金納米復合靶向給藥系統制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種金納米復合靶向給藥系統的制備方法，屬于納米生物醫學領域。
【背景技術】
[0002]癌癥是目前死亡率較高的一種疾病，受到了人們的廣泛關注。傳統的癌癥治療方法包括:化療、放療和熱療，這些方法具有一定的療效然而在殺死癌細胞的同時可能也殺死了正常免疫細胞，使得人體免疫力降低。光熱療法屬于一種物理療法，其基本原理在于:通過外源性的革E向腫瘤組織光熱劑后，用激光福射，使光熱劑光熱轉換產生產生高熱量，破壞消除腫瘤細胞。在眾多可用于光熱療法的材料中，貴金屬納米材料，如納米金的局域表面等離子體振蕩(LSPR)特性，使得其具有很強的消光特性，可以在光熱轉換領域大有作為。
[0003]金納米棒(Gold nanorods ,GNRs)是一種尺度從幾納米到上百納米的棒狀金納米顆粒。GNRs具有隨長寬比變化，從可見(550nm)到近紅外(1550nm)連續可調的表面等離子體共振波長，因此可以吸收連續波激光器發射出的近紅外低能輻射，使得GNRs內部產生電子躍迀形成不穩定的電子-空穴對，當電子-空穴對重排恢復至穩定狀態時就會產生雙光子焚光和大量的熱。由此產生的熱量能起到對癌癥細胞的加熱作用，從而達到破壞癌細胞的目的。由于金納米棒自身擁有的獨特的光學、光電、光熱以及生物學性質，目前在光熱治療方面受到了極大的關注。
[0004]目前金納米棒在使用中主要存在兩個問題。一是其表面活性劑的毒性;二是金棒在高熱條件下的穩定性。由于金棒制備過程中廣泛采用種子誘導生長法，通過使用高濃度的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為表面活性劑及穩定劑，通過調整CTAB的濃度可以制備出不同長徑比的金納米棒。CTAB雖然可以增強金棒的水溶性以及分散性，但其卻大大增加了其生物毒性。由于介孔二氧化娃(Mesoporous silica,mSi02)生物相容性好、比表面積大、孔徑和孔容可以調節且孔道均勻、表面易于修飾等優點，在催化、傳感器、分離、生物醫藥等方面具有廣泛的應用前景。在CTAB-coated GNRs表面修飾mSi02(GNRs@mSi02)有望解決上述單純使用GNRs進行腫瘤治療的不足，既可以降低GNRs的生物毒性。又可以利用mSi02孔道載藥實現化療-熱療的聯合治療。
[0005]HA是由雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高級多糖類，廣泛分布在軟結締組織細胞外基質中。具有良好的生物相容性，生物降解性和隱形性，是一種理想的生物醫用高分子材料，具有較好的受體介導等生物活性和隱形性，能與CD44受體特異性結合，將藥物主動靶向腫瘤細胞;RGD是許多細胞表面某些整合素分子特異性配體之一。具有優異的生物活性且能與血管整合素受體ανβ3特異結合，將藥物主動靶向腫瘤細胞和腫瘤血管。二者合用能更有效地增強藥物與腫瘤細胞的結合，提高在腫瘤部位的有效濃度，增效減毒，同時殺死腫瘤細胞和抑制腫瘤新生血管的生長，發揮“一藥多效”的作用，能有效逆轉腫瘤耐藥性。
[0006]美法侖(melphalan，MEL)，又叫L-苯丙氨酸氮芥，是氮芥的苯丙氨酸衍生物。氮芥類抗腫瘤藥物是一種周期非特異的烷化劑類腫瘤藥物。美法侖分子結構上的氯乙烯可通過烷化與DNA上鳥嘌吟和胞嘧啶的堿基發生氨基化，造成DNA鏈內，鏈間的交聯或DNA與蛋白質之間的交聯從而抑制DNA的合成，阻止細胞分裂，進而達到殺死腫瘤細胞的作用。但美法侖仍存在溶解性差、細胞選擇性差、半衰期短、不良反應大和易產生耐藥性等缺點。因此，為了降低美法侖對人體的正常細胞組織造成毒副作用，使用藥物載體對美法侖進行負載，控制其釋放是十分必要的。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于克服現有技術中介孔二氧化硅包覆金納米載體載藥靶向性不好的問題，提供一種新型的靶向方案，介孔二氧化硅包覆的金納米粒實現了光熱治療和化療的協同治療，能夠有效靶向至腫瘤部位，在癌細胞內快速積累，應用于治療腫瘤中。
[0008]為達到上述目的，采用技術方案如下:
[0009 ]金納米復合靶向給藥系統的制備方法，包括以下步驟:
[0010]I)金納米粒種子溶液的制備:將十六烷基溴化銨溶液和氯金酸溶液加入硼氫化鈉水溶液，在20-30 0C下混合均勻，靜置2_3h，得到金納米粒種子溶液；
[0011]2)金納米棒的制備:向十六烷基溴化銨溶液中依次加入氯金酸溶液、硝酸銀溶液混合均勻，再依次加入抗壞血酸溶液、上述金納米粒種子溶液，20-30 °C下混合均勻，靜置12-24h，離心得金納米棒；
[0012]3)介孔二氧化硅包覆金納棒:在20-40 °C下向金納米棒水溶液中加入體積分數20 %的正硅酸乙酯的甲醇溶液，隔30min加入一次，3_5次加完，調節pH10-l I，攪拌12_48h，離心洗滌，得到介孔二氧化硅納米材料；
[0013]將介孔二氧化硅納米材料分散于有機溶劑中，加入3-氨丙基三乙基硅烷，在惰性氣體保護下升溫至60-100°C加熱回流12-24h，洗滌，干燥得氨基化的介孔二氧化硅包覆金納棒(GNRsOmS12);
[0014]4)GNRs@mSi02—MEL的制備:將所述氨基化的GNRsOmS12溶于乙醇，然后加入美法侖的二氯亞砜溶液，在10-400C下攪拌24-48h，離心洗滌，干燥得氨基化的GNRsOmS12--MEL ；
[0015]5)GNRs@mSi02-HA-RGD-MEL的制備:向透明質酸(HA)水溶液中，加入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，然后依次加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺進行活化，調節溶液的PH4-6，在10-40°C下，反應24-48h，透析并冷凍干燥即得白色絮狀物HA-R⑶；
[0016]向HA-R⑶水溶液中，加入所述氨基化的GNRsOmS12-MEL混合均勻，然后依次加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺進行活化，調節溶液的pH4-6，在10-40°C下反應24-48h，透析、冷凍干燥、得到金納米復合靶向系統，S卩GNRsOmS12-HA-RGD-MEL0
[0017]按上述方案，步驟I)中十六烷基溴化銨溶液:氯金酸溶液:硼氫化鈉溶液的摩爾比為1:(0.0025-0.005):(0.006-0.I)。
[0018]按上述方案，步驟2)中氯金酸溶液:硝酸銀溶液:抗壞血酸溶液的摩爾比為1:(0.04-0.2):(1.6-2)ο
[0019]按上述方案，步驟3)中有機溶劑為甲苯、乙醇或異丙醇。
[0020]按上述方案，步驟5)在兩次進行活化時，N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺的摩爾比均為1: (1_3)。
[0021 ]相對于現有技術，本發明有益效果如下:
[0022]本發明將具有光熱治療作用的金納米粒與抗癌藥物美法侖有效結合，實現了腫瘤熱療-化療聯合治療，提高治療效果;利用介孔二氧化硅孔道高效負載藥物，可以提高載藥量。
[0023]CD44是一種高效內吞HA受體，本發明給藥系統中的HA可特異識別受體并與之結合;整合素ανβ3是一種高效內吞RGD肽受體，本發明給藥系統中的RGD巰基肽可特異識別受體并與之結合，HA/R⑶雙受體使藥物高效主動靶向腫瘤細胞。
[0024]本發明相對于現有技術中的靶向方式具有更好的靶向效果，本發明兼具靶向、化療與熱療等多重功能。
【附圖說明】
[0025]圖1:實施例1中GNRs和GNRsOmS12紫外光譜圖；
[0026]圖2:實施例1中GNRsOmS12透射電鏡圖；
[0027]圖3:實施例1中GNRsOmS12紅外光譜圖；
[0028]圖4:實施例1中氨基化后的GNRsOmS12紅外光譜圖。
【具體實施方式】
[0029]以下實施例進一步闡釋本發明的技術方案，但不作為對本發明保護范圍的限制。
[0030]實施例1
[0031]I)金納米粒種子的制備
[0032]將5ml，0.2M的十六烷基溴化銨溶液和5ml，0.0005M氯金酸溶液混合，快速攪拌一次性加到0.6ml，0.0lOM的硼氫化鈉溶液中，劇烈攪拌2min，20°C下靜置2h得到金納米粒子種子溶液。
[0033]2)金納米棒的制備
[0034]在5ml，0.2M的十六烷基溴化銨溶液中依次加入5.0ml，0.00IM的氯金酸溶液、0.15ml,0.0040M硝酸銀溶液混合后，加入80μ1，0.1M抗壞血酸溶液，隨后加入10μ1種子溶液混合均勻后，在20 °C下，靜置12h，離心洗滌一次即獲得金納米棒GNRs;
[0035]3)介孔二氧化硅包覆金納棒的制備
[0036]取1ml金納米棒溶液，用氫氧化鈉溶液調節pH至10，然后每半小時加入30μ1體積分數20 %的TEOS/甲醇溶液(共三次)，在20 °C下攪拌12h，然后用去離子水和甲醇離心洗滌，即得到介孔二氧化娃包覆金納米棒(GNRs@mSi02)的納米材料；
[0037]將20mg介孔二氧化娃納米材料分散在30ml無水甲苯中，再加入80μ1的3_氨丙基三乙基硅烷，在氮氣保護下攪拌混勻，升溫至60°C，加熱回流12h。然后用甲苯離心洗滌三次，60 °C下真空干燥箱干燥24h，即得氨基化的GNRsOmS12。
[0038]4)GNRs@mSi02-MEL 的制備
[0039]向20ml，lmg/ml氨基化的GNRs@mSi02甲醇溶液中，加入1ml的100yg/ml美法侖的二氯亞砜溶液，10°C下攪拌24h，用去離子水離心洗滌二次，即得GNRsOmS12-MEL。[0040 ] 5) GNRsimS i O2-HA-RGD-MEL 的制備
[0041 ] 取50mg透明質酸溶于5ml的水中，依次加入5mg的EDC，5mg的NHS，調節pH4，活化2h后加入10mg的RGD，在10°C在攪拌反應24h，透析三天，冷凍干燥即得HA-RGD。
[0042]向50mgHA-RGD水溶液中加入50mg氨基化后的GNRsOmS12-MEL，然后依次加入
IOmgEDC和I OmgNHS的條件下，調節pH至4，在1 °C下攪拌24h，透析三天，冷凍干燥即得GNRsOHiS12-HA-R ⑶-MEL。
[0043]圖1所示紫外圖譜表明，GNRs被HiS12包裹后，GNRsOmS12的縱向等離子共振峰紅移了20nm，吸收強度基本沒發生變化，說明GNRsOmS12吸收近紅外能力不受mSi02包裹的影響，從而不影響其發熱效果。橫向等離子共振峰沒有發生位移，仍保持在515nm左右處。
[0044]圖2所示GNRsOmS12透射電鏡圖表明，GNRs被約20nm厚度的mSi02均勻、完整包覆，納米粒呈現橢圓形狀，粒徑非常均一。
[0045]圖3所示的GNRsOmS12紅外圖與圖4所示氨基化后的GNRsOmS12紅外圖譜對比可以看出，圖4在1561cm-l處出現了N-H的振動峰，說明GNRs@mSi02表面氨基化成功。
[0046]實施例2
[0047]I)金納米粒種子溶液的制備
[0048]將5ml，0.1M的十六烷基溴化銨溶液和1ml，0.00IM氯金酸溶液混合，快速攪拌一次性加到11111，0.0101的硼氫化鈉溶液中，劇烈攪拌21^11，30°(:下靜置2.511，即得金納米粒子種子溶液。
[0049]2)金納米棒的制備
[0050]向5m I，0.1M的十六烷基溴化銨溶液中依次加入5.0 m I，0.0IM的氯金酸溶液、
0.05ml，0.0lOM硝酸銀溶液混合后，加入ΙΟΟμΙ，0.1M抗壞血酸溶液，隨后加入12μ1種子溶液后，在30°C下，靜置24h，離心一次即得金納米棒；
[0051]3)介孔二氧化硅包覆金納棒的制備
[0052]取1ml金納米棒溶液，加入ΙΟΟμΙ，0.1M的氫氧化鈉溶液，攪拌混合，然后每半小時加入20μ1體積分數20%的TEOS/甲醇溶液(共四次)，在40°C下攪拌48h即得，然后用去離子水和乙醇離心洗滌，得