microRNA-342-3p和microRNA-210及其抑制劑的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域，更具體地，本發明涉及小分子RNA-microRNA-342-3p 和miR-210及其抑制劑在制備類風濕性關節炎疾病的治療藥物和診斷試劑中的用途。
【背景技術】
[0002] 在人和動物組織中，長期進化使得機體的各種細胞形成了精細復雜的低氧適應機 制，絕大多數健康組織內氧濃度維持在2. 5%~9%之間。而在一些病理狀態下，如呼吸系 統或心血管系統疾病引起的低氧血癥，敗血癥、自身免疫疾病和腫瘤等疾病中都存在著全 身性或局部組織的低氧狀態1% 〇2)。這種長期或不可逆轉的低氧狀態會導致機體的 組織細胞、血管內皮細胞和免疫細胞的低氧適應出現失代償現象，進而引起多種炎性因子 和細胞因子產生異常，細胞生物學行為出現異常，最終導致機體免疫系統的動態平衡出現 異常，疾病經久不愈。類風濕性關節炎（RA)因炎癥使受累關節腔內的氧濃度大大降低，從 而促進了關節腔內血管翳形成，關節軟骨基質降解，炎性細胞釋放炎性因子，促進了炎癥的 進一步發展。因此，研究低氧對免疫細胞生物學功能的調控和免疫細胞的低氧適應機制，對 找到受低氧控制的關鍵信號分子，開發類風濕性關節炎的診斷試劑和治療新藥具有潛在的 臨床應用價值。
[0003] 樹突狀細胞（Dendritic cells, DCs)是機體連接天然免疫和適應性免疫的橋梁， DCs是目前已知的功能最強的抗原提呈細胞，能夠刺激初始T細胞（naive T cells)的活 化和增殖，從而啟動和調控特異性免疫應答。不同DC亞群、不同分化發育階段的DC、在不 同PAMP刺激下，對后天免疫應答的類型和強度都具有不同的調控作用，而DC的功能狀態受 到其所處微環境的影響，而微環境中產生的一些內源性炎性因子如C5a能促進DC的成熟活 化，并促進成熟DC誘導Thl或Th2細胞的分化。目前很多證據表明，在類風濕性關節炎、 慢性炎性腸病，以及系統性紅斑狼瘡等疾病中，存在Thl和Th7的生成活躍而調節性T細 胞生成減少的失衡。近年來研究發現，DCs參與許多具有局部低氧特征疾病的發展過程，如 腫瘤的局部低氧條件可能參與誘導大量的耐受性DCs，與機體對腫瘤的免疫耐受機制有關； 動脈硬化斑塊、類風濕關節炎局部聚集DCs的活性及功能變化影響疾病的發展和預后。這 些研究現象提示，DCs具有氧感受及適應機制，這種氧感受與適應可能影響DCs的生物學行 為，進而影響免疫應答的產生和類型。因此，對DCs的低氧適應機制的研究有助于臨床低氧 相關疾病的治療以及高效DCs疫苗的制備研究。
[0004] 補體系統是機體固有免疫抵抗病原微生物的重要組成部分，廣泛參與多種急慢性 炎癥性疾病，如自身免疫性疾病、敗血癥、急性肺損傷、缺血再灌注損傷和哮喘等。補體活化 不僅能直接發揮溶解細胞、細菌、病毒的作用，還能夠產生一系列活性片段，發揮調理吞噬 作用、清除凋亡細胞、趨化免疫細胞并參與調節多種免疫細胞的效應功能，從而維持免疫自 身穩態。補體活化產物過敏毒素 C5a具有強大的生物活性，是重要的炎癥介質，對炎性細胞 如中性粒細胞、單核細胞和T淋巴細胞等有強趨化活性，能夠活化巨噬細胞并促進其溶菌 酶和超氧離子的釋放，從而參與天然免疫的調控或促進組織損傷。研究發現，C5a是通過與 其受體C5aRl (⑶88)和C5L2結合而發揮生物學效應的，C5aRl屬于G蛋白偶聯受體超家族 成員，在多種免疫細胞表面都有廣泛表達，是介導C5a的主要受體。有研究指出，在敗血癥 發病初期C5a的過度活化會導致炎癥介質的進一步釋放，導致組織損傷，疾病的進一步惡 化。作為低氧相關疾病，類風濕性關節炎也是一種已知的C5相關疾病，RA病人血清和關節 液中的C5a水平明顯升高，C5缺陷的小鼠其CIA誘導率和疾病嚴重程度明顯低于野生型小 鼠，說明C5a/C5aR參與RA的病理損傷機制。因此對C5a/C5aR信號通路調控的研究對炎性 疾病的預防和治療有著重要的科學意義。
[0005] 綜上，本領域尚需基于類風濕性關節炎疾病的發病機理機制，找到對于治療或診 斷類風濕性關節炎相關疾病有效的藥物。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供microRNA-342-3p和microRNA-210及其抑制劑的用途。
[0007] 在本發明的第一方面，提供一種miR-342-3p下調劑或miR-210下調劑在制備治療 類風濕性關節炎疾病的藥物中的用途。
[0008] 在一個優選例中，所述的下調劑包括：抑制劑、阻滯劑、拮抗劑等。例如，所述的下 調劑是攜帶可結合miR的海綿體病毒載體。
[0009] 在另一優選例中，所述的miR-342-3p的下調劑的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示 或其經修飾后的產物；較佳地，其修飾產物是在SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的基礎上，對 骨架部分磷酸基團進行硫代修飾、2'核酸進行甲氧基修飾以及3'端偶聯膽固醇。
[0010] 在另一優選例中，所述的miR-210的下調劑的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示或 或其經修飾產物；較佳地，其修飾產物是在SEQ ID N0:8所示核苷酸序列的基礎上，對骨架 部分磷酸基團進行硫代修飾、2'核酸進行甲氧基修飾以及3'端偶聯膽固醇。
[0011] 在另一優選例中，所述的藥物還用于治療具有低氧病理特征的疾病：
[0012] 在組織低氧微環境下阻斷細胞表面C5aRl的表達；或
[0013] 在組織低氧微環境下促進STAT5和/或STAT6的表達和/或磷酸化；或
[0014] 在組織低氧微環境提高USP13的表達；或
[0015] 在組織低氧微環境降低PTPN1的表達。
[0016] 在本發明的另一方面，提供miR-342-3p或miR-210的用途，用于作為診斷或預后 類風濕性關節炎疾病的標志物；或用于制備診斷類風濕性關節炎疾病的試劑。
[0017] 在一個優選例中，所述的診斷或預后類風濕性關節炎疾病包括：檢測受試者的 miR-342-3p或miR-210表達水平，表達水平越高，則表示類風濕性關節炎疾病的患病程度 越嚴重。
[0018] 在另一優選例中，所述的診斷或預后類風濕性關節炎疾病的試劑是特異性識別或 擴增miR-342-3p或miR-210的試劑（例如探針或引物）。
[0019] 在本發明的另一方面，提供一種特異性識別或擴增miR-342-3p或miR-210的試劑 在制備用于診斷或預后類風濕性關節炎疾病的試劑盒中的用途。
[0020] 在一個優選例中，所述的特異性擴增miR-342-3p的試劑是核苷酸序列如SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 的引物；或
[0021] 所述的特異性擴增miR-210的試劑是核苷酸序列如SEQ ID N0:20和SEQ ID N0:21 的引物。
[0022] 在本發明的另一方面，提供一種篩選治療類風濕性關節炎疾病的潛在物質的方 法，所述方法包括：
[0023] (1)將候選物質與包含miR-342_3p和/或miR-210的體系接觸，所述的體系是細 胞培養物體系；和
[0024] (2)篩選出顯著下調（如顯著下調20%以上，較佳的下調50%以上；更佳的下調 80%以上）miR-342-3p和/或miR-210表達的物質，所述物質是治療類風濕性關節炎疾病 的潛在物質。
[0025] 在另一優選例中，步驟（1)包括：向包含miR-342-3p和/或miR-210的體系中添 加候選物質；和
[0026] 步驟（2)包括：檢測miR-342_3p和/或miR-210的表達情況，并與對照組比較，其 中所述的對照組是不添加所述候選物質的、表達miR-342-3p和/或miR-210的體系；
[0027] 若候選物質在統計學上下調miR-342_3p和/或miR-210的表達，則該候選物質是 治療類風濕關節炎的潛在物質。
[0028] 在一個優選例中，所述的體系選自（但不限于）：細胞體系（或細胞培養物體系）、 亞細胞體系、溶液體系、動物體系或組織體系。
[0029] 在另一優選例中，所述的候選物質選自（但不限于）：針對miR-342_3p和/或 miR-210設計的干擾分子、核酸抑制物、結合分子（如抗體或配體）、小分子化合物。
[0030] 在另一優選例中，所述的方法還包括：對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗 和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對于治療類風濕性關節炎疾病有用的 物質。
[0031] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0032] 圖1、低氧條件單核來源樹突狀細胞高表達C5aRl并對C5a及其內源性衍生物-去 除精氨酸的C5a(C5a desfcg)具有高反應性。
[0033] (a) GM-CSF和IL-4刺激的單核細胞分別培養在不同氧濃度條件下，包括全程的常 氧（21%)，全程的低氧（分別為9,5,2%)，或者序貫性低氧（9%、3天，5%、2天，2%、1天， 和1 %、1天），7天后檢測常氧和低氧條件下單核來源樹突狀細胞表達C5aRl。
[0034] (b)C5a及其衍生物05_；3_介導常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細胞的 趨化活性。以趨化指數表示：有C5a或C5_stog#在條件下進入到下室的單核來源樹突狀細 胞數/無 C5a或C5_stog存在條件下進入到下室的單核來源樹突狀細胞數（自由擴散）。
[0035] (c)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細胞 表達共刺激分子-⑶86和HLA-DR的水平。
[0036] (d)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細胞 分泌炎性因子的水平。
[0037] (e)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細胞 誘導同種CD4+T細胞增殖的水平。CD4+T細胞預先用CFSE標記，與樹突狀細胞共孵育5天 后，檢測CFSE的稀釋情況。
[0038] (f)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細胞 誘導同種CD4+T細胞活化的水平。
[0039] (g)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細胞 誘導同種⑶4+T細胞分化為分泌IFNY和IL-17的水平。
[0040] (h) C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2 % )條件下單核來源樹突狀細胞 誘導同種CD4+T細胞分化為調節性T細胞的水平。
[0041] 圖2、低氧上調單核來源樹突狀細胞表達miR-210和miR-342-3p。
[0042] 常氧（N)和低氧（H，2% 02，以下實驗均采用2% 02)條件下人單核細胞在GM-CSF 和IL-4誘導MoDC分化過程中miR-210 (a)和miR-342-3p (b)的表達。
[0043] 圖 3、低氧上調的 miR-210 和 miR-342-3p 促進 MoDC 表達 C5aRl。
[0044] 在常氧條件下對單核細胞轉染miR-210或miR-342_3p的模擬物（mimic)及其陰 性對照（a)、在低氧條件下轉染miR-210或miR-342-3p的抑制劑（inhibitor)及其陰性對 照（b)，48h后在培養基中加入GM-CSF和IL-4誘導其分化，誘導96h后檢測細胞表面C5aRl 表達的變化。
[0045] 圖4、miR-210和miR-342-3p在膠原誘導的實驗性關節炎模型（CIA)中的表達。
[0046] 在II型膠原誘導的DBA/1小鼠關節炎模型（CIA)，發病不同時間血清miR-210 (a) 和miR-342-3p(b)的表達。Ctrl:對照（未誘導CIA)。
[0047] 圖5、miR-210和miR-342-3p模擬物及抑制物對CIA進展的影響。
[0048] 對II型膠原誘導的DBA/1小鼠關節炎模型分別進行尾靜脈注射單獨miR-210 或miR-342-3p的措抗劑（antagomir)或二者聯合或者措抗劑的陰性對照（NC)，每周給藥 一次，于第三周開始每2-3天觀察其關節炎發病情況，包括關節炎的發生率（a)、臨床評分 (b)、各組代表性受累關節的炎癥腫脹程度（c)、關節軟骨受損情況（d)和病理（e)。
[0049] 圖6、低氧抑制GM-CSF和IL-4觸發的STAT5和STAT6活化誘導的單核來源樹突狀 細胞在分化過程中的C5aRl的下調。
[0050] (a)單核細胞分別在常氧和低氧條件（2 % )下，在有和無 GM-CSF、IL-4或二者聯 合存在情況下，培養7天后C5aRl的表達。
[0051] (b)單核細胞在轉染干擾RNA(陰性對照、STAT5或STAT6)后，在GM-CSF+IL-4存 在情況下，培養4天后C5aRl的表達。
[0052] (c)單核細胞分別預先在常氧和低氧條件（2 % )下36小時，然后在加入 GM-CSF+IL-4、8小時前后STAT5和STAT6的表達。
[0053] (d)單核細胞分別預先在常氧和低氧條件（2 % )下36小時，然后在加入 GM-CSF+IL-4、不同時間前后STAT5和STAT6磷酸化的水平。
[0054] 圖 7、miR-342-3p 和 miR-210 抑制 STAT5 和 STAT6 信號途徑。
[0055] (a)在常氧條件下對單核細胞轉染miR-342_3p的模擬物及其陰性對照、在低氧條 件下轉染miR-342-3p的抑制劑及其陰性對照，