白菜wrky31基因及其編碼的蛋白質的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種白菜WRKY31基因及其編碼的蛋白質，所述白菜WRKY31基因的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述白菜WRKY31基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本發明提供的白菜WRKY31基因及其編碼的蛋白質具有轉錄調控基因表達特性，通過轉錄調節白菜花粉育性和抗逆性相關基因的表達，能夠提高植物的抗逆性，可用于分子植物育種，在培育雄性不育植物材料，抗逆性新品種，提高植物對逆境的抗性中起到重要的作用。
【專利說明】
白菜WRKY31基因及其編碼的蛋白質
技術領域
[0001] 本發明涉及一種白菜WRKY31基因及其編碼的蛋白質。
【背景技術】
[0002] 雄性不育系是十字花科作物生產一代雜種的理想系統，我國也是掌握十字花科植 物雄性不育優異種質資源最多，應用最廣的國家之一。花粉敗育是植物雄性不育發生的表 型體現，分析雄性不育機理需從解析花粉發育過程的各環節入手。多年來，人們通過正、反 向遺傳學的方法鑒定了一系列參與花粉發育過程的關鍵基因。20世紀初，人們通過對擬南 芥等模式植物以及一些重要糧食作物等的花粉轉錄組、蛋白質組等進行分析，勾勒了花粉 mRNA、蛋白質組成等的初步特征。這些研究分別從散點和全局的角度分析花粉發育過程，積 累了對該過程的一定的認識。然而，花粉發育受控于成千上萬個基因、蛋白質等，是一個多 步驟、復雜的過程，想要進一步解析其分子機制必須從深入分析基因、蛋白質等之間的相互 關系入手。
[0003] 花粉發育過程通常是植物生殖發育過程中最易受環境影響的環節。高溫、低溫、多 雨、干旱等溫度與濕度條件的變化，均會直接引起花粉失活甚至導致敗育等。轉錄因子是轉 錄水平上調控基因表達的重要因素，其所介導的基因表達調控網絡在植物抵御各種環境脅 迫時扮演重要角色，如已經鑒定的MYB、WRKY和bZIP等基因家族等。在擬南芥花粉發育不同 階段表達的12977個基因當中，有608個為推測的轉錄因子。研究表明AtMYB103、AtbZIP34 等轉錄因子的突變均影響下游基因及/或多個代謝通路的基因表達。然而，轉錄因子參與 花粉發育過程的研究剛起步，分析挖掘這些轉錄因子的功能將大大加快解析花粉發育及該 過程中的脅迫應答的分子機制的進程。
[0004] WRKY是植物轉錄因子超家族之一，其通過與順式作用元件特異結合而調控基因表 達。WRKY是最先在甘薯中發現的植物轉錄因子超家族，因其N端含有高度保守的氨基酸結 構域WRKYGQK而得名，其通過與順式作用元件W-box [ (T) (T) TGAC (C/T)]特異結合而調控基 因表達。根據WRKY結構域的數量以及鋅指結構的特征，WRKY家族大致分為3個亞家族，其 中WRKY II亞家族又細分為a~e共5個分支。
[0005] 經過近20年的研究，人們對WRKY在植物脅迫應答中發揮的作用有了較豐富的認 識，對于WRKY在植物脅迫響應中扮演重要角色已有較多報導，而WRKY參與發育的例子則相 當有限，目前僅在毛狀體、胚胎、種子發育中有所報道，另有研究表明WRKY還可能與花粉發 育相關：擬南芥WRKY34被證明在成熟花粉中特異表達，且負調控花粉低溫脅迫響應的信號 轉導過程。

【發明內容】

[0006] 本發明提出一種白菜WRKY31基因及其編碼的蛋白質。
[0007] 本發明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：
[0008] 一種白菜WRKY31基因，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，cDNA的核苷酸 序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009] 一種白菜WRKY31基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0010] 一種用于白菜WRKY31基因的cDNA全長克隆的PCR引物對，包括核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示的上游引物和如SEQ ID N0:5所示的下游引物。
[0011] 一種用于白菜WRKY31基因的DNA全長克隆的PCR引物對，包括核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示的上游引物和如SEQ ID N0:5所示的下游引物。
[0012] -種用于半定量RT-PCR分析白菜WRKY31基因的PCR引物對，包括核苷酸序列如 SEQ ID N0:7所示的上游引物和如SEQ ID N0:8所示的下游引物。
[0013] 本發明提供的白菜WRKY31基因及其編碼的蛋白質具有轉錄調控基因表達特性， 通過轉錄調節白菜花粉育性和抗逆性相關基因的表達，能夠提高植物的抗逆性，可用于分 子植物育種，在培育雄性不育植物材料，抗逆性新品種，提高植物對逆境的抗性中起到重要 的作用。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發明實施例二中的總RNA的變性凝膠電泳圖；
[0015] 圖2是本發明實施例四中的cDNA全長克隆的PCR擴增產物的電泳圖；
[0016] 圖3是本發明實施例六中的白菜和擬南芥中WRKY基因家族的進化樹分析；
[0017] 圖4是本發明實施例七中的白菜BrWRKY31基因的表達模式。
【具體實施方式】
[0018] 下面對照附圖并結合優選的實施方式對本發明作進一步說明。
[0019] 本發明提供一種白菜WRKY31基因，在一個【具體實施方式】中：所述白菜WRKY31基因 的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，該白 菜WRKY31基因命名為BrWRKY31。
[0020] 本發明還提供一種白菜WRKY31基因編碼的蛋白質，在一個【具體實施方式】中：所述 白菜WRKY31基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，命名為BrWRKY31。
[0021] 在下方各實施例中，物質若是固體，則物質的百分數表示質量百分數，物質若是液 體，則物質的百分數表示體積百分數；室溫指20_25°C。
[0022] 實施例一：基因組DNA的提取
[0023] 將白菜（白菜'Bcajh97_01B'可育株，當然也可以為白菜'Bcajh97_01A/ B'不育株）葉片鮮樣100~200mg，加液氮研磨至粉末，加入600 yL提取緩沖液 (200mmol ? L 'Tris-Cl，pH 7. 5 ;25mmol ? L :EDTA，pH8. 0 ;250mmol ? L 'NaCl ;0? 5% SDS)，混 勾，60°C水浴45min，每lOmin搖一次；4°C，12000rpm離心10min ;將上清轉移至新的1. 5mL 離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇（體積比為24:1)的溶劑，離心7min ;將上清轉移至 新的1. 5mL離心管中，加等體積預冷到4°C的異丙醇，混勾后室溫靜置10min，12000rpm離心 15min ;棄上清，加 lmL 70%乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min，棄上清，重復一次；室溫自 然干燥沉淀；加 20~30 y L的ddH20 (含0. lmol *L iRNase)使沉淀溶解。提取的DNA樣品 放置于_20°C保存，在實施例五的DNA全長克隆中作為模板使用。
[0024] 實施例二：總RNA的提取
[0025] 獲取白菜不育系（白菜'Bcajh97_01A/B'不育株，為雄配子減數分裂胞質分裂突 變體 the male meiotic cytokinesis, mmc)和可育株系（白菜 'Bcajh97_01B' 可育株，為 野生型）植株的花粉母細胞、減數分裂、四分體、單核小孢子和成熟花粉期等五個發育時期 的花蕾（花蕾根據縱徑大小分成5級，從I級到V級分別為：小于1mm、1. 2~1. 6mm、1. 8~ 2. 2mm、2. 4~2. 8mm和3. 0~3. 4mm，分別為花粉母細胞期、減數分裂期、四分體時期、單核 小孢子期以及成熟花粉期），以及可育株系的根、莖、葉、花序和授粉后3天的嫩角果共15 份材料，分別采用Trizol法抽提以上15份材料的總RNA。整個提取過程保持無RNase污 染：用于抽提RNA的離心管、槍頭均用0. 1%的DEPC-H20處理12h以上后高壓滅菌（120°C， 40min)處理；玻璃器皿180°C烘烤5h。材料的總RNA提取的過程具體如下：
[0026] 將50~100mg材料在液氮中研磨至粉末，轉入1. 5mL離心管。加入lmL的Trizol 充分搖勾，室溫放置5111；[11;加入0.211^氯仿，劇烈搖蕩158 ;120001'0;1；'，4<€，離心10111；[11;取上 清液，加入等體積的異丙醇，室溫放置l0min ;12000rCf，4°C，離心15min ;棄上清，RNA沉淀 加入111^75%的乙醇，混勻，4°(：，7500代6離心5111111;棄上清液，重復兩次 ；1?熟沉淀室溫干 燥5~10min后用0? 01 % DEPC水溶解；-75°C保存備用。
[0027] 用甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA的質量：總RNA樣品3~5 y L，加入上樣緩沖液， 70°C變性10min，冰上冷卻；配制1. 2%的甲醛變性凝膠（瓊脂糖0. 3g，加入DEPC-H20 20mL， 加熱融化，冷卻至60°C，補加2. 5mL的10XM0PS和2. 5mL甲醛，總體積25mL)，混勻，鋪膠； 3~5V/cm，電泳2h。用以上15份材料提取獲得的總RNA變性凝膠電泳圖片均如圖1所示。 總RNA樣品完整性較好，可用于其后的反轉錄實驗（實施例三中的cDNA的合成）和實施例 七中的基因時空表達模式分析，各樣品的純度較好，0D260/280值均在1. 9到2. 0之間，濃 度均達到lug. yL1以上。
[0028] 實施例三：cDNA的合成
[0029] 將實施例二中提取的各個總RNA分別稀釋至1 y g ? y L \分別獲取等量的總RNA， 用于cDNA的合成。cDNA的合成參照Clontech公司的SMART? PCR cDNA Synthesis Kit實 驗手冊。合成的cDNA采用NanoDrop分析儀進行濃度測定，0D260/280值均在1. 6到1. 8之 間，濃度均在500ng，yL1左右。
[0030] 實施例四：cDNA全長的克隆
[0031] 以擬南芥的登錄號At4g22070為關鍵詞搜索白菜基因組數據庫（www. brassica. info)，獲得其在白菜中的同源序列。根據該同源序列設計引物（上游引物PI (SEQ ID NO: 4) :5' -CACCATGirCCGGITTCCGGTGA-3' 和下游引物 P2(SEQ ID N0:5) :5' -CTATATAITGTCACC GTTGCTAGTAGC-3'），以從實施例三中用白菜'Bcajh97-01B'可育株系的花序提取的總RNA 反轉錄成的cDNA為模板進行同源克隆，其PCR體系為：cDNA模板0. 5 y L，10XPCR緩沖液 (buffer) A 2. 5 y L，上游引物 P1 (10 y mol ? L 丨）0? 5 y L，下游引物 P2 (10 y mol ? L 丨）0? 5 y L， lOmmol .L MNTPs 0? 5 y L，Taq 聚合酶（2U ? y L ^O. 5 y L，補充 ddH20 至總體積 25 y LJCR 程 序：94°C，預變性 3min ;94°C，變性 30s ;56°C，復性 30s ;72°C，延伸 30min，30 個循環；72°C， 再延伸7min;4°C保存。PCR產物經Axygene DNA凝膠回收試劑盒回收，連接pGEM-T Easy Vector，轉化大腸桿菌（Escherichia coli)DH5 a感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，抽提 質粒，酶切鑒定后，重組質粒送Invitrogen公司測序，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:2 所示。PCR擴增產物的電泳圖如圖2所示，其中，泳道1為PCR擴增產物，M表示DNA Maker。 該 Marker 為 Fermentas 公司的 GeneRuler lOObp DNA Ladder Plus (貨號為 SM0321)。
[0032] 實施例五：DNA全長的克隆
[0033] 以實施例一中的提取的DNA為模板，采用的引物為上游P3(SEQ ID NO:6) (5, -CAGCGATACTGTACGGATCCAAC-3'）和下游引物 P2:5' -CTATATAITGTCACCGITGCTAGTA GC-3'）。其PCR體系為：DNA模板0. 5 y L，引物濃度、以及其它試劑和濃度均與實施例四中 的cDNA全長克隆的設置相同。PCR程序中72°C延伸時間為2min，其它設置與實施例四中 的cDNA全長克隆的設置相同。PCR產物經Axygene DNA凝膠回收試劑盒回收，連接pGEM-T Easy Vector，轉化大腸桿菌（Escherichia coli)DH5a感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆， 抽提質粒，酶切鑒定后，重組質粒送Invitrogen公司測序，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0034] 實施例六：核酸序列分析
[0035] 用DNAStar軟件分析實施例五中基因的DNA的最大開放閱讀框，其最大開放閱讀 框長度為1617bp，包含6個外顯子和5個內含子，推導出氨基酸序列。利用NCBI生物信息 中心的 BLAST 服務（//blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)進行同源搜索。蛋白質 序列及結構特征分析通過蛋白質專家分析系統網站（//ca.expasy.org)進行。
[0036] 白菜WRKY31基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，該氨基酸序列 由538個殘基組成，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白質命名為BrWRKY31，蛋白質分子量為 58. 60kDa，等電點（isoelectric point, pi)為5. 64。通過對BrWRKY31的結構域進行分析， 自氨基端開始：第1-13位氨基酸殘基為線粒體定位信號肽，第26-42位氨基酸殘基為細胞 核定位信號肽，第26-42位氨基酸殘基為細胞核定位信號肽，第106-139位氨基酸殘基為亮 氨酸拉鏈，第282-296位氨基酸殘基為保守的A基序，第297-357位氨基酸殘基為DNA結合 域，第303-309位氨基酸殘基為WRKY結構域。
[0037] 將BrWRKY31 蛋白質與擬南芥 WRKY 的 lib 家族（包括AtWRKY6，AtWRKY9，AtWRKY31， AtWRKY36, AtWRKY42, AtWRKY47, AtWRKY61 和 AtWRKY74)比較，聯配分析采用 CLUSTALW 2. 0. 12進行分析，其中保守部分用*表示，WRKY結構域用虛線方框標出，鋅指結構用實線方 框標出。如下表1所示，氨基酸序列的同源性比對結果顯示，BrWRKY31與擬南芥WRKY31的 氨基酸序列的同源性為90%。
[0038] 表1 :氨基酸序列的同源性比對結果：
[0039]


[0042] 如圖3所示為白菜和擬南芥中WRKY基因家族的進化樹分析，其中BrWRKY31屬于 WRKY基因家族的lib亞家族。
[0043] 實施例七：基因時空表達模式分析
[0044] 采用半定量RT-PCR分析白菜BrWRKY31基因的表達模式。
[0045] 分別以實施例二中提取的各個植物組織的總RNA為原料，采用 ThermoScript Reverse Transcriptase(Invitrogen, USA)試齊丨J 盒合成用于半定 量RT-PCR分析的cDNA。用于半定量RT-PCR分析白菜BrWRKY31基因的上游引物 為 P4(SEQ ID N0:7) (5, -GCTGCAACTTCTTCGATG-3'）和下游引物為 P5(SEQ ID N0:8) (5' -CTATATAITGTCACCGTTGCTAG-3'）。PCR 體系：cDNA 模板 0? 5 y L，10XPCR 緩沖液 (buffer) A 2. 5 y L，上游引物 P4 (10 y mol ? L 丨）0? 5 y L，下游引物 P5 (10 y mol ? L 丨）0? 5 y L， lOmmol ? L MNTPs 0? 5 y L，Taq 聚合酶（2U ? y L ^O. 5 y L，補充 ddH20 至總體積 25 y L。 PCR 程序：94°C，預變性 3min ;94°C，變性 30s ;56°C，復性 30s ;72°C，延伸 30min，30 個循環； 72°C，再延伸7min ;4°C保存。PCR產物經Axygene DNA凝膠回收試劑盒回收，連接pGEM-T Easy Vector，轉化大腸桿菌（E.coli)DH5 a感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，抽提質粒， 酶切鑒定后，重組質粒送Invitrogene公司測序。
[0046] 取各組織均有且穩定表達的BrUBCIO作為半定量RT-PCR分析的內參基因，其擴增 引物為上游引物 P6(SEQ ID N0:9) (5' -GGGTCCTACAGACAGTCCTTAC-3'）和下游引物 P7(SEQ ID N0:10) (5' -ATGGAACACCTTCGTCCTAAA-3'）。
[0047] 以內參基因BrUBCIO作為參照，使用半定量RT-PCR法同時檢測以上15份材料的 BrWRKY31基因的表達水平，如圖4所示，圖中ml~m5分別表示不育系植株的花粉母細胞、 減數分裂、四分體、單核小孢子和成熟花粉期的花蕾，wl~w5分別表不可育系植株的花粉 母細胞、減數分裂、四分體、單核小孢子和成熟花粉期的花蕾，R〇、St、Le、F1和Si分別為可 育系的根、莖、葉、花序和授粉后3天的嫩角果，從圖中可以看出，BrWRKY31基因在可育株花 粉的單核小孢子和成熟花粉期的花蕾中特異表達，在不育株各個時期的花蕾中均不表達。 [0048] 以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的技術人員來說，在不脫 離本發明構思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應 當視為屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種白菜WRKY31基因，其特征在于：所述白菜WRKY31基因的DNA的核苷酸序列如 SEQ ID N0:1所示，cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。2. -種白菜WRKY31基因編碼的蛋白質，其特征在于：所述白菜WRKY31基因編碼的蛋 白質的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。3. -種用于白菜WRKY31基因的cDNA全長克隆的PCR引物對，其特征在于：包括核苷 酸序列如SEQ ID N0:4所示的上游引物和如SEQ ID N0:5所示的下游引物。4. 一種用于白菜WRKY31基因的DNA全長克隆的PCR引物對，其特征在于：包括核苷酸 序列如SEQ ID N0:6所示的上游引物和如SEQ ID N0:5所示的下游引物。5. -種用于半定量RT-PCR分析白菜WRKY31基因的PCR引物對，其特征在于：包括核 苷酸序列如SEQ ID N0:7所示的上游引物和如SEQ ID N0:8所示的下游引物。
【文檔編號】C12N15/10GK106032535SQ201510109093
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月12日
【發明人】蔣晶晶, 曹家樹, 黃鸝, 繆穎, 于為常, 張建華
【申請人】香港中文大學深圳研究院