d后在平板上倒入裴林氏劑O^hling)溶液。裴林氏溶液A液=CuSO4 · 5H20 34. 66g用500mL蒸餾水溶解。B 液酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6 · 4H20) 173g、氫氧化鈉50g溶于500mL蒸餾水中。A液和B液分別貯存于4°C冰箱中，用前按1 1混合。池后，檢查生長物周圍是否出現紅色暈圈。挑選正突變單菌落進行搖瓶發酵性能試驗，篩選出發酵單位高的正突變菌落。EMS誘變是指為用0. lmol/L EMS誘變劑與經紫外誘變挑選出的正突變菌落制成的單孢子懸液混合處理30min，誘變完成后稀釋終止反應。挑選正突變單菌落進行搖瓶發酵性能試驗，篩選出發酵單位高的正突變菌落。經EMS誘變篩選出來的即發酵單位高的菌株即為高產誘變菌株葡糖桿菌(Gluconobacter sp.)CGMCC No· 5146。 最后需要強調的是以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.一種利用葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其特征是，所述的葡糖桿菌為葡糖桿菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146。
2.如權利要求1所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其特征是，包括以下步驟步驟一、利用山梨醇為底物的培養基進行初期發酵培養，直到葡糖桿菌Gluconobactersp.，CGMCC No. 5146的菌體生長至穩定期，即菌體濃度不再增加；步驟二、將通過步驟一得到的含菌體和產物二羥基丙酮的溶液放置在膜生物反應器中，利用以甘油為底物的培養基進行連續發酵，即在發酵過程中，持續通過膜生物反應器上的膜組件，過濾出不含菌體細胞的澄清的發酵液，同時不斷向膜生物反應器中補充新鮮的所述以甘油為底物的培養基。
3.如權利要求1所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其特征是，在步驟二之后還包括步驟三然后分離發酵液中的二羥基丙酮，并進行提純。
4.如權利要求2或3所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其中，所述膜生物反應器為利用中空纖維超濾內壓膜的膜生物反應器。
5.如權利要求4所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其中，山梨醇為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2. O 3.0，蛋白胨1.5 2. 5，山梨醇25. O 35. 0，(NH4)2SO4 1. 5 2. 5，MgSO4 · 7Η20 0. 5 1. 5，K2HPO4 · 3Η20 2. O 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 4 0. 6，CaCO3 2. 0 3. 0，CaCl2L 0 1. 5，pH 5. 0 6. 5，以溶劑水配置。
6.如權利要求5所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其中，山梨醇為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2. 5，蛋白胨2.0，山梨醇30.0，(NH7)2SO4 2.0， MgSO4 · 7H20 1. 0，K2HPO4 · 3H20 2. 62，MnSO4 · IH2OO. 56，CaCO3 2. 5，CaCl2 1. 25，ρΗ6· 0，以溶劑水配置。
7.如權利要求5或6所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其中，所述以甘油為底物的培養基組成，重量(g) /體積(L)比，為酵母膏2. 0 3. 0，蛋白胨1. 5 2. 5，甘油50. 0 70. 0，(NH4)2SO4 1. 5 2. 5，MgSO4 · 7Η200· 5 1. 5，K2HPO4 · 3Η20 2. 0 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 4 0. 6，CaCO3 2. 0 3. 0，CaCl2 1. 0 1. 5，pH 5. 0 6. 5，以溶劑水配置。
8.如權利要求7所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其中，所述以甘油為底物的培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為酵母膏2. 5，蛋白胨2.0，甘油60.0，(NH4)2SO4 2.0， MgSO4 · 7H20 1.0，K2HPO4 · 3H20 2. 62，MnSO4 · IH2OO. 56，CaCO3 2. 5，CaCl2 1· 25，pH 6· 0，以溶劑水配置。
9.如權利要求4所述的葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其中，所述葡糖桿菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146為通過紫外線和烷化劑EMS復合誘變處理醋酸桿菌屬的氧化葡糖桿菌而得到的。
10.如權利要求4所述的氧化葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其中，所述連續發酵時間超過400小時。
11.如權利要求3所述的氧化葡糖桿菌產生二羥基丙酮的方法，其中，二羥基丙酮的提純步驟包括經過所述離子交換處理后的二羥基丙酮濾液于40°C下真空蒸發直至近干，得到濃縮物，然后向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于40°C的真空干燥箱內干燥，得到二羥基丙酮固體；將上述步驟所得二羥基丙酮固體溶于水中，得到二羥基丙酮水溶液，然后40°C下將二羥基丙酮水溶液真空蒸發直至近干，得到濃縮物，向濃縮物中邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，得到二羥基丙酮乙醇溶液，再將所述二羥基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸發至近干，重復上述步驟至有晶體出現，此時得到飽和二羥基丙酮乙醇溶液，將所述二羥基丙酮乙醇溶液置于5°C低溫恒溫槽中攪拌，直至出現大量晶體，然后將晶體過濾出并在低于40°C 的真空干燥箱內干燥，即得到純化的二羥基丙酮晶體。
全文摘要
本發明提供了一種利用葡糖桿菌(Gluconobacter sp.)CGMCC No.5146生產二羥基丙酮的方法，其中，包括以下步驟利用山梨醇為底物的培養基進行初期發酵培養，直到葡糖桿菌的菌體生長至穩定期，將所得到的含菌體和產物二羥基丙酮的溶液放置在膜生物反應器中，利用以甘油為底物的培養基進行連續發酵，持續通過膜生物反應器過濾出不含菌體的發酵液，同時不斷向膜生物反應器中補充新鮮的以甘油為底物的培養基，分離發酵液中的二羥基丙酮，并進行提純。底物甘油濃度60g/L時，DHA濃度56.75g/L，體積產率9.02g/(L.h)，甘油轉化率達到90％以上，收率達到80％以上，突破了微生物發酵法制取二羥基丙酮產率低、成本高的技術瓶頸。本發明具有操作簡單方便、節能、生產效率高等特點，適合于工業化大規模生產。
文檔編號C07H1/06GK102382868SQ201110356248
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者張桐, 徐莉, 王福清 申請人:中科醫藥行業生產力促進中心有限公司